重离子束辐照酿酒酵母的突变谱特征及其对剂量和胞内状态的依赖性

来源：Heavy ion beam irradiation-induced mutational profiles in Saccharomyces cerevisiae and their dependencies on dose and intracellular state inform an enhanced microbial breeding strategy（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：代谢通路设计

导读

重离子束（HIB）辐照凭借高传能线密度和宽突变谱，已在微生物诱变育种中显示出独特优势。本研究以酿酒酵母S288c为模型，系统解析了中、高剂量HIB辐照诱导的全基因组突变特征，并首次从转录活性角度探讨了基因表达水平与突变易感性的关联。更关键的是，研究者将辐照与渗透胁迫偶联，通过调控辐照时的胞内状态，使耐渗透压突变体的获得比例从11.43%提升至27.62%。该策略为理性设计高效微生物育种方案提供了新依据。

研究背景

重离子束辐照生物体是一个从离子入射到诱导生物学效应的复杂过程，涉及动量传递、能量-质量转换和电荷交换。由于具有高传能线密度（LET）、增强的相对生物学效应（RBE）和宽突变谱，HIB辐照已成功应用于微生物诱变育种，获得了跨越至少30个属、100多个物种的大量优良突变菌株，应用覆盖制药、食品加工、工业生产和能源技术等领域。例如，Satoh等人（2024）利用碳离子辐照选育出在36°C下生长优良的耐热根瘤菌突变体；Dong等人（2022）获得两株长枝木霉纤维素酶高产突变体，滤纸酶活分别提高46.91%和35.5%；Jiang等人（2018）通过碳离子束辐照开发了一株嗜热乳酸杆菌突变体，L-乳酸产量提高16.2%。与传统诱变技术相比，HIB辐照诱变育种在成功率、效率和成本效益方面具有明显优势。

然而，以往关于HIB辐照诱变特征的研究多依赖于人工筛选的突变体，难以客观衡量诱变强度，且往往局限于特定性状或单个突变体，缺乏群体层面的代表性。辐射剂量与胞内状态如何共同塑造突变结果，仍是悬而未决的问题。

研究方法

2.1 菌株培养与辐照处理——随机突变体的获得

选用酿酒酵母S288c（MATα SUC2 gal2 mal2 mel flo1 flo8–1 hap1 ho bio1 bio6）作为微生物细胞模型，该菌株保藏于美国典型培养物保藏中心，编号ATCC 204508。YPD液体培养基成分为2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物，固体培养基另含2%琼脂。将冻存菌种接种至新鲜YPD培养基中，在30°C、200 rpm振荡条件下连续传代两次以活化细胞。收集活化后的对数期细胞，离心弃去培养基，将细胞重悬于生理盐水中，孵育3 h后进行HIB辐照。在生理盐水（寡营养条件）中辐照的优势已在前期研究中得到证实——可缓解对照组与辐照组之间因增殖速率不平衡引起的存活率时间依赖性波动，且生理盐水状态对细胞损伤-修复-突变过程的影响在辐照后120 min内可逆。

将细胞悬液分装至直径35 mm的培养皿中，液层厚度约2.5 mm。使用兰州重离子研究装置提供的碳离子束进行辐照，剂量设为0、30、60、90、120、150、180和210 Gy。12C6+离子到达样品时能量约为76.37 MeV/u，在水中的穿透深度约16 mm，Bragg峰位于约15.5 mm处，束斑完全覆盖样品。辐照后，细胞转移至新鲜YPD培养基中，采用补料分批方式维持对数期状态培养4 h，以进行损伤修复。

【数据】菌株：S. cerevisiae S288c (ATCC 204508)；培养基：YPD（2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物）；培养条件：30°C、200 rpm；辐照前处理：生理盐水重悬孵育3 h；辐照剂量：0–210 Gy；离子能量：76.37 MeV/u；液层厚度：约2.5 mm；修复时间：4 h

2.2 平板计数法与96孔微量板法同步测定剂量-存活率

将辐照组和对照组的细胞悬液分别进行10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶系列稀释。每个稀释度取200 µL涂布于平板培养基，培养48 h。每组每个稀释度设5个重复。选择菌落数适中（数十至100个）的平板进行计数。存活率以辐照组与对照组的菌落形成单位之比计算。

采用Guo等人（2018, 2024a）先前提出的96孔微量板法对存活率进行验证。将辐照组和对照组细胞悬液按相同比例稀释至约60个细胞/mL（辐照组悬液包含存活和死亡细胞）。取1 mL稀释悬液等分至含200 µL YPD培养基的96孔板中，30°C孵育48 h后，含有活细胞的孔形成沉淀菌落，活细胞比例越高，无沉淀菌落的孔数越少。根据泊松分布原理，1 mL悬液中的活细胞数按公式N = 96 × ln(96/x)计算，其中N为活细胞数，x为无沉淀菌落的孔数。

【数据】稀释倍数：10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶；涂布量：200 µL/平板；培养时间：48 h；重复数：5；细胞密度：约60 cells/mL；孔板培养：200 µL YPD/孔，30°C，48 h；计算公式：N = 96 × ln(96/x)

2.3 随机分离株的收集与全基因组变异检测

辐照后，细胞在固体平板培养基上培养至菌落形成。不经人工筛选，随机挑取单菌落，接种至YPD培养基中纯化，获得分离株。90 Gy辐照后，本研究初步选取12株。突变鉴定发现其中4株零突变，因此补充随机选取5株。从120–210 Gy范围内的4个剂量点各选12株。为进一步验证，从常用育种剂量组（150 Gy）额外随机选取36株，随机分为3组，每组样本量与上述各组相当，用于验证高、中剂量比较结果及评估样本量为12时的分组稳定性。最终共65个随机分离株进行后续分子突变分析。

每个分离株使用E.Z.N.A. Yeast DNA Kit（Omega Bio Tek, Inc.）按说明书提取总DNA。全基因组测序在Illumina HiSeq™ X10平台完成。原始数据经标准Illumina流程处理获得clean reads。使用Burrows-Wheeler Aligner工具（v.0.7.17）和SAMtools（v.1.21）将clean reads比对至参考基因组（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000146045.2）。通过SAMtools的depth输出命令获取各基因组位置的测序深度和全基因组read覆盖度，平均read覆盖深度为100X。使用Picard的Mark Duplicates功能去除PCR引入的重复。使用GATK（v4.0）进行局部重比对和碱基质量分数校正，随后调用SNP和Indel并初步过滤。结构变异（SV）使用BreakDancer软件检测。

有效变异相对于参考基因组的筛选参数设置为：SNP支持read数超过全基因组平均值的75%，Indel为50%，等位基因频率约等于1。获得相对于参考基因组的有效突变位点后，按以下标准鉴定HIB辐照真正诱导的突变：所有菌株共有的突变位点视为背景突变予以排除；仅存在于极少数突变体中的突变位点予以保留；若某突变位点在极少数突变株中缺失但为绝大多数菌株共有，则判定该位点在这少数菌株中发生了突变，其余菌株未突变。换言之，若突变a

最终确认的HIB辐照诱导突变使用SnpEff（v.5.1）进行注释。

【数据】测序平台：Illumina HiSeq™ X10；平均覆盖深度：100X；比对工具：BWA v.0.7.17 + SAMtools v.1.21；变异检测：GATK v4.0；SV检测：BreakDancer；筛选参数：SNP支持read > 75%均值，Indel > 50%均值；等位基因频率：约1；突变体总数：65

2.4 基于野生型酿酒酵母S288C全转录组分析评估突变相关基因相对可比背景基因的表达水平

为探究基因转录活性与HIB辐照诱导突变频率之间的潜在关系，本研究检测了酿酒酵母S288c在YPD培养基（正常培养状态）和生理盐水状态（与辐照时条件一致）下的转录组。两种条件下的细胞经离心收集，PBS缓冲液洗涤，液氮速冻。每组设3个生物学重复，使用Yeast Column Total RNA Purification Kit（Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.）提取RNA。

【数据】RNA提取试剂盒：Yeast Column Total RNA Purification Kit；生物学重复：3；检测条件：YPD培养基 + 生理盐水状态

研究结果

3.1 不同剂量HIB辐照诱导的酿酒酵母存活率

采用平板计数法测定了不同剂量HIB辐照后酵母的存活率。如图2a所示，细胞存活率随辐照剂量增加而降低。酿酒酵母在0–100 Gy剂量范围内对HIB辐照相对敏感；超过100 Gy后，细胞对辐照的响应变得不那么明显，与先前报道的结果一致。半致死剂量约为90 Gy，存活率10%–40%对应的剂量落在120–210 Gy范围内。据此，将90 Gy定义为中剂量，120–210 Gy定义为高剂量用于后续研究。

为验证平板计数结果，同时采用96孔微量板法测定存活率（图2b）。如图2c所示，随着测试悬液中细胞密度降低，出现扩增菌落的孔数减少，无菌落形成的孔数增加，呈现明确的剂量依赖性。基于96孔板浊孔数计算的存活率与平板计数法结果趋势一致。此外，中/高剂量与低剂量辐照组之间的存活率差异显著（p < 0.05）（图2b）。

【数据】半致死剂量：约90 Gy；存活率10%–40%对应剂量：120–210 Gy；显著性：中/高剂量 vs 低剂量 p < 0.05

3.2 HIB辐照诱导的全基因组突变谱及中、高剂量比较

为客观表征HIB辐照在微生物中的诱变谱并探索转录活性对突变发生的影响，用90–210 Gy HIB辐照酿酒酵母细胞悬液。不经人工筛选，随机挑取单菌落并纯化。通过全基因组重测序检测随机分离株的全基因组突变，实现中、高剂量的比较分析，并从概率角度揭示基因表达水平与突变频率之间的潜在关联（图3）。

首先考察中、高剂量辐照诱导的全基因组突变特征。排除起始菌株相对于参考基因组的背景突变后，在65个突变株中共鉴定出169个突变，广泛分布于全部15条染色体上（图4a）。利用密度图进一步展示了这些突变位点物理分布的详细景观（图4b）。分析显示，在精细尺度上，突变沿染色体并非均匀分布，存在密集聚集区和稀疏区域。然而，任何特定位点的高频突变发生均不常见。仅在样本量较大的150 Gy组中，观察到3个突变频率大于5的位点。此外，不同剂量组之间的重叠突变位点极少。即使在突变基因水平上进行分析，这一结论依然成立（图4c和d）。这表明，对于任何给定的突变位点，不同剂量组之间的重叠概率并不显著高于平均突变频率。

高剂量辐照组（包括120–210 Gy范围内4个剂量的12株和150 Gy的36株）菌株的每基因组突变数为3.04，显著高于90 Gy辐照的17株（每基因组1.35个突变）（p < 0.05）（图5a）。采用酵母育种中常用的150 Gy剂量扩大样本量并验证可靠性。150 Gy HIB辐照后随机分离的36株分为3组，组间规模相当。150 Gy组突变位点数的中位数和均值均高于90 Gy组，组间差异显著（p < 0.05）。但150 Gy组与120–210 Gy组之间以及150 Gy组内各亚组之间均未观察到显著差异。这表明较高剂量具有更高的诱变频率，且12株亚群的突变数表现出相当好的稳定性。

进一步定量建模分析了突变位点在染色体上的分布。累积突变数对累积染色体长度的线性拟合显示，尽管如前所述在精细尺度上分布不均匀，但突变在染色体尺度上广泛分布。所有剂量组均表现出良好的拟合结果（图5b–d），高剂量组的R²值略高。这表明在较高剂量下，随着突变数增加，突变分布更倾向于缺乏染色体偏好性，且较高的辐照剂量有助于进一步拓宽诱变育种中基因选择的范围。

在所有突变体中，全基因组突变以单核苷酸替换为主，占全部突变的86.98%，颠换多于转换。Indel发生频率较低（13.02%），长度多为1–4 bp（图5e–g）。单核苷酸替换的转换/颠换（Ti/Tv）比为0.75（图5e），与先前在其他物种中报道的自发突变不同。这种差异可能归因于酵母的基因组背景和HIB辐照的特殊性质。单核苷酸替换未观察到碱基偏好性（图5f）——这不同于某些化学诱变剂（如碱基类似物）常在特定核苷酸位点诱导突变的特点。

突变位点及相关基因的功能注释显示，潜在生物学功能变异（如密码子改变、上游调控突变和错义突变）占全部突变的65%以上（图5h），表明辐照可诱导大量潜在功能变异。各剂量组的突变类型分布相似；然而，在读码框内（高剂量组）和移码（150 Gy组）突变仅在高剂量组中观察到而中剂量组中未出现，提示较高辐射剂量可能产生更丰富的突变类型谱。

【数据】总突变数：169；突变株数：65；高剂量组每基因组突变数：3.04；中剂量组（90 Gy）每基因组突变数：1.35；显著性：p < 0.05；单核苷酸替换占比：86.98%；Indel占比：13.02%；Ti/Tv比：0.75；功能变异占比：>65%；Indel长度：1–4 bp

3.3 突变位点相关基因在野生型菌株转录背景下的转录活性评估

从概率角度评估基因表达对突变发生的影响。具体而言，以原始酿酒酵母菌株在生理盐水条件下的转录组（与诱导随机突变时辐照期间的细胞环境一致）为背景。需要指出的是，尽管突变位点收集自随机突变群体，但表达数据来源于野生型菌株背景中的未突变基因。将突变位点相关基因的表达水平与可比背景基因集进行比较，涵盖90 Gy组、120–210 Gy组以及150 Gy组的3个亚组。箱线图显示，各组的平均值均高于中位数，甚至超过上四分位数，这一现象在可比背景基因的表达数据中尤为明显（图6A）。

由于均值易受离群值影响，采用中位数代表整体表达水平。对全部突变集、90 Gy组、120–210 Gy组以及150 Gy组的综合分析显示，突变位点相关基因的整体表达水平适度超过全基因组背景水平（p < 0.05）。

【数据】统计方法：中位数代表表达水平；显著性：突变相关基因表达 vs 基因组背景 p < 0.05

3.4 辐照与渗透胁迫偶联对耐渗透压突变体育种的影响

通过将HIB辐照与渗透胁迫偶联，在辐照期间诱导渗透调节相关基因高水平表达。各偶联处理组获得的耐渗透压突变体比例（平均27.62%）高于单独辐照组（11.43%）。推断与验证表明，仅凭早期选择压力无法完全解释这一提升，凸显了胞内状态的重要性。

与单独辐照相比，辐照-渗透胁迫偶联处理增加了突变在渗透可诱导的渗透调节相关基因中的分布。

【数据】偶联处理组耐渗透压突变体比例：平均27.62%；单独辐照组：11.43%

3.5 高耐渗透压突变体的表型特征与细胞生物学特性

在渗透胁迫条件下测定了细胞干重和葡萄糖消耗，用以指示各菌株的葡萄糖-to-生物量转化率。偶联处理产生了遗传稳定的高耐渗透压突变体，其突变协同调控碳代谢、离子稳态、细胞黏附和DNA复制。

【数据】测定指标：细胞干重、葡萄糖消耗、葡萄糖-to-生物量转化率

3.6 基于分子变异阐明优良耐渗透压菌株的突变机制

在性能最佳的耐渗透压菌株中鉴定出潜在功能突变位点，并利用IGV对变异进行了可视化确认。

【数据】验证工具：IGV可视化

讨论与解读

讨论要点

以往研究表明，辐射剂量是决定HIB辐照诱变效果的主要参数，而固有胞内状态（如染色质构象和DNA损伤修复模式）也可能显著影响诱变结果。然而，早期关于HIB辐照诱变特征的报道多依赖人工筛选突变体的表征，无法客观衡量诱变强度，且通常局限于特定性状或单个突变体，缺乏群体水平的代表性。本研究以酿酒酵母S288c为材料，采用中、高剂量HIB辐照，不经人工筛选随机挑取单菌落作为突变体，在群体水平上系统分析不同剂量诱导的突变谱，并结合转录组学从概率角度揭示基因转录活性与突变易感性的关系。研究发现，高剂量辐照的突变频率是中剂量的两倍以上，且不同剂量间重叠突变极少；突变位点相关基因的整体表达水平适度超过基因组背景水平。通过辐照与渗透胁迫偶联，渗透调节相关基因在辐照期间被诱导高表达，耐渗透压突变体获得比例显著提升。推断和验证表明，早期选择压力本身不能完全解释这一改善，胞内状态的重要性得以凸显。偶联处理产生的优良突变体在遗传上稳定，其突变协同调控碳代谢、离子稳态、细胞黏附和DNA复制。

编译者解读

本研究的价值在于把"辐照剂量"这一单一变量扩展为"剂量+胞内转录状态"的双维调控框架。方法上，不经人工筛选的随机突变体收集策略保证了突变谱统计的无偏性，而生理盐水辐照体系巧妙地消除了对照组与辐照组增殖速率差异带来的干扰。偶联渗透胁迫的策略尤其值得关注——它提示合成生物学育种中，辐照前对细胞进行目标代谢通路相关基因的转录预激活，可能是一种普适性的增变策略。一个潜在局限是，转录活性与突变易感性的关联目前仍停留在统计相关性层面，染色质构象变化这一中间环节尚缺乏直接实验证据。未来若能将Hi-C等染色质构象捕获技术与HIB诱变结合，有望从机制上进一步完善这一育种框架。

参考来源

Guo, X. Heavy ion beam irradiation-induced mutational profiles in Saccharomyces cerevisiae and their dependencies on dose and intracellular state inform an enhanced microbial breeding strategy. Journal of Biotechnology, 2026.

DOI: 10.1016/j.jbiotec.2025.12.015

DOI: 10.1016/j.jbiotec.2025.12.015