来源：Evolved Saccharomyces cerevisiae strains exhibit superior freeze-thaw tolerance and frozen dough performance via multi-level adaptations（Food Research International）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
冷冻面团技术虽已实现工业化应用，但冻融胁迫导致的酵母活力丧失始终是制约产品质量的关键瓶颈。本研究采用杂交融合进化策略开发出超耐受酿酒酵母菌株，在−20°C、4天冷冻面团模型中展现出显著优势：比容保持率超过80%（亲本菌株仅52–54%），硬度增幅控制在38–49%（亲本菌株达69–102%）。非靶向代谢组学揭示了膜脂不饱和度提升、甲羟戊酸途径中间体积累、抗氧化化合物上调及能量代谢重塑等多层次耐受机制。
研究背景
冷冻面团技术使焙烤食品能够在零下温度（通常−18°C至−40°C）储存，通过解冻、醒发和烘烤完成最终加工，实现集中化生产、延长货架期并支持冷链物流。然而，面团结构劣化与酵母活力显著下降仍是行业核心难题——酵母活性丧失导致产气不足，进而影响产品体积、质构与风味。目前常用的亲水胶体、磷酸盐、蛋白添加剂等方案面临批次变异大、配方复杂且与清洁标签市场需求不符等局限。本研究基于前期开发的杂交融合进化策略，系统评估了进化菌株在冷冻面团体系中的工业适应性，并深入解析其分子层面的耐受机制。
研究方法
2.1 酵母菌株与培养条件
使用六株酿酒酵母：三株亲本菌株（DBY12007、PGY7和PGY34）和三株进化菌株（Evolved 1、2和3）。DBY12007是实验室参考菌株S288C的野生型二倍体衍生株。PGY7和PGY34分别为葡萄酒发酵和橡树渗出物环境中分离的野生二倍体菌株。杂交融合进化按照修改后的先前报道方案进行：使用蜗牛酶消化从单倍体和诱导二倍体亲本菌株（DBY12007、PGY7、PGY34）制备原生质体。所得杂交体经产孢产生单倍体孢子，随后进行八轮极端冻融胁迫的迭代筛选（−80°C冷冻18小时，4°C解冻6小时）。每轮结束后，存活细胞经回收用于下一轮接种。一次迭代包含全部八轮，存活率>80%的菌株进入后续杂交与筛选。最终进化菌株（Evolved 1–3）为在冻融胁迫下持续表现出高活力与稳健生长的菌株。所有菌株均在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培养基中培养，含20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物和20 g/L葡萄糖，30°C、200 rpm振荡。预培养过夜后接种至实验培养基。
【数据】菌株：DBY12007、PGY7、PGY34及Evolved 1–3；培养基：YPD（20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖）；温度：30°C；转速：200 rpm；冻融条件：−80°C 18h/4°C 6h；筛选阈值：存活率>80%
2.2 生长动力学测定
使用Synergy H1多功能酶标仪测定生长动力学。所有酵母菌株在4 mL液体YPD培养基中30°C、220 rpm振荡预培养过夜至稳定期。细胞经6000 rpm离心5分钟收集，无菌磷酸盐缓冲液洗涤两次，以初始OD600≤0.1接种至无菌96孔板的新鲜YPD培养基中。培养物在30°C连续轨道振荡（振幅1 mm，559 rpm）下培养，定期记录OD600。数据使用Gen5酶标仪软件采集与分析。
【数据】预培养：4 mL YPD、30°C、220 rpm、过夜；离心：6000 rpm、5 min；洗涤：无菌PBS两次；接种密度：OD600≤0.1；培养条件：30°C、559 rpm轨道振荡（振幅1 mm）
2.3 冻融循环耐受性评价
取1 mL稳定期细胞YPD培养液，6000 rpm离心5分钟收集细胞。细胞沉淀经洗涤后重悬于无菌蒸馏水中。系列稀释涂布YPD琼脂平板以测定初始菌落形成单位。剩余悬液分装后进行八次连续冻融循环。每个循环包括−20°C冷冻18小时、4°C解冻6小时。每次解冻后，样品涡旋震荡后放回冷冻。每天完成一个完整循环，总处理时长为8天。末次循环后，涂布测定CFU₂。细胞存活率计算公式为：存活率（%）=（CFU2/CFU1）×100。
【数据】样品量：1 mL稳定期培养液；离心：6000 rpm、5 min；冻融循环：−20°C 18h/4°C 6h；循环次数：8次；总时长：8天；存活率公式：Viability (%) = (CFU2/CFU1) × 100
2.4 冷冻面团制备与焙烤特性测定
采用两阶段发酵与冷冻方案制备冷冻面团面包。每150 g批次，预发酵由90 g商业高筋小麦粉（11%蛋白质、1.6%脂肪、73.5%碳水化合物、无钠）、54 g水、0.45 g麦芽糖酶和酵母（1–1.5%，w/w，基于面粉量）混合组成。预发酵在30°C进行2小时。面团随后在−20°C冷冻4天，4°C解冻12小时。随后加入60 g面粉、36 g水、7.5 g蔗糖和2.25 g盐，混合至均匀。然后加入7.5 g黄油，继续揉捏至面筋达到"窗玻璃阶段"。面团成型后进行30°C、1小时二次发酵。烘烤条件为170°C、30分钟。烤后面包冷却至室温后，采用小米置换法测定比容（mL/g）。质构剖面分析使用TA.XT Plus质构仪进行。面包切成15 mm厚切片，每样品取两片中心切片。使用P/36圆柱形探头测定面包芯硬度，设置如下：触发力5 g，测前速度1.0 mm/s，测试速度3.0 mm/s，测后速度3.0 mm/s，压缩比50%，两次压缩间隔1秒。
【数据】面团配方（每150 g批次）：90 g面粉、54 g水、0.45 g麦芽糖酶、酵母1–1.5%（w/w）；预发酵：30°C、2h；冷冻：−20°C、4天；解冻：4°C、12h；二次发酵：30°C、1h；烘烤：170°C、30min；质构参数：触发力5g、测前1.0mm/s、测试3.0mm/s、测后3.0mm/s、压缩比50%、间隔1s
2.5 非靶向LC-MS分析胞内代谢物提取
使用液相色谱-高分辨质谱进行非靶向代谢组学分析。在YPD培养基中培养至稳定期的酿酒酵母培养物经6000 rpm离心5分钟收集。细胞沉淀经液氮淬灭后于−80°C保存。提取时，冷冻沉淀与100 mg玻璃珠和1000 μL 50%甲醇混合，涡旋后液氮冷冻5分钟。室温解冻后，样品经匀浆处理（55 Hz，2分钟）。冻融研磨循环重复三次。匀浆液在12,000 rpm、4°C离心10分钟。收集上清液，干燥后用300 μL含4 ppm 2-氯-L-苯丙氨酸（内标）的50%甲醇复溶。样品经0.22 μm滤膜过滤至自动进样瓶。质量控制样品通过从每个提取物中取20 μL合并制备，用于监测仪器稳定性。所有样品经LC-MS分析。
【数据】离心：6000 rpm、5min；淬灭：液氮；提取溶剂：1000 μL 50%甲醇；玻璃珠：100 mg；匀浆：55 Hz、2min；冻融研磨循环：3次；离心：12,000 rpm、4°C、10min；复溶：300 μL 50%甲醇（含4 ppm内标）；QC样品：每样20 μL合并
2.6 LC-MS分析与数据处理
色谱分离在Thermo Vanquish UHPLC系统上进行，使用ACQUITY UPLC® HSS T3色谱柱（1.8 μm，2.1 × 100 mm），柱温40°C，流速0.30 mL/min，进样量2 μL。正离子模式流动相为含0.1%甲酸的水（A）和含0.1%甲酸的乙腈（B）。负离子模式使用含5 mM甲酸铵的水（A）和纯乙腈（B）。梯度程序为：0–1分钟：10% B；1–5分钟：10%→98% B；5–6.5分钟：98% B；6.5–6.6分钟：98%→10% B；6.6–8分钟：10% B。质谱分析在Thermo Orbitrap Exploris 120上进行，ESI源正离子模式+3.50 kV、负离子模式−2.50 kV。鞘气和辅助气分别设为40和10单位，毛细管温度325°C。MS1扫描为全扫描模式（m/z 100–1000），分辨率60,000。数据依赖性MS/MS（HCD，30%碰撞能量）针对前四个离子，分辨率15,000，带动态排除。
【数据】色谱柱：HSS T3（1.8 μm，2.1×100mm）；柱温：40°C；流速：0.30 mL/min；进样量：2 μL；ESI电压：+3.50kV/−2.50kV；毛细管温度：325°C；MS1：m/z 100–1000、60,000分辨率；MS/MS：HCD 30%碰撞能量、15,000分辨率
2.7 场发射扫描电镜样品制备与成像
经冻融处理的酵母细胞制备用于FESEM观察超微结构变化。细胞悬液6000 rpm离心5分钟，在5%戊二醛中4°C固定过夜，PBS缓冲液（pH 7.4–7.6）洗涤两次。样品经梯度乙醇系列脱水（30%、50%、70%和90%，各5分钟），中间不洗涤，随后100%乙醇洗涤三次。通风橱中风干后，干燥酵母贴在自粘铜带上，使用LEICA EM ACE600镀膜仪进行铂溅射镀膜。
【数据】固定：5%戊二醛、4°C、过夜；洗涤：PBS（pH 7.4–7.6）两次；脱水：30%/50%/70%/90%乙醇各5min + 100%乙醇三次；镀膜：铂溅射
研究结果
3.1 进化菌株的冻融耐受性
前期研究中，利用杂交融合进化策略开发了三株具有增强冻融耐受性的酿酒酵母菌株。为进一步评估其工业适用性，通过两条评价路线系统比较了进化菌株与亲本菌株：重复冻融试验评估微生物活力，单循环冷冻面团方案评估焙烤性能。酵母培养物首先经历八次连续冻融循环（−20°C 18小时，4°C 6小时），模拟工业加工中的累积胁迫。进化菌株表现出显著更高的存活率（>50%），而亲本菌株低于30%，活力提升约1.7倍（图1a）。这一增强的耐受性超过了单基因修饰（如NTH1或HSP12缺失）的报道结果。
关键的是，存活率的提升转化为解冻后优异的代谢恢复能力。进化菌株在6小时内恢复生长，约14小时达到稳定期，而亲本菌株表现出延长的迟滞期和受损的指数生长期（图1b）。尽管PGY34和PGY7保留了一定表面活力，短期生长测试显示这些菌株几乎无法恢复增殖。这表明在完全丧失膜完整性之前存在亚致死损伤，损害了代谢再激活和复制能力，导致表面活力与功能恢复之间的差异。这种快速再激活对商业焙烤过程中维持稳定的CO₂产量和醒发时间至关重要。
为进一步表征解冻后恢复潜力——发酵性能的关键决定因素——监测了冻融处理前后的生长动力学（图1b）。冷冻显著延迟了亲本菌株的生长，延长了迟滞期并减缓了向指数期的过渡。相反，进化菌株迅速恢复代谢活性，6小时内进入对数期，约14小时达到稳定期。这种增强的恢复能力表明其能在冷冻储存后快速重建活跃发酵状态。
【数据】存活率：进化菌株>50%、亲本菌株<30%；提升倍数：约1.7倍；恢复时间：进化菌株6h内恢复生长、约14h达稳定期；冻融循环：8次（−20°C 18h/4°C 6h）
3.2 解冻后面团膨胀与面包质构的改善
为确定进化菌株增强的冻融存活率是否转化为焙烤性能的提升，评估了冷冻储存条件下的面团发酵行为和最终面包品质。冷冻前，所有菌株——包括亲本和进化——表现出相当的面团膨胀能力，在120 ± 5分钟内达到满模体积，产生均匀多孔的面包芯（图2a）。然而，在−20°C冷冻储存4天后，进化菌株表现优于亲本菌株，保持>75%的模具体积，仅出现轻微收缩。相比之下，亲本菌株发酵的面团出现结构塌陷和致密面包芯结构，表明保气能力受损。
定量质构分析强化了这些发现（图2b，表1）。亲本菌株的比容保持率降至52.1–53.9%，而进化菌株保持高值（80.2–85.4%）。同样，亲本样品的面包芯硬度显著增加（69–102%），而进化菌株仅适度增加（38–49%），保持了柔软度。这些改善可与化学添加剂（如0.6%脱乙酰魔芋葡甘聚糖或0.3%猪皮明胶）相媲美甚至超越，凸显了菌株工程作为清洁标签替代方案的潜力。
弹性、内聚性、胶粘性和咀嚼性指标均显示进化菌株具有优异的保持能力。值得注意的是，关键质构参数在冻融处理后保持稳定。胶粘性的最小变化（+14至+18%）和咀嚼性变化（<+10%）进一步证实了进化酵母发酵面团的优异结构韧性，直接回应了冷冻面团产品质量劣化的核心问题。
高比容保持率与生长动力学中观察到的更快解冻后代谢激活相对应（图1b），表明增强的糖酵解恢复能力支撑了优异的产气能力。有趣的是，还观察到进化菌株在冷冻前就产生更柔软的面包芯（表1）。这表明HFE过程不仅赋予冻融耐受性，还增强了基础发酵效率。推测进化过程中选择的代谢特征——如有利于气体保留的膜组成改变和优化的能量代谢——可能在非胁迫条件下也改善了营养摄取和糖酵解通量。
【数据】比容保持率：亲本52.1–53.9%、进化80.2–85.4%；硬度增加：亲本69–102%、进化38–49%；胶粘性变化：+14至+18%；咀嚼性变化：<+10%；冷冻条件：−20°C、4天；满模时间：120±5min
3.3 代谢分化与趋同
在证明冷冻面团系统中焙烤品质提升后，进一步探究支撑这些优势的代谢基础。对冻融胁迫后的进化菌株和亲本菌株进行非靶向代谢组学分析。分析了三株亲本菌株和三株进化菌株，聚焦于冻融耐受性关键代谢通路：膜系统稳定性（如甾醇、不饱和脂肪酸）、渗透保护剂产生（如海藻糖、甘油）和氧化应激响应（如亚精胺、谷胱甘肽）。
主成分分析揭示了组间显著的代谢分化（图3a）。亲本菌株紧密聚集，表明菌株间变异有限，而进化菌株形成独立、紧密的簇，完全与亲本分离。这表明定向进化产生了趋同、稳定的代谢特征，是冷冻耐受性改善的标志。偏最小二乘判别分析进一步确认了亲本与进化组间的清晰分离（图3b-c），有效解析了组间异质性，同时展示了进化菌株中一致的代谢转变。正交偏最小二乘判别分析进一步优化了这一分离，降低了模型复杂度同时最大化判别能力（图3d-e）。
这些多元分析共同表明，进化菌株不仅从亲本谱系分化，还趋同于一个共同的代谢适应策略。
【数据】分析方法：PCA、PLS-DA、OPLS-DA；分组：3亲本 vs 3进化；代谢通路：膜稳定性（甾醇、不饱和脂肪酸）、渗透保护（海藻糖、甘油）、氧化应激（亚精胺、谷胱甘肽）
讨论与解读
本研究证实，通过杂交融合进化开发的第三代酿酒酵母菌株在冷冻面团应用中表现出优异的胁迫耐受性和性能提升。进化菌株在−20°C冻融4天后维持>50%存活率，同时表现出对热休克（50°C）和乙醇胁迫（15%）的耐受性。在冷冻面团发酵试验中，进化菌株显著增强产气性能，面包体积增加63%，面包芯硬度较亲本菌株发酵的冷冻面团降低64%。非靶向代谢组学揭示了胞内脂质组成、能量代谢和抗氧化网络的重新编程，支持活性氧清除和膜完整性维持作为协同抗冻适应机制的一部分。功能验证确认了这些发现：DPPH和ABTS试验显示进化菌株具有更强的抗氧化能力，与预适应机制一致。冷场扫描电镜进一步证明了冻融后细胞壁和膜结构的完整性，与代谢组学中甾醇和不饱和脂肪酸增加的证据相符。本研究的局限性在于主要关注解冻后恢复和终点比较，缺乏实时动态测量。
【数据】存活率：>50%（−20°C、4天）；热休克耐受：50°C；乙醇耐受：15%；面包体积增加：63%；硬度降低：64%
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编译者解读
本研究最值得关注之处在于将"菌株进化"与"工业应用指标"直接挂钩——不是停留在存活率层面，而是用比容保持率、质构硬度等焙烤终端参数验证进化成效。HFE策略的多亲本基因组重组显然比单基因编辑更利于协同调控膜脂、能量与抗氧化网络，这为冷冻面团用酵母开发提供了"多靶点协同进化"的范例。不过，八轮−80°C极端筛选与工业−20°C条件之间的差距、代谢组数据与表型之间的因果链条仍有待更精细的时序实验补强。从合成生物学角度看，若能进一步锁定关键代谢节点（如PC(18:3)合成或甲羟戊酸途径通量）进行定向强化，或许可将这种全基因组水平的进化优势转化为更可控的工程化方案。
DOI: 10.1016/j.foodres.2025.117843