来源：Optimization of sequential co-fermentation with Hanseniaspora opuntiae enhances aroma-active ester biosynthesis and sensory quality of rice beer（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
大米啤酒因糖化能力和游离氨基氮（FAN）含量低于大麦麦芽，香气复杂性常受限。本研究将大米麦芽优化与产香非酿酒酵母Hanseniaspora opuntiae NTUAFM-PI104和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Gr112的顺序共发酵相结合，通过响应面法（RSM）优化发酵条件，显著提升了以2-苯乙醇乙酸酯为代表的香气活性酯类合成，并改善了消费者感官评价。优化后的发酵策略改变了酵母种群的时间演替，使H. opuntiae在S. cerevisiae成为优势菌之前早期定殖，同时维持乙醇产量。
研究背景
啤酒是全球消费最广泛的酒精饮料之一，2018年全球产量约19.4亿百升，市场预计2025年超过7108.9亿美元。近年来，消费者对新奇产品、多样化感官特征和具有区域特色的谷物发酵饮料的需求推动了替代谷物在酿造中的应用。大米因高淀粉含量、低蛋白质水平和中性风味，常作为酿造辅料，有助于生产浅色、口感干净的啤酒。大米在亚洲多国是重要主粮，大米发酵饮料具有显著文化和区域意义。此外，大米低谷蛋白含量使其适合开发无麸质或低麸质啤酒产品。然而，大米啤酒香气复杂性常低于大麦麦芽啤酒，这与其较低的糖化能力和FAN含量有关，限制了麦汁组成和酵母源香气形成。本研究旨在通过麦芽优化和顺序共发酵策略解决这一问题。
研究方法
2.1 化学试剂与材料
本研究使用的所有化学品和试剂均为分析纯级，除非另有说明。酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖和琼脂购自Difco Laboratories（美国密歇根州底特律）。氯霉素、3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂以及挥发性化合物标准品（包括乙酸乙酯、乙酸异戊酯和2-苯乙醇乙酸酯）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。用于挥发性化合物提取的乙醚和作为内标的正戊醇购自Merck（德国达姆施塔特）。无水硫酸钠购自Showa Chemical Industry（日本东京）。所有溶液均使用Milli-Q系统（Millipore，美国马萨诸塞州贝德福德）纯化的去离子水制备。
【数据】试剂来源：Difco、Sigma-Aldrich、Merck、Showa Chemical Industry；水纯化系统：Milli-Q
2.2 酵母菌株与原料
新鲜水果（包括鳄梨、樱桃、龙眼、梨、橘子、杨桃、香蕉、苹果、芒果、番石榴和菠萝）购自台湾台北大安区的当地市场，用作分离产香酵母的来源。皮尔森大麦麦芽和Saaz啤酒花颗粒购自Pacific Brewcraft Co., Ltd.（台湾台中）。粳稻（台南11号品种）由台湾台北当地碾米厂提供。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Gr112为先前分离并保存于台湾大学食品科技研究所（Lai et al., 2022）。Hanseniaspora opuntiae NTUAFM-PI104在初步筛选中从菠萝表面分离，并因其产香潜力被选中。所有菌株保存在酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂（YPDA）上，4°C保存，使用前进行传代培养。
【数据】菌株：S. cerevisiae Gr112、H. opuntiae NTUAFM-PI104；保存条件：YPDA，4°C；大米品种：台南11号（粳稻）
2.3 酵母菌株的分离与鉴定
酵母分离和鉴定按照先前报道的方法稍作修改进行（Lai, Chen, et al., 2023）。水果样品在添加抗生素的酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）肉汤中富集，然后进行系列稀释并涂布在YPDA上以获得单菌落。选定的分离株通过反复划线纯化。从纯化分离株中提取基因组DNA。使用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增内转录间隔区（ITS）区域（Sutani et al., 2015）。PCR产物进行测序，所得序列使用BLAST与NCBI数据库比对以确定酵母菌株的分类学身份。用于物种鉴定的Hanseniaspora opuntiae NTUAFM-PI104完整ITS核苷酸序列见补充材料Data S1。
【数据】引物：ITS1/ITS4；鉴定方法：ITS测序+BLAST比对；数据库：NCBI
2.4 酿酒酵母和非酿酒酵母的筛选
酿酒酵母和非酿酒酵母的发酵性能和产香潜力按照先前报道的方法稍作修改进行评估（Lai, Chen, et al., 2023）。对于酿酒酵母，细胞在含20%（w/v）葡萄糖的YPD肉汤中于25°C、120 rpm振荡培养5天。发酵性能通过测定衰减度来评估，使用比重瓶在25°C下根据样品密度测定，方法如前所述（Cioch-Skoneczny et al., 2020）。对于非酿酒酵母，培养物先在YPD肉汤中预培养，随后接种到含20%（w/v）葡萄糖的YPD中进行相同条件下的发酵。发酵后，使用乙醚提取上清液中的挥发性化合物，以正戊醇为内标。收集有机相，用无水硫酸钠干燥，浓缩后通过气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）分析。关键香气化合物的产生，特别是2-苯乙醇乙酸酯，被用作评估酵母菌株产香能力的指标。
【数据】培养基：YPD（含20% w/v葡萄糖）；温度：25°C；时间：5天；转速：120 rpm；检测方法：GC-FID；内标：正戊醇
2.5 大米发芽与α-淀粉酶活性测定
大米发芽按照先前报道的方法稍作修改进行（Ceccaroni et al., 2019; Palmiano & Juliano, 1972）。稻谷在前4天每天浸泡4小时，随后在不进一步浸泡的情况下额外发芽8天。发芽过程在室温、黑暗条件下进行。通过每天测量芽长监测发芽进展。发芽后，大米样品冷冻干燥，用实验室粉碎机粉碎成粉末。所得大米麦芽粉末在4°C下储存直至进一步分析。α-淀粉酶活性按照先前描述的方法稍作修改测定。活性使用DNS法测定，基于淀粉释放的还原糖的定量（Damaris et al., 2019）。
【数据】浸泡条件：前4天每天4小时；发芽时间：共12天（4天浸泡+8天）；温度：室温；光照：黑暗；检测方法：DNS法
2.6 麦汁制备与化学特性表征
麦汁使用改良的糖化程序制备（Wijngaard & Arendt, 2006）。发芽大米在60°C干燥8小时获得大米麦芽，储存于4°C备用。大麦麦芽和大米麦芽按100:0、70:30、60:40和50:50（w/w）的比例混合，分别对应对照组和第1、2、3组，然后粉碎并以1:4.5（w/v）的比例与水混合糖化。糖化程序为50°C保持20分钟，67°C保持60分钟，78°C保持5分钟。麦汁过滤后与啤酒花（1.7 g/L）煮沸60分钟，冷却至室温。麦汁组成分析包括可发酵糖、FAN、色度和α-淀粉酶活性。葡萄糖和麦芽糖通过HPLC-RI（Shodex RI-71，Showa Denko，日本东京）定量，使用ReproGel Ca柱（300 × 8 mm，9 μm；Dr. Maisch GmbH，德国阿默布赫），柱温80°C，流动相为5 mM H2SO4，流速0.5 mL/min。FAN使用商业试剂盒测定，色度在430 nm处测量并以欧洲酿造公约（EBC）单位表示，α-淀粉酶活性使用DNS法测定。
【数据】麦芽混合比例：100:0、70:30、60:40、50:50（w/w）；料水比：1:4.5（w/v）；糖化程序：50°C 20min→67°C 60min→78°C 5min；啤酒花添加量：1.7 g/L；煮沸时间：60min；HPLC条件：80°C，5 mM H2SO4，0.5 mL/min；色度波长：430nm
2.7 酒精发酵与实验设计
基于麦汁特性表征结果，选择含50%大米麦芽的配方用于所有后续发酵实验。选定该配方后，在发酵前将麦汁的可发酵糖浓度用葡萄糖调整至80 g/L。该标准化操作是为了在所有响应面法（RSM）处理中保持一致的初始可发酵糖浓度，从而可以在不受初始可发酵糖浓度差异干扰的情况下评估发酵温度、接种量和接种顺序的影响。基于初步实验，使用Box-Behnken RSM设计优化发酵条件，评估发酵温度、接种量和接种顺序的影响。温度范围为10至30°C，接种量为2 × 10⁶至1 × 10⁷ CFU/mL。接种顺序定义为五种条件：先接种酿酒酵母Gr112再接种H. opuntiae NTUAFM-PI104（提前2天或1天）、同时接种、以及先接种H. opuntiae再接种S. cerevisiae（提前1天或2天）。这些条件分别命名为S0H2、S0H1、S0H0、S1H0和S2H0，对应+48、+24、0、−24和−48小时。选择三个自变量：发酵温度（X1，10–30°C）、接种量（X2，2 × 10⁶–1 × 10⁷ CFU/mL）和接种顺序（X3），以H. opuntiae与S. cerevisiae接种之间的时间间隔表示（−48至+48小时，负值表示先接种H. opuntiae，正值表示先接种S. cerevisiae，0小时表示同时接种）。中心点设为20°C、6 × 10⁶ CFU/mL和同时接种。这些条件作为非优化参考，用于与后续优化条件进行比较。
【数据】初始可发酵糖浓度：80 g/L；温度范围：10–30°C；接种量范围：2 × 10⁶–1 × 10⁷ CFU/mL；接种顺序：5种（S0H2、S0H1、S0H0、S1H0、S2H0）；RSM设计：Box-Behnken；中心点：20°C、6 × 10⁶ CFU/mL、同时接种
研究结果
3.1 酵母菌株的筛选
从水果样品中共获得十个酵母分离株并进行了分类学鉴定，包括一株酿酒酵母和九株非酿酒酵母，属于Hanseniaspora和Torulaspora属（补充表S2）。除分离株S. cerevisiae NTUAFM-AV101外，实验室保存的参考菌株S. cerevisiae Gr112也因其先前报道的优良发酵性能而被纳入比较评估（Lai, Chen, et al., 2023; Lai, Hou, et al., 2023）。酿酒酵母菌株的发酵性能基于表观衰减度评估，这是发酵过程中糖转化效率的关键指标。如图2A所示，S. cerevisiae Gr112表现出最高的衰减度（93.2 ± 1.0%），其次是S. cerevisiae BCRC 21447（92.1 ± 2.7%），两株菌之间无显著差异（p > 0.05）。相比之下，S. cerevisiae NTUAFM-AV101的衰减度显著较低（73.8 ± 3.9%），表明其发酵能力较差。Gr112优异的衰减度表明其能更高效地利用可发酵糖，这对乙醇生产和整体发酵性能至关重要（Capece et al., 2021）。
非酿酒酵母分离株的产香潜力基于2-苯乙醇乙酸酯的产生量评估，这是一种与花香和蜂蜜香相关的关键酯类。如图2B所示，从菠萝中分离的Hanseniaspora opuntiae NTUAFM-PI104产生了最高水平的2-苯乙醇乙酸酯（23.14 ± 0.46 mg/L），显著高于其他分离株。该水平落在Hanseniaspora属的报道范围内（0.47–41.85 mg/L）（Bourbon-Melo et al., 2021; del Fresno et al., 2022），支持其强大的产酯能力。其他分离株，包括Torulaspora delbrueckii NTUAFM-LO103和H. opuntiae NTUAFM-ST103，表现出明显较低的产生水平。基于这些结果，选择S. cerevisiae Gr112和H. opuntiae NTUAFM-PI104进行后续共发酵实验，旨在将高效糖发酵与增强的香气形成相结合。菌株筛选中获得的2-苯乙醇乙酸酯浓度不应直接与啤酒发酵中观察到的浓度进行比较，因为筛选实验是在含20%葡萄糖的YPD培养基中进行的，以评估单个分离株的内在产香潜力。相比之下，大米麦汁在糖组成和氮可用性方面与YPD培养基有显著差异（Ceccaroni et al., 2019; Marconi et al., 2017），而混合培养发酵进一步引入了种间相互作用，可能影响酵母代谢和挥发性化合物形成（Aguiar-Cervera et al., 2024; Wang et al., 2023）。因此，筛选实验的主要目的是识别有前景的产香菌株，而非预测酿造过程中的绝对酯产量。
【数据】衰减度：Gr112为93.2 ± 1.0%，BCRC 21447为92.1 ± 2.7%，NTUAFM-AV101为73.8 ± 3.9%；2-苯乙醇乙酸酯产量：NTUAFM-PI104为23.14 ± 0.46 mg/L；筛选培养基：YPD含20%葡萄糖
3.2 大米发芽与α-淀粉酶活性
大米发芽从第5天到第12天稳步推进，芽和根明显伸长，如补充图S2所示。发芽在受控条件下进行，整个过程中发芽率保持在80%以上，表明发芽稳定高效。α-淀粉酶活性随发芽时间显著增加（表1），从第0天的13.48 U/g上升至第12天的93.53 U/g（p < 0.05）。第5天后观察到显著增加，这与发芽期间胚的快速发育和水解酶的活化相对应。α-淀粉酶活性的增加与淀粉降解为可发酵糖有关，这对后续麦汁生产和发酵效率至关重要。本研究中观察到的α-淀粉酶活性超过了先前研究中报道的发芽大米的平均值（通常约为58 U/g）（Guimaraes et al., 2024），表明在所用发芽条件下内源酶被有效激活。然而，延长发芽可能导致淀粉过度降解、结构完整性降低和可提取物质的潜在损失（Baranzelli et al., 2019; Li et al., 2026）。因此，后续实验选择9天的发芽期，因为在此阶段α-淀粉酶活性已大幅增加，而根据先前报道，更长的发芽可能对原料质量产生不利影响。这一选择代表了在当前实验条件下酶活性和底物保存考虑之间的实际平衡。
【数据】发芽率：>80%；α-淀粉酶活性：第0天13.48 U/g→第12天93.53 U/g（p < 0.05）；文献平均值：约58 U/g；选定发芽时间：9天
3.3 麦汁的理化特性
对不同大麦-大米麦芽比例制备的麦汁的理化性质进行了评估，以确定适合后续发酵实验的配方（表2）。用大米麦芽替代大麦麦芽显著影响了糖组成、氮含量和色度，同时保持了相当的酶活性。可发酵糖谱显示，随着大米麦芽比例的增加出现明显变化。麦芽糖含量从对照组的70.34 g/L降至50%大米麦芽组的46.86 g/L，而葡萄糖含量从14.31 g/L增至24.43 g/L。尽管存在这些组成变化，所有处理的总可发酵糖保持在70 g/L以上，表明底物可用性充足。葡萄糖增加和麦芽糖减少可归因于发芽和糖化过程中α-淀粉酶活性驱动的淀粉水解增强和随后的二糖分解（Parés Viader et al., 2021）。在大米麦芽基麦汁中也报道了类似的糖谱，尽管绝对值因发芽和糖化条件而异（Ceccaroni et al., 2019; Ceppi & Brenna, 2010; Mayer et al., 2014）。FAN随大米麦芽替代比例增加而显著降低，从对照组的262.50 mg/L降至50%大米麦芽组的227.14 mg/L。这一趋势与大米蛋白质含量低于大麦一致（Marconi et al., 2017）。然而，所有处理的FAN水平都处于或接近酵母生长和发酵的最适范围（通常报道为200–250 mg/L）（Eβlinger, 2009），表明氮可用性不是限制因素。麦汁色度随大米麦芽含量增加略有下降，范围从6.61到5.53 EBC。这种降低可能归因于大米麦芽较低的焙烧温度，限制了美拉德反应和有色化合物的形成（Marconi et al., 2017）。观察到的值落在大米基或含辅料麦汁的典型报道范围内（Ceppi & Brenna, 2010; Mayer et al., 2016），表明替代未对视觉质量产生不利影响。相比之下，α-淀粉酶活性在所有处理中保持相对恒定，未观察到显著差异。这些结果表明，尽管部分用大米麦芽替代了大麦麦芽，50%大米麦芽配方仍提供了足够的可发酵糖、FAN和保留的α-淀粉酶活性以支持后续发酵。综合考虑可发酵糖可用性、氮含量和酶活性之间的平衡，选择50%大米麦芽配方作为所有后续发酵实验的底物。该配方提供了足够的可发酵糖和充足的FAN水平，同时最大化了大米麦芽的贡献，从而代表了评估发酵性能和香气发展的合适酿造基质。为了在后续优化实验中对发酵参数进行受控评估，选定麦汁的初始可发酵糖浓度被标准化。
【数据】麦芽糖：对照组70.34 g/L→50%大米麦芽组46.86 g/L；葡萄糖：对照组14.31 g/L→50%大米麦芽组24.43 g/L；总可发酵糖：所有处理>70 g/L；FAN：对照组262.50 mg/L→50%大米麦芽组227.14 mg/L；色度：6.61–5.53 EBC；最优配方：50%大米麦芽
3.4 响应面法优化共发酵条件
使用Box-Behnken RSM设计评估了发酵温度、接种量和接种顺序对2-苯乙醇乙酸酯产生的影响。如图3所示，发酵温度、总酵母接种量和接种顺序均显著影响2-苯乙醇乙酸酯的产量。响应面建模和优化结果如图4所示。图4A展示了发酵温度（X1）、接种量（X2）和接种顺序（X3）对酯类产生的交互影响等高线图。图4B显示了预测的最佳条件。优化后的条件为：发酵温度23.54°C，接种量7.78 × 10⁶ CFU/mL，以及延迟接种S. cerevisiae（即先接种H. opuntiae），该条件经实验验证可提高2-苯乙醇乙酸酯的产量。
【数据】最佳温度：23.54°C；最佳接种量：7.78 × 10⁶ CFU/mL；最佳接种顺序：延迟接种S. cerevisiae（先接种H. opuntiae）
3.5 优化条件下的发酵动力学与酵母种群动态
在未优化和优化条件下，对S. cerevisiae Gr112和H. opuntiae NTUAFM-PI104共发酵过程中的发酵动力学和酵母种群动态进行了监测。图5A、B显示了两株酵母菌在发酵过程中的种群动态变化。在优化条件下，两株酵母菌的时间演替发生了改变，使得H. opuntiae在S. cerevisiae成为优势菌之前能够早期定殖，同时维持了乙醇产量。图5C、D显示了发酵过程中残糖和乙醇浓度的变化。优化条件下的发酵在保持乙醇产量的同时，改变了酵母种群的时间演替模式。
【数据】发酵条件：优化vs未优化；监测指标：种群动态、残糖、乙醇浓度
3.6 挥发性香气化合物与气味活性值分析
挥发性化合物和气味活性值（OAV）分析表明，优化发酵增强了香气活性酯类和萜烯类化合物，特别是辛酸乙酯、2-苯乙醇乙酸酯和芳樟醇。主成分分析（PCA）用于区分不同啤酒样品的挥发性香气化合物谱。图6展示了不同啤酒样品的PCA结果。C代表商业啤酒，Unop代表未优化啤酒，Op代表优化啤酒，Unop-2nd代表未优化瓶内二次发酵大米啤酒，Op-2nd代表优化瓶内二次发酵大米啤酒。前两个主成分解释了总方差的91%。
【数据】PCA前两个主成分解释方差：91%；关键香气化合物：辛酸乙酯、2-苯乙醇乙酸酯、芳樟醇
3.7 感官评价与消费者接受度
使用CATA（check-all-that-apply）方法对不同啤酒样品进行了感官评价。图7展示了从CATA测试中获得的感官属性的对应分析（CA）结果。引用频率高于20%的属性被纳入分析。图7A显示了啤酒样品与感官属性之间关系的整体CA图。消费者感官评价进一步证实，与未优化的大米啤酒相比，优化后的大米啤酒在香气、风味和余味方面均有改善。
【数据】感官评价方法：CATA；纳入标准：引用频率>20%；评价维度：香气、风味、余味
讨论与解读
本研究证明，使用Hanseniaspora opuntiae NTUAFM-PI104和Saccharomyces cerevisiae Gr112进行顺序共发酵优化是改善大米啤酒香气特征的有效策略。通过将大米麦芽优化与基于RSM的发酵设计相结合，优化的共发酵条件与H. opuntiae的延长早期存续、增强的酯类形成和相当的乙醇产量相关。挥发性和OAV分析进一步表明，少数香气活性化合物，特别是辛酸乙酯和芳樟醇，是整体感官特征的主要贡献者，而2-苯乙醇乙酸酯作为Hanseniaspora在共发酵过程中代谢贡献的代表性标志物。这些组成变化伴随着相对于未优化样品向更果香型香气特征的转变和感官感知的改善。本研究存在若干局限性：发酵策略仅使用单一菌株组合在实验室规模的摇瓶发酵中评估，长期稳定性仍需进一步验证。
【编译者解读】该研究巧妙地将"原料端"（大米发芽优化）与"菌株端"（非酿酒酵母共发酵）两个维度的策略整合，以2-苯乙醇乙酸酯作为关键标志物进行RSM优化，思路清晰且具有产业转化潜力。大米作为亚洲大宗农产品，将其转化为高附加值发酵饮品具有现实意义。值得注意的是，该研究选择延迟接种酿酒酵母以赋予H. opuntiae早期生长优势，这一时序设计为混菌发酵中弱势产香菌株的存活提供了可借鉴的策略。局限在于实验室摇瓶规模与工业化放大之间仍存在差距，未来可在中试规模验证该策略的稳健性。
参考来源
Hung, W.-T. (2026). Optimization of sequential co-fermentation with Hanseniaspora opuntiae enhances aroma-active ester biosynthesis and sensory quality of rice beer. Food Bioscience, 2026. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109657
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109657