来源：Engineering a medium- and short-chain fatty acids biosensor for enhanced co-production of butyric acid, hexanoic acid, and their ethyl esters in Saccharomyces cerevisiae（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
中短链脂肪酸（MSCFAs）及其乙酯是酒类饮品的关键风味化合物，但其细胞毒性严重限制了酿酒酵母中的生物合成产量。本研究利用转录因子War1与PDR12启动子之间的天然调控机制，开发了灵敏精准的MSCFAs生物传感器WarPdr-MSCFA。通过随机突变和反向工程，研究者定位了War1配体结合域中响应丁酸和己酸的关键氨基酸区域（320-460位），获得了两种功能分化的传感器模块，并借助动态调控PDR12表达，使脂肪酸和乙酯产量分别提升126.37%和97.06%。
研究背景
丁酸（BA）、丁酸乙酯（EB）、己酸（HA）和己酸乙酯（EH）是酒精饮料中的关键风味化合物。在白酒中，这些化合物直接影响产品的风格与品质，其中乙酯类物质呈现突出的果香。适量的BA和HA能增强风味的平衡与醇厚感，但过量则会产生令人不悦的酸败味。此外，这四种化合物在生物燃料和医药领域也具有重要价值。
酿酒酵母是酒精饮料发酵的核心微生物，具有强大的乙醇生产能力，但其合成中短链脂肪酸（C4-C12）及其乙酯的能力极为有限。天然的脂肪酸合成酶（FAS）优先合成C16-C18长链脂酰辅酶A以满足细胞膜构建需求，导致丁酰辅酶A和己酰辅酶A等短中链前体的生产效率极低。虽然FAS工程改造可部分增强中链脂酰辅酶A的释放，但经典途径的高能耗仍是限制因素。近年来，引入异源逆转β-氧化途径成为增强酿酒酵母中短链脂肪酸合成的有效策略，但产物毒性问题始终是制约产量提升的核心瓶颈。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用全部菌株、质粒及密码子优化基因序列列于补充表S1、S2和S3。研究中使用的引导RNA（gRNA）通过在线工具（http://chopchop.cbu.uib.no/）设计。质粒构建采用OK Clon DNA连接试剂盒II（Accurate Biology，中国），遵循Gibson组装原理。携带不同gRNA的CRISPR/Cas9系统质粒的详细构建流程改编自先前研究（Wang et al., 2023）。CRISPR/Cas9介导的基因组工程用于基因敲除、基因整合和启动子替换。本研究所用培养基包括Luria-Bertani培养基（Bohua化学试剂有限公司，中国）、酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基（YPD，Bohua化学试剂有限公司，中国）、合成完全培养基（SC，Fun Genome Technology有限公司，中国）及玉米醪培养基（购自本地超市）。具体培养方案详见补充方法1和补充方法2。
【数据】培养基：LB、YPD、SC、玉米醪培养基；工具：CRISPR/Cas9；质粒构建：OK Clon DNA连接试剂盒II
2.2 构建共生产BA、HA及其乙酯的酿酒酵母工程菌株
为在酿酒酵母AY14α中构建逆转β-氧化代谢途径，研究者引入了以下基因：HBD（编码3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶）和CRT（编码3-羟基丁酰辅酶A脱水酶）来源于克氏梭菌（Clostridium kluyveri）；TER（编码反式烯酰辅酶A还原酶）来源于拜氏梭菌（C. beijerinckii）；BKTB（编码β-酮硫解酶）来源于贪铜菌（Cupriavidus necator）。上述基因经密码子优化后由Genewiz公司（苏州，中国）合成。随后，通过融合PCR构建了表达盒TDH3p-HBD-TDH1t、CCW12p-CRT-SAA1t、TEF1p-TER-ADH1t和TDH3p-BKTB-TDH1t。整合位点的上下游同源臂以AY14α基因组为模板扩增获得。不同基因的供体片段通过融合PCR构建，CRISPR/Cas9质粒与供体片段采用LiAc/SS carrier DNA/PEG法转入酵母细胞。该途径的所有基因均整合至YKU70位点。本研究中涉及基因敲除和启动子替换的重组菌株构建采用相似方法。
【数据】基因来源：HBD/CRT—Clostridium kluyveri；TER—C. beijerinckii；BKTB—Cupriavidus necator；整合位点：YKU70；转化方法：LiAc/SS carrier DNA/PEG
2.3 基于微孔板筛选策略的荧光分析
首先，将生物传感器菌株接种于含1 mL SC液体培养基的96孔深孔板中，在30°C、180 rpm条件下培养12小时获得一级培养物。然后，取100 μL一级培养物转移至含900 μL SC液体培养基的96孔板中，在相同条件下培养4小时（菌株对数生长期），获得二级培养物。最后，向96孔板（黑色透明底板）中分别加入100 μL二级培养物、90 μL SC液体培养基和10 μL诱导物（不同浓度的BA、HA和OA）。在30°C、300 rpm条件下孵育4小时后，使用多功能酶标仪测量OD600和荧光强度（激发波长：470 nm，发射波长：515 nm）。相对荧光强度以荧光强度与OD600的比值（GFP/OD600）计算。
【数据】培养体积：1 mL/100 μL/90 μL/10 μL；温度：30°C；转速：180 rpm/300 rpm；时间：12h/4h/4h；激发波长：470nm；发射波长：515nm；诱导物：BA、HA、OA
2.4 转录因子War1的定向进化
以菌株A-PYK1为模板扩增天然WAR1基因。扩增获得的WAR1片段作为随机突变的模板，使用Agilent GeneMorph II随机突变试剂盒（Agilent Technologies）进行突变。通过易错PCR在两种方案下生成WAR1随机突变文库：低突变频率（0-4.5个突变/kb）和中突变频率（4.5-9个突变/kb）。以A-PYK1为模板扩增WAR1的上下游同源臂，通过融合PCR将这些同源臂与WAR1随机突变文库融合，构建整合有WAR1的供体片段。为提高WAR1转化重组菌株的验证效率，以A-PYK1为起始菌株。使用潮霉素B表达盒（TEF1p-HPH-CYC1t）敲除WAR1，获得重组菌株A-ΔWar1作为后续实验的起始菌株。随后，将靶向HPH的CRISPR/Cas9质粒和含有不同突变的供体片段通过酵母转化导入A-PYK1-Hph菌株。通过菌落PCR验证成功整合（图3a）。
【数据】突变试剂盒：Agilent GeneMorph II；突变频率：低0-4.5突变/kb，中4.5-9突变/kb；筛选标记：潮霉素B（TEF1p-HPH-CYC1t）；验证方法：菌落PCR
2.5 发酵产物分析
胞外脂肪酸和脂肪酸乙酯采用气相色谱仪（Agilent 7890C，美国）分析，配备火焰离子化检测器和HP-INOWAX色谱柱。乙醇含量采用高效液相色谱仪（Agilent 1100，美国）测定，配备示差折光检测器和GH0830078H色谱柱。数据使用Agilent ChemStation软件处理。具体分析程序和条件详见补充方法3-5。
【数据】仪器：Agilent 7890C GC-FID、Agilent 1100 HPLC-RID；色谱柱：HP-INOWAX、GH0830078H
2.6 定点突变流程
WAR1突变体通过重叠延伸PCR和CRISPR/Cas9整合生成。构建过程详见补充方法6。
【数据】方法：重叠延伸PCR + CRISPR/Cas9整合
2.7 细胞生长能力评估
细胞生长能力和脂肪酸耐受性通过紫外-可见分光光度计（UV-1200，上海美谱达仪器有限公司）在600 nm波长下测量光密度来评估。详细实验流程见补充方法7。
【数据】仪器：UV-1200紫外-可见分光光度计；检测波长：600nm
2.8 PDR12表达分析
PDR12信使核糖核酸（mRNA）水平通过RT-qPCR（Thermo Fisher Scientific Quant Studio 1 plus，美国）定量，使用SYBR Green染色。总核糖核酸提取和互补脱氧核糖核酸合成分别使用Steady Pure RNA提取试剂盒和Evo M-MLV RT Mix试剂盒（Accurate Biotechnology，中国）。详细实验流程见补充方法8。
【数据】仪器：Quant Studio 1 plus；染料：SYBR Green；试剂盒：Steady Pure RNA提取试剂盒、Evo M-MLV RT Mix试剂盒
2.9 统计学与可重复性
本研究所有实验均进行至少三次独立生物学重复。统计分析使用IBM SPSS Statistics 25（IBM Corp.，美国）进行。组间显著差异采用独立样本t检验评估。统计显著性预设为p < 0.05。图中显著性水平标注如下：∗p < 0.05（统计学显著）、∗∗p < 0.01（高度显著）、∗∗∗p < 0.001（极其显著）。数据分析和标准作图使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software，美国）和Origin 2024（OriginLab Corp.，美国）执行。热图使用TBtools-II v2.210（Chen et al.，中国）生成和可视化。
【数据】统计方法：独立样本t检验；显著性阈值：p < 0.05；生物学重复：≥3次
研究结果
3.1 PDR12的组成型过表达增强酿酒酵母AY14α中BA/HA的外排但抑制工程菌株S1的脂肪酸/乙酯生产性能
为增强酿酒酵母中BA、HA及其乙酯的合成，研究者以AY14α为出发菌株，通过引入优化的逆转β-氧化途径（HBD、CRT、TER、BKTB）构建了菌株S1（图1a）。发酵后胞外产物浓度分析显示，菌株S1产生的BA和HA滴度分别为0.73 mM和0.99 mM，同时产生0.22 mM的EB和0.31 mM的EH（图1b）。尽管逆转β-氧化途径增强了这些化合物的生物合成，但显著损害了细胞生长（图1c）。微生物细胞的生长和产量主要受BA和HA毒性的限制。
已知ATP结合盒转运蛋白Pdr12能外排辛酸（OA）等水溶性羧酸盐阴离子，从而缓解弱有机酸胁迫并支持细胞生长。为确定Pdr12是否也具有降低酿酒酵母细胞内BA和HA水平的功能，研究者构建了PDR12过表达和敲除重组菌株AY-PDR12和AY-ΔPDR12。分别使用固体和液体YPD培养基测试菌株对BA和HA的耐受性。在固体和液体培养中，随着BA浓度升高（0-25 mM），所有菌株均表现出逐渐增强的生长抑制。然而，菌株AY-ΔPDR12在高BA浓度下表现出严重的生长损伤，而菌株AY-PDR12则表现出增强的BA耐受性（图1d）。在HA存在下（0-5 mM），固体YPD上的生长差异较小，但在含≥3 mM HA的液体培养中，菌株AY-ΔPDR12相比AY14α和AY-PDR12表现出轻微延长的指数期（图1e）。三种菌株在不同浓度BA和HA胁迫下细胞内酸积累的测量进一步证明Pdr12有助于BA和HA的外排，尤其是在较高酸胁迫条件下（图S1）。
为通过降低细胞内积累来增强对BA和HA的耐受性，研究者使用组成型启动子TEF1在菌株S1中过表达PDR12，生成重组菌株S2。这一改造导致细胞生长改善（图1f）和乙醇发酵性能增强（图S2）。然而，BA、HA和EH的滴度分别显著下降44.45%、42.00%和34.38%（图1g）。Pdr12介导的弱酸外排高度依赖ATP。PDR12的组成型过表达可能导致细胞内大量ATP消耗，损害ATP供应并限制BA、HA及其乙酯的合成。补充ATP可恢复产物产量（图S3），这一发现支持上述结论。与组成型过表达策略相比，开发动态调控的Pdr12表达系统可能更有利于细胞生产。
【数据】S1产量：BA 0.73mM、HA 0.99mM、EB 0.22mM、EH 0.31mM；S2产量下降：BA -44.45%、HA -42.00%、EH -34.38%；BA耐受测试浓度：0-25mM；HA耐受测试浓度：0-5mM
3.2 基于War1的生物传感器WarPdr-MSCFA的构建与优化——响应胞内外MSCFAs
基于转录因子（TF）的生物传感器通常由传感模块和报告模块组成。天然TF War1通过结合PDR12启动子响应胞内弱有机酸阴离子，激活Pdr12表达。基于这一机制，检测C6-C8脂肪酸的生物传感器已被成功开发（Baumann et al., 2018）（图2a）。在此基础之上，本研究旨在优化传感和报告模块，以提升检测性能、扩展操作范围并改变诱导特异性。
首先，与以往依赖多拷贝质粒增强信号输出稳定性的研究不同，研究者将报告模块（PDR12p-yeGFP-TDH1t）分别基因组整合至菌株AY14α基因组的三个不同高表达位点（208a、416d、LPP1），生成传感器菌株A-208a、A-416d和A-LPP1。通过将输入-输出响应曲线拟合至Hill方程，评估了生物传感器的性能，包括特异性、灵敏度、操作范围和动态范围（图2b）。在SC培养基中使用不同浓度的BA、HA和OA诱导传感器菌株，具体pH值见表S4。在三种菌株中，A-416d在BA、HA或OA诱导下表现出最低的基础表达、最宽的操作范围和动态范围以及最高的灵敏度（图2c）。
其次，研究者使用三种不同强度的启动子（ADH1p、PYK1p、PGK1p）在对照菌株A-416d中调控传感转录因子WAR1的表达水平，构建了菌株A-ADH1、A-PYK1和A-PGK1。当WAR1在PYK1p启动子下表达时，BA、HA和OA的动态范围分别增加8.38倍、8.40倍和6.40倍，检测限低至0.01 mM、0.005 mM和0.001 mM（图2d）。由此获得的生物传感器命名为WarPdr-MSCFA（菌株A-PYK1），用于监测C4-C8脂肪酸的胞内外动态变化。
【数据】整合位点：208a、416d、LPP1；动态范围提升：BA 8.38倍、HA 8.40倍、OA 6.40倍；检测限：BA 0.01mM、HA 0.005mM、OA 0.001mM
3.3 WAR1随机突变改变生物传感器WarPdr-MSCFA的操作范围和底物特异性
报告模块的整合位点和传感模块的启动子并未显著影响传感器的特异性和操作范围。War1对胞内诱导物的特异性主要由其配体结合域（LBD）决定。然而，War1 LBD的详细信息尚未见报道。为鉴定LBD区域并克服野生型War1的局限性，研究者对WAR1完整编码序列进行了易错PCR，构建了包含1,350个突变体的文库。使用0.10 mM BA、0.10 mM HA和0.05 mM OA进行初始诱导，发现1,097个突变体无响应，仅252个保留荧光活性（图3a）（图S4）。使用BA（0-5.00 mM）、HA（0-0.50 mM）和OA（0.0025-0.10 mM）的浓度梯度进行二次筛选，以评估这些候选突变体的操作范围（图S5）。该过程获得1个BA特异性突变体（M665）、2个HA特异性突变体（M485和M1032）以及21个对BA和HA均有响应但对OA无响应的突变体（图3b、c、d）（图S6）。然而，这些突变体表现出相对较弱的输出信号。
基于获得响应特异性改变的War1突变体，研究者对上述突变体进行了反向工程分析，以鉴定响应功能的关键区域。序列分析显示，与野生型相比，M665、M485和M1032分别存在8个、13个和7个氨基酸替换（图S7）。研究者随后基于这些突变位点构建了28个单点突变体（图3e）。诱导实验鉴定出3个突变体（W325R、W329L和F454V）对BA和HA均有响应但对OA无响应（图3f）。其他点突变体如I318V和Y463C则保留了野生型MSCFAs响应的特异性。这些结果表明，War1中由氨基酸320-460组成的区域对BA和HA的特异性响应至关重要（图3g）。
随后，研究者对21个响应BA和HA但不响应OA的突变体的320-460位氨基酸残基进行了测序，鉴定出38个不同的突变位点（图S8）。为验证这些位点对响应性的影响，构建了38个携带单点突变的重组菌株。用不同浓度的BA、HA和OA诱导这些菌株，并测量其特异性荧光强度。如图3h所示，突变体M320L、H353R、V378A、V384D、S396P、M417V、T428K、N435D、L450I和W451R仅响应BA和HA，对OA无响应。这进一步证实War1的320-460氨基酸区域对丁酸和己酸的结合特异性具有显著影响（图3g）。War1定位于细胞核，与PDR12p结合，与……
【数据】突变文库规模：1,350个突变体；无响应突变体：1,097个；保留荧光活性：252个；BA特异性突变体：1个（M665）；HA特异性突变体：2个（M485、M1032）；BA/HA双响应突变体：21个；氨基酸替换数：M665 8个、M485 13个、M1032 7个；关键区域：320-460位氨基酸
讨论与解读
本研究成功构建了基于War1的MSCFAs响应生物传感器。通过结合随机突变与反向工程，鉴定出War1中负责MSCFAs识别的配体结合域。通过高通量筛选，获得了两种功能分化的传感器模块（HCIE和NIBE）。所得到的HCIE系统动态调控PDR12表达，增强胞内BA和HA的外排，同时改善菌株生长和产量。尽管HCIE的表达强度低于TEF1p，但实现了相似的产品产量。本研究为MSCFAs检测提供了高通量工具，也为缓解MSCFAs毒性和克服代谢瓶颈提供了可扩展的策略。未来通过合成启动子策略工程化PDR12p来优化HCIE系统，有望增强其转录强度，确保PDR12以最优水平表达，并实现对工程菌株中其他关键元件的高效动态调控。
编译者解读：本研究的技术亮点在于将生物传感器从"检测工具"升级为"动态调控开关"——利用同一传感模块既监测又控制PDR12表达，巧妙规避了组成型过表达带来的ATP负担。从合成生物学应用角度看，这种"感知-响应-调控"一体化策略对解决其他产物的毒性瓶颈具有普适参考价值。值得注意的是，War1 LBD的鉴定为后续理性设计提供了明确的靶点序列，但当前突变体输出信号偏弱，未来若结合更强的合成启动子或信号放大模块，有望进一步提升调控精度和产量上限。
参考来源
Wang, X. Engineering a medium- and short-chain fatty acids biosensor for enhanced co-production of butyric acid, hexanoic acid, and their ethyl esters in Saccharomyces cerevisiae. Biosensors and Bioelectronics, 2026. DOI: 10.1016/j.bios.2026.118601
DOI: 10.1016/j.bios.2026.118601