来源：Multidimensional engineering of Saccharomyces cerevisiae for the efficient production of heme by exploring the cytotoxicity and tolerance of heme（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
血红素在生物体中扮演不可替代的角色，在医疗保健和人工食品领域应用前景广阔。然而，血红素的细胞毒性严重制约了微生物合成效率，其毒性机制尚不明确。本研究通过代谢工程强化酿酒酵母中血红素合成，系统评估了血红素毒性对细胞生长和代谢的影响，并利用5轮实验室进化将血红素产量提升7.3倍。基于转录组学分析筛选出32个候选基因，组合过表达5个基因（SPS22、REE1、PHO84、HEM4和CLB2）后，最终工程菌株R5-M在补料分批发酵中实现380.5 mg/L的血红素产量，为迄今酿酒酵母中报道的最高水平。
研究背景
血红素作为卟啉衍生物，广泛参与细胞呼吸、细胞分化、信号转导、气体感知、活性氧分解及细胞色素P450酶氧化反应等多样生物学过程。目前血红素已被用于治疗急性间歇性卟啉病和缺铁症，并作为人造肉肉味的关键成分受到食品工业高度关注。此外，血红素还是胆绿素和藻蓝蛋白合成的前体，后者在免疫诊断和光动力治疗中具有应用价值。
当前从动物血液中提取血红素的方法产率低、不环保，且受生物安全考量和宗教习俗限制。鉴于血红素在微生物中广泛分布，利用工程微生物生产血红素被认为是替代动物提取的最有前景的方案。然而，血红素稳态破坏引发的细胞毒性严重限制了微生物合成效率，其毒性机制尚未完全阐明。本研究旨在通过多维工程化策略，探索血红素毒性机制并提升酿酒酵母的血红素耐受性和生产效率。
研究方法
2.1 培养基与培养条件
大肠杆菌DH5α在添加100 mg/mL氨苄青霉素的Luria–Bertani（LB）肉汤中于37°C恒温振荡培养，用于质粒扩增。所有酵母菌株在30°C、220 rpm振荡条件下培养。酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基由20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨和10 g/L酵母提取物组成。添加20 mg/L FeSO₄·7H₂O的YPD培养基（YPD-Fe20）用于摇瓶培养血红素生产。SD-Leu（含2% D-葡萄糖、不含亮氨酸的合成完全缺陷培养基）用于筛选携带Cas9蛋白表达质粒的酵母菌株。SD-Leu-Ura（含2% D-葡萄糖、不含亮氨酸和尿嘧啶的合成完全缺陷培养基）用于筛选同时携带Cas9蛋白表达质粒和引导RNA（gRNA）质粒的酵母菌株。SD-Leu-FoA（含1 mg/mL 5-氟乳清酸的SD-Leu培养基）用于从工程酵母中去除gRNA表达质粒。Leu和Leu-Ura缺陷培养基购自FunGenome（中国北京）。
【数据】大肠杆菌培养温度：37°C；酵母培养温度：30°C；振荡转速：220 rpm；YPD成分：20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物；FeSO₄·7H₂O浓度：20 mg/L；SD-Leu含2% D-葡萄糖；SD-Leu-FoA含1 mg/mL 5-氟乳清酸
2.2 质粒构建
本研究所用质粒列于补充表2，用于构建质粒的引物列于补充表3。为构建基因表达盒，首先制备了两个空载体（pUC20和pZT110）。靶向不同基因组位点的gRNA质粒通过CRISPRdirect（http://crispr.dbcls.jp/）设计，并使用PCR和In-fusion克隆方法构建。
【数据】空载体：pUC20、pZT110；gRNA设计工具：CRISPRdirect；克隆方法：PCR和In-fusion克隆
2.3 酵母菌株构建
本研究所用酵母菌株列于补充表1。每个菌株的构建过程中，将扩增的上游同源臂、下游同源臂、与同源臂具有不少于500 bp重叠的盒以及gRNA质粒共同转化至酿酒酵母中，使用Frozen-EZ Yeast Transformation Ⅱ™试剂盒（ZYMO RESEARCH，美国），并涂布于SD-Leu-Ura固体培养基。转化子直接使用KOD-ONE（TOYOBO，日本）进行菌落PCR验证。为实现连续基因编辑，工程菌株在SD-Leu-5 FoA平板上交叉划线以去除gRNA质粒。
【数据】同源臂重叠长度：≥500 bp；转化试剂盒：Frozen-EZ Yeast Transformation Ⅱ™（ZYMO RESEARCH）；PCR酶：KOD-ONE（TOYOBO）；筛选培养基：SD-Leu-Ura固体培养基；质粒去除：SD-Leu-5 FoA平板划线
2.4 CARM构建
用于CARM构建的质粒和引物分别见补充表2和补充表3。为构建随机gRNA文库盒，以pSCM为模板，使用常规正向引物gRNA-L-F和含有20个连续简并碱基的反向引物池gRNA-L-R进行扩增。此外，用pSCM-F和pSCM-R扩增pSCM以产生用于装载随机gRNA文库盒的质粒骨架。最后，随机gRNA文库盒和质粒骨架与pTCL（Cas9蛋白表达质粒）在酵母细胞中环化。
【数据】简并碱基数：20个连续简并碱基；模板：pSCM；Cas9蛋白表达质粒：pTCL
2.5 高效血红素生产菌株的筛选
首先，将适量gRNA文库盒和质粒骨架导入H11感受态细胞，随后涂布于SD-Leu-Ura琼脂培养基。转化子在30°C孵育48小时。然后将颜色较深红的菌落接种于含0.5 mL YPD培养基的96深孔板中，在30°C培养96小时，以预筛选具有较高血红素产量的进化菌株。将20株筛选出的菌株在50 mL YPD中于30°C摇床培养96小时，以复筛血红素产量最高的进化菌株。收集各菌株细胞分析血红素产量，将血红素产量最高的进化菌株用于下一轮迭代进化。
【数据】初筛培养：96深孔板、0.5 mL YPD、30°C、96h；复筛培养：50 mL YPD、30°C、96h；转化子孵育：30°C、48h
2.6 血红素提取与定量
将1 mL培养物中的细胞通过离心（12,000 rpm，10 min，4°C）收集。上清液用于检测ALA和胞外血红素的产量。沉淀重悬于1 mL 2%酸性丙酮中，使用VCX800（Sonics，美国纽敦）超声处理10 min，并用1 mL 1 M NaOH稀释。不溶性组分通过离心（12,000 rpm，10 min，4°C）去除，细胞裂解液上清液用于检测胞内血红素和血红素中间体（尿卟啉原III、粪卟啉原III和原卟啉IX）的产量。ALA的量使用先前描述的方法配合改良Ehrlich试剂进行定量。血红素的量使用配备二极管阵列检测器的高效液相色谱（HPLC；1260 Infinity II，Agilent）仪器定量。使用Eclipse XDB-C18反相柱（1.8 μm，4.6 mm × 150 mm，Agilent），监测400 nm处吸光度。在40°C下使用20–95%溶剂A在B中的线性梯度方法。溶剂A为10:90（v/v）HPLC级甲醇:乙腈混合物，溶剂B为含0.5%（v/v）三氟乙酸（TFA）的HPLC级水。流速为1 mL/min，运行40 min。
【数据】离心条件：12,000 rpm、10 min、4°C；酸性丙酮浓度：2%；超声时间：10 min；NaOH浓度：1 M；HPLC色谱柱：Eclipse XDB-C18（1.8 μm，4.6 mm × 150 mm）；检测波长：400 nm；柱温：40°C；梯度：20–95%溶剂A；流速：1 mL/min；运行时间：40 min；溶剂A：甲醇:乙腈=10:90（v/v）；溶剂B：0.5% TFA水溶液
2.7 转录组分析
起始菌株H11和进化菌株R5-03在YPD培养基中培养至指数期（OD600nm≈3）进行转录组分析。文库制备和测序由上海派森诺生物科技有限公司（中国上海）完成。三个独立样本进行测序。原始序列经质量过滤后，使用HISAT2软件（http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml）比对至酿酒酵母基因组数据库（SGD）中的CENPK.2-1C参考基因组。基因表达分析使用HTSeq（v. 0.11.1）进行，差异表达基因（DEGs）根据表达差异倍数|log2 fold change| > 1且显著p值<0.05的条件筛选。DEGs的富集分析使用Gene Ontology（GO）（http://www.geneontology.org/）和KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）进行。
【数据】培养条件：YPD培养基、指数期（OD600nm≈3）；差异表达基因筛选阈值：|log2 fold change| > 1、p < 0.05；比对软件：HISAT2；表达分析软件：HTSeq v. 0.11.1；富集分析：GO和KEGG
2.8 补料分批发酵
添加8 g/L KH₂PO₄、3 g/L MgSO₄、0.72 g/L ZnSO₄·7H₂O、10 mL/L微量元素溶液和12 mL/L维生素溶液的YPD用作补料分批发酵培养基。将单菌落接种于含5 mL YPD的试管中，在30°C、220 rpm振荡预培养18 h。第一次预培养的细胞接种于含15 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，在30°C、220 rpm振荡培养14 h。第二次预培养的细胞接种于含100 mL YPD的500 mL摇瓶中，在30°C、220 rpm旋转摇床中培养。这些培养物生长约24 h后，将10%（体积/体积）的种子培养物接种至含3 L培养基的5 L生物反应器（百仑，中国）。发酵在30°C下进行，通过自动添加5 M氢氧化铵将发酵系统pH维持在5.0。空气流量范围为1 vvm至2 vvm（空气体积/工作体积/min），溶解氧浓度（dO₂）通过搅拌级联（200–850 rpm）控制在40%饱和度以上。在补料分批发酵的第一阶段，使用含500 g/L D-葡萄糖、9 g/L KH₂PO₄、2.5 g/L MgSO₄、3.5 g/L K₂SO₄、0.28 g/L Na₂SO₄、10 mL/L微量元素溶液和12 mL/L维生素溶液，以及10 g/L酵母提取物和20 g/L蛋白胨作为氮源的补料溶液以实现快速细胞生长。当分批培养中的D-葡萄糖浓度降至1 g/L时，补加补料溶液以将残余葡萄糖浓度调节至1 g/L至2 g/L之间。当细胞量开始缓慢增加（进入稳定期）时，第一阶段结束并添加诱导剂半乳糖。在第二阶段，除补料溶液中包含相同的无机盐和微量元素外，添加800 g/L葡萄糖。该浓缩培养基用于诱导血红素积累。使用乙醇电极（百仑，中国）持续监测乙醇浓度，并通过调节补料速率将其维持在5 g/L。
【数据】发酵罐：5 L（百仑）；装液量：3 L；温度：30°C；pH：5.0（5 M氢氧化铵自动调节）；空气流量：1–2 vvm；dO₂：>40%饱和度；搅拌：200–850 rpm；第一阶段补料：500 g/L D-葡萄糖、9 g/L KH₂PO₄、2.5 g/L MgSO₄、3.5 g/L K₂SO₄、0.28 g/L Na₂SO₄、10 mL/L微量元素、12 mL/L维生素、10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨；残留葡萄糖控制：1–2 g/L；第二阶段补料：800 g/L葡萄糖；乙醇浓度维持：5 g/L；预培养时间：18 h、14 h、24 h
研究结果
3.1 通过C4和C5途径杂交构建ALA过量生产酵母菌株
ALA是血红素合成的前体，充足的ALA供应是血红素生产的先决条件。不同生物中ALA合成涉及C4和C5两条主要途径，但酿酒酵母中仅存在C4途径参与ALA合成，酵母不含天然的C5途径。本研究为开发ALA超高产菌株用于血红素生产，在酿酒酵母CENPK.2-1C中分别评估了工程化C5和C4途径，生成了ALA01、ALA02和ALA03菌株。ALA01菌株通过引入来自大肠杆菌W3110的HEMA和HEML基因，在细胞质中构建了重构的异源C5途径。ALA02菌株通过增强HEM1基因表达，在线粒体中构建了修饰的天然C4途径。ALA03菌株同时含有细胞质中的异源C5途径和线粒体中增强的C4途径（图1A）。
与原始菌株（WT）相比，这些工程菌株在从头ALA生产方面表现出显著改善，产量分别增加了66.4%、3.5倍和4.5倍，ALA01、ALA02和ALA03分别达到56.9 ± 2.7 mg/L、120.5 ± 0.3 mg/L和154.7 ± 1.8 mg/L（图1B），而其生物量仅略有下降（图1C）。结果表明，在酿酒酵母中，天然C4途径比外源C5途径具有更大的ALA合成代谢通量。C4和C5途径的组合更有利于ALA合成（图1B），可能是因为线粒体和细胞质中的可用资源被共同利用于ALA合成。因此，选择含有C4和C5杂交途径的ALA03菌株用于进一步的血红素合成分析。
鉴于C4途径仍是ALA03菌株中ALA合成的主要途径，进一步优化了C4途径以探索ALA生产能力是否能够进一步提高。甘氨酸和琥珀酰辅酶A是C4途径中ALA合成的直接前体，通过过表达泛酸激酶和苹果酸酶，增加甘氨酸和CoASH的供应可显著增强工程大肠杆菌中ALA的产量。因此，在ALA03菌株中提高了酿酒酵母中相应基因CAB1和MDH1（分别编码泛酸激酶和线粒体苹果酸脱氢酶）的表达水平，生成了ALA04、ALA05和ALA06菌株。与先前报道相反，与ALA03菌株相比，所有这些菌株的ALA产量均未增加，仅略有下降（图1B），表明这两个基因不是ALA03菌株中ALA合成的限制因素。此外，由ACO2基因编码的乌头酸酶在提供足够甘氨酸时是酿酒酵母ALA生物合成的限速酶。因此，在ALA03菌株中测试了ACO2表达的增强，生成了ALA07菌株。然而，ALA07菌株的ALA滴度仅略有增加（161.4 ± 3.6 mg/L）（图1B），表明在具有C4和C5杂交途径的菌株中，ACO2也不是ALA合成的限速酶。
【数据】ALA01产量：56.9 ± 2.7 mg/L（较WT增加66.4%）；ALA02产量：120.5 ± 0.3 mg/L（较WT增加3.5倍）；ALA03产量：154.7 ± 1.8 mg/L（较WT增加4.5倍）；ALA07产量：161.4 ± 3.6 mg/L；异源基因来源：大肠杆菌W3110（HEMA、HEML）；增强基因：HEM1、CAB1、MDH1、ACO2
3.2 酿酒酵母中血红素合成超载途径的构建
酿酒酵母中从ALA到血红素的生物合成途径涉及七个基因：HEM2、HEM3、HEM4、HEM12、HEM13、HEM14和HEM15。HEM2和HEM3已被鉴定为编码血红素合成限速酶PBG合酶和PBG脱氨酶的关键基因，由HEM12编码的尿卟啉原III脱羧酶可能是下一个限速酶。为开发血红素过量生产菌株，首先通过在基因组中添加额外拷贝，在产ALA的ALA07菌株中增强HEM2、HEM3和HEM12的表达。然而，生成的H1菌株未显示可检测的血红素积累，反而产生了粪卟啉III（CP III）（图2C）。这一发现表明从CP III到血红素的转化被阻断。
为鉴定并克服这一阻断，将负责从CP III到血红素连续级联催化反应的相关基因（包括HEM13、HEM14和HEM15）在H1菌株中单独或组合过表达，生成H2（HEM13）、H3（HEM14）、H4（HEM15）和H5（HEM13、HEM14和HEM15）菌株。在这些菌株中，仅H2和H5菌株产生了可检测量的血红素，奇怪的是，H2菌株的产量（2.4 ± 0.0 mg/L）显著高于H5菌株（图2D）。基于这些结果，由HEM13编码的粪卟啉原氧化酶是CP III向血红素转化中的限速酶。此外，H2菌株的最大生物量显著降低（图2E），表明HEM13基因过表达引起了代谢负担。有趣的是，单独增强HEM14或HEM15表达并未促进血红素积累。这一发现可能是因为在不增强HEM13表达的情况下，CP III难以向下游转化，导致几乎无血红素积累。然而，与H1菌株相比，H3和H4菌株最大生物量的显著降低表明，HEM14和HEM15表达的增强也显著增加了酿酒酵母的生长负担，其具体机制需进一步研究。总之，在不增强HEM14和HEM15表达的情况下单独增强HEM13表达，是实现高血红素产量的最优选择。
【数据】H1菌株：积累CP III，无可检测血红素；H2产量：2.4 ± 0.0 mg/L；H5产量：显著低于H2；H2最大生物量：显著降低；H3、H4最大生物量：较H1显著降低；过表达基因组合：HEM2+HEM3+HEM12（H1）、+HEM13（H2）、+HEM14（H3）、+HEM15（H4）、+HEM13+HEM14+HEM15（H5）
3.3 通过途径优化增强血红素合成
尽管HEM2、HEM3、HEM12和HEM13表达的增强使H2菌株的血红素合成增加，但血红素产量仍然较低，且ALA、CP III和PP IX等中间体明显积累（图2）。为增强血红素产量，有必要进一步优化血红素合成途径。鉴于仍有大量CP III残留，通过在H2菌株基因组中整合第三个HEM13拷贝，进一步提高HEM13（编码粪卟啉原III氧化酶）的表达以促进CP III向血红素的转化，生成H6菌株。然而，H6菌株的性能与H2菌株无差异，表明仅增加HEM13拷贝数并不能进一步提高CP III向血红素的转化。
先前报道表明，参与血红素合成的大多数基因是组成型表达的，但HEM13除外，其表达受氧和血红素的双重调控。HAP1基因编码一种转录激活因子，其DNA结合活性依赖于血红素，并激活ROX1基因的转录，ROX1编码缺氧基因的转录抑制因子，直接抑制HEM13基因的表达。换言之，HEM13基因在血红素存在下的表达受HAP1/ROX1通过反馈的负调控。为研究HEM13的活性是否可以被显著增强以促进CP III向血红素的转化，在H6菌株中单独或组合敲除HAP1和ROX1，生成H7（ROX1）、H8（HAP1）和H9（ROX1和HAP1）菌株。正如预期，与H2菌株相比，所生成菌株的血红素滴度显著更高（分别为1.1倍、2.2倍和2.4倍）（图2D）。此外，残余中间体的积累也发生了变化。
【数据】H6菌株：性能与H2无差异；H7（ROX1敲除）：血红素较H2提高1.1倍；H8（HAP1敲除）：血红素较H2提高2.2倍；H9（ROX1+HAP1敲除）：血红素较H2提高2.4倍；HEM13拷贝数：H6中整合第三个拷贝
（后续结果部分原文节选不完整，以下根据可获得的原文内容继续翻译）
3.4 基于CARM的高血红素生产菌株进化
（此部分原文节选未完整提供，但根据图表清单可知涉及CARM进化策略）
3.5 细胞与线粒体形态差异及ROS水平分析
（此部分原文节选未完整提供，但根据图表清单可知涉及WT、H11和R5-03菌株的形态学比较）
3.6 促进血红素生物合成的潜在基因筛选与评估
（此部分原文节选未完整提供，但根据图表清单可知涉及80个上调基因和26个下调基因的评估）
3.7 迭代组合过表达对血红素生产的影响
（此部分原文节选未完整提供，但根据图表清单可知涉及SPS22、REE1、MAL11、PHO84、HEM4和CLB2的迭代组合）
3.8 5-L罐补料分批发酵
（此部分原文节选未完整提供，但根据图表清单可知涉及R5-M菌株的发酵性能）
讨论与解读
本研究构建了一株能够高产血红素的工程酿酒酵母菌株，产量达380.5 mg/L，为迄今报道的酿酒酵母中最高血红素产量。尽管大肠杆菌中报道了更高的血红素产量（1034.3 mg/L），但鉴于酿酒酵母的食品安全特性，该工作对开发食用微生物生产食品级血红素仍具有重要价值。此外，与大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌等原核微生物相比，血红素在真核酿酒酵母中发挥更重要的生理作用，血红素合成水平的变化对酵母生理代谢产生更复杂的代谢响应。过量血红素合成对酵母细胞代谢影响的分析以及参与血红素生产和耐受性的关键基因筛选，也将有助于深入了解血红素在真核生物中的生理作用和代谢机制。
本研究证实C4和C5途径均可成功用于不同微生物中ALA和血红素的产生。在酿酒酵母中同时增强C4和C5途径实现了ALA产量的大幅提升，但C4途径对ALA产量的贡献大于C5途径。
编译者解读：该研究最值得关注的方法论创新在于将"毒性"转化为"进化压力"——利用血红素积累对酵母的细胞毒性作为筛选压力，通过CARM技术定向进化出高耐受菌株。这种"以毒攻毒"的策略在合成生物学中具有普适性参考价值。5轮进化后血红素产量提升7.3倍，说明表型进化在解决代谢物毒性问题上效率显著。然而，380.5 mg/L的产量仍低于大肠杆菌体系（1034.3 mg/L），真核生物血红素调控网络的复杂性既是挑战也是理解血红素生物学功能的窗口。未来若能将转录组学筛选出的32个基因的功能机制进一步解析，或可为其他真核底盘的血红素生产提供更精准的改造靶点。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2024
DOI: 10.1016/j.ymben.2024.07.007
DOI: 10.1016/j.ymben.2024.07.007