来源：Rewiring metabolism and restoring sterol homeostasis for overproduction of campesterol in Saccharomyces cerevisiae（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
菜油甾醇是降胆固醇候选分子，也是合成高价值甾体药物的重要中间体。然而，传统从植物中提取的方式受制于植物生长周期长、提取效率低且产物为混合植物甾醇等问题。本研究通过筛选异源7-脱氢胆固醇还原酶、重构半乳糖诱导表达系统、分区优化前角鲨烯与后角鲨烯途径、系统改造碳代谢以扩充乙酰-CoA池，并最终恢复甾醇稳态，在5 L生物反应器中实现了5884.0 mg/L的菜油甾醇产量，为甾醇类化合物的微生物高效合成提供了系统性策略。
研究背景
菜油甾醇是一种麦角甾烷型甾醇，与真菌来源的麦角甾醇结构相似，在调节植物膜流动性和通透性方面发挥重要作用，同时也是植物激素油菜素内酯的合成前体。近年来研究发现，菜油甾醇还具有抗菌、抗癌和抗心血管疾病等多种生理功能，并在高附加值甾体药物的合成中扮演关键中间体角色。
目前菜油甾醇的生产主要依赖从植物油中提取，但植物生长周期长、种植规模受限，且提取效率低，所得产物多为植物甾醇混合物，不利于后续生理活性研究。合成生物学的兴起为利用微生物从头合成菜油甾醇提供了替代方案。酿酒酵母天然具有麦角甾醇合成途径，通过敲除内源ERG5基因并引入7-脱氢胆固醇还原酶（DHCR7），即可使酵母产生菜油甾醇而非麦角甾醇。然而，天然麦角甾醇合成途径虽为从头生物合成提供了便利，菜油甾醇的合成途径冗长且酵母中甾醇水平受到严格调控，导致产量通常极低。
研究方法
2.1 化学试剂
本研究使用的试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，除非另有说明。菜油甾醇标准品和鲑鱼精DNA钠盐（单链DNA，ssDNA）购自北京索莱宝科技有限公司。角鲨烯标准品购自上海麦克林生化科技有限公司。去氢胆固醇标准品购自上海源叶生物科技有限公司。2 × Phanta Max Master Mix（Dye Plus）和一步克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。所有限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自宝生物工程（大连）有限公司。
【数据】试剂来源：生工生物、索莱宝、麦克林、源叶、诺唯赞、宝生物；标准品：菜油甾醇、角鲨烯、去氢胆固醇
2.2 菌株与培养基
酿酒酵母菌株CEN.PK2-1C（MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3Δ1 MAL2-8C SUC2）作为初始菌株。大肠杆菌JM109用于质粒构建、保存和扩增。酵母在YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中培养，并在SD培养基（20 g/L葡萄糖、6.7 g/L无氨基酸YNB、0.15 g/L缬氨酸、0.03 g/L赖氨酸、0.05 g/L苯丙氨酸、0.2 g/L苏氨酸、0.03 g/L酪氨酸、0.02 g/L甲硫氨酸、0.03 g/L异亮氨酸、0.02 g/L精氨酸、0.02 g/L腺嘌呤硫酸盐）中筛选，必要时添加0.1 g/L亮氨酸、0.02 g/L组氨酸、0.04 g/L色氨酸、0.02 g/L尿嘧啶或1 g/L 5-氟乳清酸。大肠杆菌JM109在Luria-Bertani培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中培养。本研究所用工程酵母列于表1。
【数据】初始菌株：CEN.PK2-1C；YPD培养基：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖；SD培养基：20 g/L葡萄糖、6.7 g/L YNB、多种氨基酸补充物
2.3 质粒构建
制备了四个质粒（pY26-URA、pESC-LEU、pUC19和pCRCT），用于构建基因表达盒、供体DNA质粒和基因编辑质粒。酵母内源基因从CEN.PK2-1C基因组中扩增获得。外源基因由无锡天乐生物科技有限公司合成并进行密码子优化，其序列见表S1。所有表达质粒和基因编辑质粒均通过克隆组装或T4连接法构建。
【数据】质粒：pY26-URA、pESC-LEU、pUC19、pCRCT；外源基因合成与密码子优化：无锡天乐生物
2.4 酵母转化与菌株构建
采用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因敲除和整合。pCRCT质粒用于构建Cas9和sgRNA的表达盒。本研究中所有sgRNA均通过在线网站（https://www.e-crisp.org/E-CRISP/）设计。酵母转化采用PEG/ssDNA/LiAc法。阳性转化子在SD平板上筛选，随后通过PCR和DNA测序确认。
【数据】基因编辑系统：CRISPR/Cas9；转化方法：PEG/ssDNA/LiAc；sgRNA设计：e-crisp在线网站
2.5 5 L生物反应器中菜油甾醇生产
将工程酵母接种到含10 mL YPD培养基的50 mL摇瓶中，于30 ℃、220 rpm条件下过夜培养，获得一级种子液。将2%的一级种子液转接至含50 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，于30 ℃、220 rpm条件下过夜培养，获得二级种子液。再将2%的二级种子液接种至含100 mL YPD培养基的500 mL摇瓶中，于30 ℃、220 rpm条件下过夜培养，获得三级种子液。随后将10%的三级种子液接种至含2 L YPD培养基（含30 g/L葡萄糖）的5 L生物反应器中，于30 ℃下培养。通风速率和初始转速分别控制在2 vvm和300 rpm。溶解氧维持在25%。使用NH4OH将培养基pH控制在5.5 ± 0.1。初始补料速率为5 mL/h。补料培养基含400 g/L葡萄糖、18 g/L KH2PO4、10.24 g/L MgSO4·7H2O。
【数据】培养温度：30 ℃；转速：220 rpm（摇瓶）/300 rpm（反应器初始）；通风速率：2 vvm；溶解氧：25%；pH：5.5 ± 0.1；初始补料速率：5 mL/h；补料培养基：400 g/L葡萄糖、18 g/L KH2PO4、10.24 g/L MgSO4·7H2O；接种比例：2%→2%→10%
2.6 提取与分析方法
发酵完成后，取适量发酵液测定OD600。取800 μL酵母细胞培养液于2 mL离心管中，12000 rpm离心10 min。弃去上清液，加入800 μL KOH-乙醇溶液（20%（w/v）KOH，50%（v/v）乙醇）。混合物在金属浴中于80 °C皂化4 h。随后加入800 μL正己烷，剧烈振荡提取20 min。混合物经12000 rpm离心10 min，取上层有机相进行HPLC检测。样品通过HPLC（岛津，日本）分析，配备C-18色谱柱（5 μm，4.6 mm × 250 mm，岛津）。以甲醇/乙腈（80:20，v/v）为流动相，洗脱速率1 mL/min，运行23 min，检测波长208 nm。气相色谱-质谱联用（GC-MS）检测仪器为EXPEC 5231，配备DB-5MS气相色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）。温度程序：初始180 °C保持0.5 min，然后以15 °C/min升至300 °C并保持15 min。进样口温度设为250 °C。电离采用电子电离（EI）模式，70 eV。MS扫描范围35至450 m/z。氦气流速恒定为1.0 mL/min。样品进样体积为1 μL。
【数据】皂化条件：80 °C、4 h、20% KOH/50%乙醇；提取：正己烷振荡20 min；HPLC：C-18柱、甲醇/乙腈80:20、1 mL/min、23 min、208 nm；GC-MS：DB-5MS柱、180 °C保持0.5 min后15 °C/min升至300 °C保持15 min、EI 70 eV、扫描35-450 m/z、氦气1.0 mL/min、进样1 μL
2.7 Nile Red染色
取20 μL细胞培养液转移至1.5 mL EP管中，用超纯水洗涤两次以去除残留培养基。随后将细胞重悬于30 μL Nile Red溶液（10 μmol/L，溶于DMSO）中，于30 °C避光孵育20 min。孵育后，用超纯水洗涤细胞两次以去除过量Nile Red染料。最后使用激光扫描共聚焦显微镜（Nikon Eclipse Ti2）观察脂滴，激发/发射波长设为552/636 nm。
【数据】Nile Red浓度：10 μmol/L（DMSO）；孵育：30 °C、20 min、避光；激发/发射波长：552/636 nm；仪器：Nikon Eclipse Ti2
研究结果
3.1 改造半乳糖调控系统实现菜油甾醇从头生物合成
菜油甾醇是酿酒酵母中的非天然甾醇，需要引入外源7-脱氢胆固醇还原酶来构建人工合成途径（图1）。首先比较了几种已报道的7-脱氢胆固醇还原酶：来自非洲爪蟾的XlDHCR7、来自斑马鱼的DrDHCR7、来自低眼巨鲶的PhDHCR7和来自马铃薯的StDWF5（图S1）。经密码子优化后，这些7-脱氢胆固醇还原酶在pY26质粒上的强组成型启动子PGAP控制下表达，构建菌株CY01-1至CY01-4。菜油甾醇的生成通过质谱确认（图S2）。XlDHCR7在菜油甾醇生产中表现最佳，获得14.4 mg/L的菜油甾醇产量（图2A）。该基因被用于菜油甾醇生产。
在发酵早期，甾醇的过量积累会影响菌株生长。菌株CY01-4的OD600较对照降低了25%。为了将菜油甾醇的合成与菌株生长解耦，选择半乳糖诱导（GAL）启动子来表达XlDHCR7（图S3）。首先敲除GAL80基因，并在GAL80基因位点引入额外的GAL4表达盒，从而在低葡萄糖浓度下即使没有乳糖诱导也能实现GAL启动子控制下基因的高效转录。随后，将XlDHCR7基因在PGAL7启动子控制下整合到ERG5基因位点，以抑制竞争性麦角甾醇的积累。菌株CY02-1获得更高的菜油甾醇产量34.6 mg/L。为进一步增强XlDHCR7的高效表达并减少其他GAL启动子对GAL4的竞争，敲除了GAL1、GAL7和GAL10基因以构建菌株CY02-2，菜油甾醇产量提高至40.6 mg/L（图2B）。
然而，这些产量尚不足以证明微生物生产菜油甾醇的优越性，因此需要进一步的代谢工程改造。
【数据】XlDHCR7最优产量：14.4 mg/L；CY01-4的OD600较对照降低25%；CY02-1产量：34.6 mg/L；CY02-2产量：40.6 mg/L
3.2 重构合成途径实现菜油甾醇两阶段生产
为确定从乙酰-CoA到菜油甾醇合成途径中的关键限速酶，使用质粒pY15在菌株CY02-2中增强途径酶的表达（图3A）。值得注意的是，tHMG1（HMGR1的截短形式）的过表达显著提高了菜油甾醇产量。此外，ERG19/IDI1/ERG20/ERG9/ERG3等酶的单独过表达也能促进菜油甾醇的积累。考虑到组合过表达的优势，将上述关键酶和一些已报道的关键途径酶进行了过表达。ERG1、ERG7和ERG11的过表达导致菜油甾醇产量下降。最终菌株CY02-8获得了最高菜油甾醇产量，达到172.6 mg/L（图3B）。
通过GC-MS分析菌株CY02-8的发酵产物组成，发现菜油甾醇仅占总甾醇的41.4%（图S4）。代谢途径的不平衡导致中间甾醇过度积累，表明有必要进行系统性的代谢工程改造。
菜油甾醇的复杂生物合成途径分为两部分：前角鲨烯生物合成和后角鲨烯生物合成。前角鲨烯途径从乙酰-CoA到角鲨烯，后角鲨烯途径从角鲨烯到菜油甾醇。使用组成型启动子重构了由9个途径酶组成的前角鲨烯合成模块（图4A）。首先增强限速酶tHMG1和IDI1的表达以构建菌株CY03。菌株CY03的菜油甾醇产量为134.8 mg/L，是CY02的2.9倍（图4B）。随后连续增强角鲨烯合成途径的每一步以提高菜油甾醇产量。ERG10/ERG13和ERG12/ERG8的过表达对提高菜油甾醇产量影响甚微（图4B）。额外增加一个拷贝的tHMG1和ERG19（菌株CY06）使菜油甾醇产量达到155.8 mg/L。当整个角鲨烯合成途径的过表达得到增强时（菌株CY07在菌株CY06基础上过表达ERG20和ERG9），菜油甾醇产量显著提高至205.3 mg/L，较对照菌株CY02提高了493.4%（图4B）。同时引入额外拷贝的tHMG1和IDI1构建菌株CY08，但菜油甾醇产量下降。通过GC-MS分析菌株CY07的发酵产物组成，菜油甾醇占总甾醇的比例提高至82.7%（图S4）。这表明前角鲨烯合成模块的重构对后角鲨烯途径中甾醇合成的串扰影响很小。然而，菌株CY07积累了918.1 mg/L的角鲨烯（图4C），表明后角鲨烯途径仍需进一步改造。
后角鲨烯途径在菜油甾醇核的形成和修饰中起关键作用。ERG1作为该途径的限速酶，对酵母内源麦角甾醇生物合成至关重要（图5A）。与前角鲨烯途径不同，后角鲨烯途径产生的产物主要为亲脂性且具有细胞毒性。因此，采用GAL启动子增强后角鲨烯模块途径中酶的表达，以促进菜油甾醇的两阶段生产。为区分ERG1催化的2,3-环氧角鲨烯形成与前角鲨烯合成模块，分别使用组成型启动子PPGK1和半乳糖诱导型启动子PGAL1在菌株CY07中增强ERG1的表达，构建菌株CY09-1和CY09-2。使用PGAL1构建的菌株CY09-2菜油甾醇产量为284.1 mg/L，高于使用PPGK1构建的菌株CY09-1（图5B）。与对照菌株CY07相比，菌株CY09-2的菜油甾醇产量提高了38.4%。随后，后角鲨烯途径中的关键酶均通过半乳糖诱导型启动子过表达。ERG7和ERG11是参与羊毛甾醇合成和代谢的关键酶，羊毛甾醇通过2,3-氧化角鲨烯环化形成初始甾醇核结构。使用PGAL1和PGAL10启动子进一步过表达ERG7和ERG11，构建菌株CY10，产量为249.7 mg/L菜油甾醇（图5B）。菜油甾醇产量略有下降，同时观察到副产物去氢胆固醇的积累（图5C）。此外，ERG2和ERG3的过表达导致副产物去氢胆固醇明显积累，菜油甾醇产量持续下降（图5B、C）。推测异源酶DHCR7缺乏底物特异性可能是造成这一现象的原因，因为它可能同时以胆甾-5,7,24-三烯-3-醇和麦角甾-5,7-二烯醇为底物。通过利用GAL启动子持续增强ERG6和ERG4的表达（菌株CY12），去氢胆固醇产量显著下降（图5B、C），菜油甾醇产量提高至403.3 mg/L（图5B）。后角鲨烯途径中游模块的表达持续增强，构建了菌株CY13和CY14。菜油甾醇产量持续增加，菌株CY14达到510.1 mg/L菜油甾醇（图5B）。同时，去氢胆固醇水平也相应降低。
【数据】CY02-8产量：172.6 mg/L；菜油甾醇占比：41.4%（CY02-8）；CY03产量：134.8 mg/L（CY02的2.9倍）；CY06产量：155.8 mg/L；CY07产量：205.3 mg/L（较CY02提高493.4%）；CY07菜油甾醇占比：82.7%；CY07角鲨烯积累：918.1 mg/L；CY09-2产量：284.1 mg/L（较CY07提高38.4%）；CY10产量：249.7 mg/L；CY12产量：403.3 mg/L；CY14产量：510.1 mg/L
讨论与解读
讨论
由于菜油甾醇合成途径冗长且酿酒酵母中甾醇水平受到严格调控，菜油甾醇的产量通常极低。目前微生物细胞工厂的生产水平仍不足以满足工业应用需求。本研究通过重构代谢和恢复甾醇稳态实现了酿酒酵母中菜油甾醇的高产。前角鲨烯和后角鲨烯途径被重构以实现菜油甾醇的两阶段合成。碳代谢被系统改造以扩充乙酰-CoA库。随后通过恢复甾醇稳态，工程菌株在5 L生物反应器中达到最高菜油甾醇产量5884.0 mg/L。总体而言，本研究通过多维代谢工程策略实现了菜油甾醇的高效合成，展示了显著的应用价值。
模块化改造策略已广泛应用于甾醇化合物的微生物合成。Guo等人通过重排后角鲨烯模块酶的亚细胞定位来缓解代谢瓶颈并提高7-脱氢胆固醇产量。Xiu等人在脂滴上重构后角鲨烯模块，使7-DHC产量提高了28.7%。然而，目前尚无关于前角鲨烯和后角鲨烯途径联合调控的报道。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于"两阶段生产"策略——将细胞生长与产物合成在时间上解耦，既避免了甾醇积累对菌株生长的抑制，又充分利用了GAL启动子的可诱导特性。从14.4 mg/L到5884.0 mg/L的产量提升跨度超过400倍，体现了系统性代谢工程的累积效应。不过，原文讨论部分也暗示DHCR7底物特异性不足导致副产物积累的问题，这提示酶工程改造（如定向进化）可能是进一步提升产物纯度的突破口。此外，5 L反应器的成功放大为工业应用奠定了基础，但补料策略和甾醇稳态恢复之间的定量关系仍有待深入研究。
参考来源
Liu W. Rewiring metabolism and restoring sterol homeostasis for overproduction of campesterol in Saccharomyces cerevisiae. Chemical Engineering Journal, 2025. DOI: 10.1016/j.cej.2025.163686
DOI: 10.1016/j.cej.2025.163686