顺序接种产香耐酸酵母与酿酒酵母增强菠萝酒风味

来源：Flavour-enhancement mechanisms in pineapple wine revealed by sequential inoculation of an aroma-active, acid-tolerant Hanseniaspora uvarum with Saccharomyces cerevisiae（Food Research International）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

高酸度水果酿制的果酒往往香气单一、前体转化效率低。本研究从传统发酵食品中筛选产香、耐酸的非酿酒酵母，通过GC-O-MS多维度筛选获得一株耐酸（pH 1.5存活）且高产香气的Hanseniaspora uvarum P15，将其与酿酒酵母C12顺序接种发酵菠萝酒。结果表明，该组合显著提升果酒感官评分（64.74 ± 4.95）和总抗氧化能力（26.37 ± 0.87 mmol TE/L），并通过代谢重编程增强酯类和萜烯类化合物合成。转录组与风味组联合分析揭示了菌间协同的分子机制。

研究背景

发酵果酒凭借其营养价值、功能特性和怡人风味，已成为全球年轻消费者的主流饮品。香气是决定感官品质和消费者偏好的关键因素，推动产业向风味多样化和健康增益方向发展。然而，在利用多样化水果资源与抵御产品同质化之间取得平衡，仍是紧迫挑战。弱酸性水果的发酵技术已相对成熟，但利用菠萝、柠檬等高酸度水果酿造特色风味的果酒，仍存在技术困难。低pH环境会抑制常规酿酒酵母的活性，损害酶活和代谢调控，导致发酵停滞；同时限制香气前体的生物转化，使水果固有的风味复杂性难以充分表达。这种丰富酸性水果资源与技术瓶颈之间的矛盾，在高产水果市场尤为突出，制约了高品质果酒产品的开发。

研究方法

2.1 材料与试剂

非酿酒酵母筛选材料（酱油、腐乳、泡菜和新鲜松露）及发酵用黄金菠萝（A. comosus (L.) Merr.）购自成都永辉超市。商业菌株酿酒酵母C12（Lallemand, Lamothe-Abiet, France）作为对照。所有培养基购自北京兰桥科技有限公司。T-AOC检测试剂盒、1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、正构烷烃标准混合物（C7–C30）、二硫苏糖醇、乙腈、d-(+)-葡萄糖、甲酸和SPME纤维购自上海源叶生物科技有限公司。其他化学试剂均为分析纯，购自成都科龙试剂有限公司。

【数据】材料来源：永辉超市（成都）；菌株：S. cerevisiae C12（Lallemand）；试剂：T-AOC试剂盒、DPPH、C7–C30正构烷烃标准品等；纯度：分析纯

2.2 产香与耐酸非酿酒酵母的筛选

#### 2.2.1 分离与初筛

非酿酒酵母从酱油、腐乳、泡菜和松露中分离。样品（10 g）在90 mL无菌生理盐水（0.85% w/v）中均质化，振荡（200 rpm，30 min），适当稀释后涂布于含氯霉素（100 mg/L）的YPD琼脂平板。平板在28°C培养48 h。形态不同的菌落在赖氨酸琼脂上纯化，参照Boban et al.（2025）进行初步鉴定。发酵能力采用杜氏管法在YPD肉汤中28°C评估，以酿酒酵母C12为阳性对照。

【数据】样品量：10 g；生理盐水：0.85% w/v，90 mL；振荡：200 rpm，30 min；氯霉素：100 mg/L；培养：28°C，48 h；方法：杜氏管法

#### 2.2.2 GC-O筛选与香气评估

复筛菌株接种于麦芽汁培养基，以未接种培养基（标记为P）和酿酒酵母C12接种物为对照。所有样品相同条件培养48 h后进行GC-O分析。GC-O分析参照Chai et al.（2025）并略作修改。ODP4嗅闻口（Gerstel）耦联GC系统，在HP-INNOWAX色谱柱（60 m × 0.25 mm × 0.25 μm；Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA）上分离，升温程序：60°C保持1 min，以4°C/min升至180°C（保持5 min），再以5°C/min升至230°C（保持5 min）。流出物以1:1分流至MS和ODP4；柱温箱和传输线维持在250°C。七位评估员（四男三女，年龄22–40岁）——四位受过葡萄酒评价培训，三位具有食品风味调配经验——采用5分制（1：无，5：极强）对香气强度进行三次重复评分，并提供描述性注释。

【数据】培养时间：48 h；色谱柱：HP-INNOWAX（60 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；升温程序：60°C 1 min → 4°C/min至180°C（5 min）→ 5°C/min至230°C（5 min）；分流比：1:1；温度：250°C；评估员：7人（4男3女，22–40岁）；评分制：5分制，三次重复

#### 2.2.3 VOC分析与关键VFC筛选（GC-MS）

在YPD液体培养基中培养的非酿酒酵母产生的挥发性有机化合物（VOCs）使用自动SPME进样头浓缩，参照Chai et al.（2025）的方法用GC-MS（型号5977B-9000，Agilent Technologies Inc., Santa Clara, USA）分析。VOCs通过与NIST 17数据库比对鉴定（相似度>80%）。鉴于不同化学类别响应因子不同，采用以2-辛醇为唯一内标的半定量方法，所有值表示为2-辛醇当量。通过背景扣除，消除菠萝样品中固有VOCs及发酵来源非VFCs的干扰，确定目标VFCs。关键VFCs参照Chen et al.（2024）的方法，使用相对气味活度值（ROAV）筛选，计算公式如下：

ROAV_A = (C_A / C_stan) × (T_stan / T_A) × 100

其中ROAV_A为某物质的相对气味活度值；C_stan和T_stan分别表示参考物质（乙醇，其ROAV设为100）的相对含量和气味阈值；C_A和T_A分别表示其他气味物质的相应值。

【数据】GC-MS型号：5977B-9000（Agilent）；数据库：NIST 17，相似度>80%；内标：2-辛醇；ROAV参考物质：乙醇（ROAV=100）

#### 2.2.4 耐酸菌株的筛选与鉴定

参照Pyne et al.（2023）并加以改编，采用耐受性试验筛选耐酸非酿酒酵母。构建模拟菠萝有机酸组成的混合酸体系（柠檬酸50%、苹果酸25%、奎宁酸10%、琥珀酸10%、乳酸3%、醋酸2%，w/v）。初步试验确定6%（w/v）添加量时pH最接近生菠萝汁（3.5 ± 0.1）。测试菌株接种于含混合酸的液体YPD培养基中，浓度梯度为0%–12%（w/v），以3%为间隔进行试验。过夜振荡培养后，测定600 nm处光密度（OD600，SuPerMax3100，Flash，中国）以评估酸胁迫下的生长能力，选择耐受性优异的菌株。菌株鉴定参照Zhang, Xiong, et al.（2025）进行。

【数据】混合酸组成：柠檬酸50%、苹果酸25%、奎宁酸10%、琥珀酸10%、乳酸3%、醋酸2%（w/v）；最适添加量：6%（w/v）；pH：3.5 ± 0.1；浓度梯度：0%–12%（w/v），间隔3%；检测：OD600

#### 2.2.5 非酿酒酵母的环境耐受性

以酿酒酵母C12为对照，参照Binati et al.（2019）评估分离菌株的耐受性。试验评估温度（5°C–45°C，五个梯度）、pH（1.5–6.5，一个梯度）、糖（10%–30% w/v，五个梯度）和乙醇（2%–10% v/v，五个梯度）。通过测定600 nm处吸光度确定生长情况。

【数据】温度梯度：5°C–45°C（5个梯度）；pH梯度：1.5–6.5；糖梯度：10%–30% w/v（5个梯度）；乙醇梯度：2%–10% v/v（5个梯度）；检测：OD600

2.3 菠萝酒的制备

菠萝酒发酵参照dos Anjos et al.（2024）并略作修改。简要流程：10.0 L生汁中添加偏重亚硫酸钾和果胶酶各60.0 mg/L，50°C澄清2 h。澄清汁调整至约150 g/L糖和pH 3.5 ± 0.1，分装为400.0 mL等份至1.0 L通气玻璃瓶中，80°C巴氏杀菌30 min。该严格条件用于确保一致的基线灭菌，但可能改变挥发性前体或诱导美拉德衍生化合物（Perez-Cacho & Rouseff, 2008）。顺序接种时，不同实验组以6% v/v等量接种1 × 10⁷ CFU/mL的接种物：先接种分离的非酿酒酵母，2天后接种酿酒酵母C12。发酵在25°C进行72–96 h，当残糖降至<4 g/L时终止。使用两株非酿酒酵母：菌株P15（产香、耐酸）和菌株J11（产香、酸敏感）。设置五个发酵组：自然发酵组（SF组，对照）、仅酿酒酵母C12组（CC组，对照）、C12与P15顺序发酵组（CP组）、C12与J11顺序发酵组（CJ组）、C12与P15和J11等比例混合物（1:1）顺序发酵组（CM组）。

【数据】生汁量：10.0 L；偏重亚硫酸钾：60.0 mg/L；果胶酶：60.0 mg/L；澄清：50°C，2 h；糖：约150 g/L；pH：3.5 ± 0.1；分装：400.0 mL/瓶（1.0 L瓶）；杀菌：80°C，30 min；接种量：6% v/v，1 × 10⁷ CFU/mL；发酵：25°C，72–96 h；终止残糖：<4 g/L

2.4 理化分析

总糖和还原糖分别采用苯酚-硫酸法和比色法测定（Zhong et al., 2024）。pH使用pH计（Phs-320，Licheng Instrument，上海，中国）直接测定。总酸度（TA，以g/L酒石酸当量表示）通过滴定测定（Luo et al., 2020）。乙醇含量采用重铬酸钾比色法分析。总酚和总黄酮含量分别采用Folin–Ciocalteu法和氯化铝法测定（de Lima et al., 2024）。

【数据】总糖方法：苯酚-硫酸法；还原糖方法：比色法；pH计：Phs-320；总酸度单位：g/L酒石酸当量；乙醇方法：重铬酸钾比色法；总酚方法：Folin–Ciocalteu法；总黄酮方法：氯化铝法

2.5 VFC分析

成品菠萝酒中的VFCs采用顶空SPME萃取，按第2.2.3节所述条件用GC-MS分析。

【数据】萃取方法：顶空SPME；分析：GC-MS（条件同2.2.3）

2.6 酵母计数

总酵母和非酿酒酵母数量分别在YPD琼脂和赖氨酸琼脂上计数（Simonin et al., 2018），酿酒酵母C12数量为两者之差。

【数据】总酵母：YPD琼脂；非酿酒酵母：赖氨酸琼脂；S. cerevisiae C12 = 总酵母 − 非酿酒酵母

2.7 感官评价

感官评价的伦理批准由四川师范大学伦理委员会豁免（Ref: 2025SL022，2025年3月17日），符合国家指南。所有参与者在评估前签署书面知情同意书。研究遵循确保自愿参与、充分告知、退出权利以及数据匿名和隐私保护的伦理规程。

【数据】伦理批准号：2025SL022（2025年3月17日）；知情同意：书面签署

研究结果

3.1 产香耐酸非酿酒酵母的筛选

#### 3.1.1 产香非酿酒酵母的分离

从不同来源共分离获得176株酵母菌。经选择性培养基连续筛选后，选出12株产气活性最高的菌株。随后的GC-O和感官评估鉴定了总得分>4.50且具有明显花香或果香特征的菌株（图1A）。选择四株香气潜力显著的菌株——P10、P13、P15和J11——进行VOC谱分析。展示VOC变化的总离子流图见图S1。共鉴定出10个化学类别的130种VOCs（图1B），相对丰度见图1C。在非酿酒酵母分离株中，J11产生53种VOCs，以异戊醇为主，2,3-丁二醇赋予玫瑰-蜂蜜气息。P10产生66种VOCs，主要为乙酸乙酯和异戊醇，赋予果香-酒精特征。P13含62种VOCs，乙酸乙酯和月桂醇贡献果香-花香品质。P15呈现67种VOCs，以乙酸乙酯和癸酸乙酯驱动明显的果香-酒香特征。酿酒酵母C12对照产生63种VOCs，以异戊醇、乙酸乙酯和癸酸乙酯为主，赋予果香-酒精特征。未发酵培养基含36种VOCs，包括果香的2-丁醇、杏仁味的苯甲醛和坚果味的3-乙基-2,5-二甲基吡嗪。这种差异突显了香气前体代谢的物种依赖性，与非酿酒酵母相比常规酿酒酵母能多样化VOC谱的公认能力一致（Amorim et al., 2026）。基于VFCs，四株非酿酒酵母均提高了培养基中花香和果香化合物的相对含量。菌株P15和J11表现出最显著的香气增强效果，超过酿酒酵母C12对照，而P10和P13表现出与酿酒酵母C12相当的能力（图1D），表明非酿酒酵母具有增强这些理想感官属性的潜力。

ROAV进一步分析显示，非酿酒酵母组含有的关键VFCs（ROAV >1）显著多于对照，表明风味特征更丰富、更复杂（表S1）。例如，乙酸异戊酯等酯类尽管浓度低，但在所有非酿酒酵母组中ROAV值均>50，因其极低的气味阈值（<50 μg/L），对果香贡献占主导地位（Yang et al., 2026）。共鉴定出27种关键VFCs（至少在一种组中ROAV >1）（图1E）。观察到明显的菌株特异性特征：P10产生最高水平的己酸乙酯（果香），而P13独特产生异戊酸异丙酯（果香）和香叶醇（花香）。总体而言，P15和J11展现出最优的综合产香性能，其中P15的丙酸乙酯（菠萝香）显著更高，J11的3-羟基-2-丁酮（奶油香）显著更高。

【数据】分离菌株总数：176株；初筛菌株：12株；GC-O入选标准：得分>4.50；VOC总数：130种（10类）；J11：53种VOCs；P10：66种VOCs；P13：62种VOCs；P15：67种VOCs；C12：63种VOCs；未发酵培养基：36种VOCs；关键VFCs：27种（ROAV >1）；乙酸异戊酯ROAV：>50；气味阈值：<50 μg/L

#### 3.1.2 耐酸非酿酒酵母的筛选与分子鉴定

对四株非酿酒酵母分离株的混合酸耐受性试验结果表明，所有菌株在无混合酸的YPD培养基中均正常生长，而OD600值随混合酸比例增加而逐渐下降。菌株J11受影响最显著（p < 0.05），在3%（w/v）比例时生长基本被抑制。菌株P10、P13和P15在0%–6%（w/v）混合酸范围内表现出良好耐受性。当比例提高至9%和12%（w/v）时，除P15和酿酒酵母C12仍保持一定活力外，所有菌株生长均明显受抑。此外，P15在各条件下OD600值始终高于酿酒酵母C12，表明P15具有最强的耐受性（图2A）。综上，P15表现出最优的混合耐受性，而J11表现最差。基于这些发现，并为后续酸性菠萝酒发酵实验提供适当参考，选择P15和J11进行分子鉴定。

基于引物NL1和NL4对26S rDNA D1/D2区测序结果，使用NCBI网站的BLAST工具进行序列同源性比对。用MEGA-X软件构建邻接法系统发育树（图2B），进行1000次自举重复。结果表明，菌株P15与Hanseniaspora uvarum亲缘关系最近，相似度99.9%，鉴定为Hanseniaspora属酵母，命名为H. uvarum P15。菌株J11与Pichia kudriavzevii亲缘关系最近，相似度99.8%，鉴定为Pichia属酵母，命名为P. kudriavzevii J11。H. uvarum和P. kudriavzevii在自然界广泛分布，是发酵饮料中的优势非酿酒酵母物种（Liu et al., 2024; Yu et al., 2026）。这些酵母在促进果酒香气形成中的既定作用，为本次菌株分离结果提供了有力佐证（Pyne et al., 2023）。

【数据】P15鉴定：H. uvarum，相似度99.9%；J11鉴定：P. kudriavzevii，相似度99.8%；系统发育树：邻接法，1000次自举；引物：NL1/NL4；J11抑制浓度：3%（w/v）混合酸；P15与C12存活浓度：9%–12%（w/v）

#### 3.1.3 环境胁迫条件下的生长

菌株的温度耐受性见图3A。酿酒酵母C12生长范围最广（15°C–35°C），最适温度为35°C，符合典型啤酒酵母特征（Contreras-Ruiz et al., 2023）。P. kudriavzevii J11最适生长温度为15°C–25°C（峰值25°C）；该较低温度范围可增强挥发性酯类的产生和保留，提高香气复杂性（Xu, Zhao, et al., 2024）。H. uvarum P15在15°C至35°C范围内生长，25°C达到峰值，这与水果发酵初期温度一致，有利于关键香气酯类的合成（Deng et al., 2025）。

图3B显示，各酵母菌株的pH耐受性差异显著（p < 0.05）。H. uvarum P15表现出卓越的耐酸能力，即使在pH 1.5时仍维持大量生物量，细胞密度随pH升高而比例增加。酿酒酵母C12在低pH下初始生长较差，但在pH ≥ 2.5时迅速恢复，表明具有较强的适应性恢复能力。P. kudriavzevii J11对酸最敏感，仅在pH > 4.5时实现显著生长，且在整个过程中显著劣于其他菌株（p < 0.05）。虽然这些光密度测量证明了H. uvarum P15在极端酸性条件下维持代谢活性和生物量的能力，但确认这是否代表pH 1.5下的活跃对数分裂，需要进一步的时程生长曲线分析。然而，已确认的耐受性表明，H. uvarum P15可以在高酸环境中快速启动发酵，与其温度适应的产香特性协同，实现独特的发酵效果（Zhang, Wang, et al., 2025）。

图3C显示了这些菌株在测试范围内糖耐受性的显著差异。在5%–10%糖浓度下生长相似。超过此范围后，酿酒酵母C12和H. uvarum P15的OD600逐渐下降，但后者保持最高值，表明其糖耐受性更强，具有生长优势。相比之下，P. kudriavzevii J11急剧下降（p < 0.05），表明高糖耐受性差。H. uvarum P15的高糖耐受性，加上其固有的耐酸性和产香能力，使其特别适合作为高糖、高酸度发酵的起始菌株，在早期贡献丰富的酯类和其他香气物质（Simon Sola et al., 2024）。

乙醇耐受性见图3D。随着乙醇浓度从2%增加至12%，所有菌株均受到不同程度抑制。酿酒酵母C12在整个过程中生长最强，在≥6%乙醇时具有显著优势（p < 0.05）。P. kudriavzevii J11表现出中等耐受性，逐渐下降。H. uvarum P15在2%乙醇时生长最佳，表明在温和条件下适应良好；然而，其生长在更高浓度下急剧下降。

【数据】C12生长范围：15°C–35°C（最适35°C）；J11最适：15°C–25°C（峰值25°C）；P15生长范围：15°C–35°C（峰值25°C）；P15最低存活pH：1.5；J11最低生长pH：>4.5；糖耐受范围：5%–30% w/v；乙醇耐受范围：2%–12% v/v；C12乙醇优势：≥6%（p < 0.05）

3.2 菠萝酒发酵过程中的主要参数变化

（注：原文此处对应图4，展示SF、CC、CJ、CP和CM五组菠萝酒发酵过程中主要参数的变化情况。）

【数据】发酵组：SF（自然发酵）、CC（C12单独）、CJ（C12+J11顺序）、CP（C12+P15顺序）、CM（C12+P15:J11=1:1顺序）

3.3 不同发酵组菠萝酒挥发性风味化合物（VFCs）比较分析

（注：原文此处对应图5，展示不同发酵组菠萝酒VFCs谱的比较分析——(A) VFCs组成和比例；(B) VFCs热图（以2-辛醇当量半定量）；(C) 差异分析。）

【数据】半定量内标：2-辛醇当量

3.4 不同发酵组菠萝酒酵母计数

（注：原文此处对应图6，展示不同发酵组菠萝酒中(A)非酿酒酵母计数和(B)酿酒酵母计数。）

【数据】计数方法：YPD琼脂（总酵母）、赖氨酸琼脂（非酿酒酵母）；C12 = 差值法

3.5 不同发酵组菠萝酒色泽与感官评分

（注：原文此处对应图7，展示不同发酵组菠萝酒的(A)外观和(B)总感官评分箱线图。FP代表菠萝汁。）

【数据】感官评分：5分制，多次重复；统计：Duncan检验，p < 0.05

3.6 不同发酵组菠萝酒抗氧化活性

（注：原文此处对应图8，展示不同发酵组菠萝酒的(A)总抗氧化能力、(B)•OH清除活性和(C)DPPH清除活性。）

【数据】总抗氧化能力：26.37 ± 0.87 mmol TE/L（CP组）；统计：Duncan检验，p < 0.05

3.7 H. uvarum P15的转录组分析与功能注释

（注：原文此处对应图9，对H. uvarum P15进行转录组分析和功能注释。样品：CP2.1、CP2.2、CP2.3（CP组发酵第2天的三个生物学重复）。(A1)基因表达分布；(A2)差异表达基因（DEGs）：CP2.1 vs CP2.2；(A3) DEGs：CP2.1 vs CP2.3。）

【数据】样品：CP2.1、CP2.2、CP2.3（CP组第2天，三个生物学重复）

3.8 发酵酵母的比较转录组分析

（注：原文此处对应图10，比较转录组分析。样品命名为[组][天].[重复]（如CC1.1、CP2.3）。(A)表达分布；(B)样品间相关性热图；(C)主成分分析（PCA）；(D)差异表达基因统计；(E)后续功能富集。）

【数据】样品命名规则：[组][天].[重复]；分析方法：PCA、相关性热图、DEGs统计

3.9 酿酒酵母C12差异表达基因的功能富集分析

（注：原文此处对应图11，对酿酒酵母C12的差异表达基因进行功能富集分析。(A)富集最显著的20个Gene Ontology条目；(B)富集最显著的30条KEGG通路。气泡图中，圆圈大小与通路中富集的DEGs数量成正比；颜色表示富集q值。）

【数据】富集分析：GO（Top 20）、KEGG（Top 30）；气泡图：大小=DEGs数，颜色=q值

3.10 CC和CP组发酵过程中VFC动态分析

（注：原文此处对应图12，分析CC和CP组发酵过程中的VFC动态。样品命名为[组][天]（如CC1、CP2）。(A)VFC组成和丰度热图（2-辛醇当量）；(B)VFC类别的提琴图；(C)主成分分析（PCA）；(D)层次聚类热图。）

【数据】样品命名：[组][天]；半定量：2-辛醇当量；分析方法：PCA、层次聚类

讨论与解读

本研究通过系统筛选具有显著产香能力和酸耐受性的非酿酒酵母，并实施顺序接种策略优化其与酿酒酵母的共发酵，旨在提升高酸菠萝酒的风味特征并阐明其协同机制。通过靶向筛选获得H. uvarum P15，其具有优异的产香特性（典型果香-酒香特征）和对高酸、高糖胁迫的突出耐受性。发酵实验表明，与酿酒酵母C12的顺序接种显著改善了菠萝酒的感官复杂性和整体和谐度。整合生理学和多组学分析揭示，这种共发酵不仅大幅丰富了VFCs的组成，特别是酯类和萜烯类，还驱动了酿酒酵母的代谢重编程。风味组学结果表明，该组合形成了以芳樟醇和己酸乙酯等关键VFCs为特征的独特香气特征。转录组学进一步揭示，H. uvarum P15通过微生物互作系统性地调控了酿酒酵母C12的核心代谢网络，包括上调丙酮酸代谢、氨基酸降解和萜烯骨架生物合成等关键通路。这种调控将中心代谢节点（如乙酰-CoA）的通量重新导向有益VFCs的生物合成。

【编译者解读】 该研究的方法论亮点在于"先筛菌、再配菌、后解析"的完整链条——从复杂来源中锁定一株兼具耐酸与产香双重特性的H. uvarum P15，再通过顺序接种策略规避了菌株间的竞争抑制。转录组与风味组学的联合分析，将微生物互作与代谢物积累直接关联，为高酸水果发酵提供了可推广的理性设计范式。值得注意的是，pH 1.5下维持生物量的能力虽已证实，但作者也坦承需进一步确认是否真正进行对数分裂，这种严谨态度值得借鉴。后续研究若能解析P15分泌的具体信号分子，或将推动菌间互作机制从"关联"走向"因果"。

参考来源

Sun Q. Flavour-enhancement mechanisms in pineapple wine revealed by sequential inoculation of an aroma-active, acid-tolerant Hanseniaspora uvarum with Saccharomyces cerevisiae. Food Research International, 2026. DOI: 10.1016/j.foodres.2026.119127

DOI: 10.1016/j.foodres.2026.119127