来源：Sequential co-fermentation of Pichia kluyveri and Saccharomyces cerevisiae enhances volatile complexity while retaining fermentation efficiency in wort（Applied Food Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
非酿酒酵母为啤酒风味多样化提供了天然途径。本研究从梅花中分离获得一株野生克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）TP1，系统评估其与商业酿酒酵母US-05在麦汁中的发酵性能与挥发性风味谱。结果显示，TP1虽无法利用麦芽糖和蔗糖、单独发酵乙醇产量仅约0.42% ABV，但采用提前48小时接种的顺序共发酵策略，可在保持终酒精含量（3.75% ABV）与US-05单菌发酵无显著差异的同时，显著提升乙酸酯类物质含量。HS-SPME-GC-MS鉴定出15种关键挥发性化合物，顺序共发酵啤酒中乙酸异戊酯和苯乙酸乙酯的相对气味活度值（rOAV）分别达4.61和2.45。主成分分析证实共发酵啤酒占据独特的协同风味空间。
研究背景
啤酒传统上由酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，上层发酵艾尔）和巴氏酵母（S. pastorianus，下层发酵拉格）两类酵母生产。经过数百年人工驯化，这些菌株具备高发酵效率、乙醇耐受性和优良的絮凝及风味特性，其遗传与表型性状已被精细调适于大规模一致性生产。近年来，精酿啤酒运动的全球兴起推动酿造实践发生范式转变，强调创新、本地化和风味多样性。消费者对新颖感官体验的追求促使精酿从业者探索非传统辅料及非酿酒酵母的使用。包括毕赤酵母属、 Brettanomyces、Torulaspora、 Hanseniaspora 等在内的非传统酵母，为啤酒风味创新提供了天然路径。
研究方法
2.1 酵母菌株
本研究所用酿酒酵母为商业艾尔酵母 Safale US-05（Fermentis，法国）。克鲁维毕赤酵母分离株 TP1 为本实验室从梅花中分离获得的野生酵母（Chen, Lo, Lu & Tsai, 2026）。
2.2 克鲁维毕赤酵母 TP1 的分子鉴定
野生酵母分离株的分类学身份通过内转录间隔区（ITS）和 26S 核糖体 DNA（rDNA）D1/D2 结构域的分子分析确认。使用 Genomic DNA Isolation Kit（FairBiotech Inc.，桃园，台湾）按制造商说明书提取基因组 DNA（Chen et al., 2026）。PCR 扩增使用 Taq DNA Polymerase 2x Master Mix RED（AMPLIQON，欧登塞，丹麦）。ITS 区使用通用引物 ITS-1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS-4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增。为进一步验证物种身份，26S rDNA D1/D2 结构域使用引物 NL-1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和 NL-4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）扩增。PCR 在 Thermal Cycler（Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, MA, USA）中进行，热循环程序如下：95°C 初始变性 30 秒；随后 35 个循环的 95°C 变性 1 分钟、55°C 退火 30 秒、70°C 延伸 1 分钟；最后 72°C 终延伸 10 分钟。所得扩增子进行测序，并使用 Basic Local Alignment Search Tool（BLASTn）与 NCBI 数据库比对以确认菌株。
【数据】引物：ITS-1/ITS-4、NL-1/NL-4；变性温度：95°C；退火温度：55°C；延伸温度：70°C；循环数：35；终延伸：72°C/10min
2.3 生长曲线测定
US-05 和 TP1 在 YPD 琼脂平板（1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖、1.5% 琼脂）上划线，30°C 培养 24–48 小时。挑取各菌株单菌落接种于 3 mL YPD 液体培养基，30°C、200 rpm 培养 24 小时。取 1 mL 培养物转接至 20 mL 新鲜 YPD，相同条件下再培养 24 小时。培养物用新鲜培养基稀释至 OD₆₀₀ 为 0.1，每 2 小时测定 OD₆₀₀ 监测生长。活菌数（CFU/mL）通过系列稀释和涂布平板测定。碳水化合物同化试验中，将 YPD 中 2% 葡萄糖替换为其他糖类：果糖、半乳糖、木糖、甘露糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖和纤维二糖。两种菌株以 10⁶ CFU/mL 接种于 2 mL 含单一糖源的培养基中，30°C、200 rpm 培养 24 小时。活菌数通过涂布于固体 YPD 评估。为区分共培养中的菌落，使用 WL 营养琼脂（Wallerstein Laboratory Nutrient Agar, Merck KGaA, Darmstadt, Germany；8.025% w/v）。该培养基含溴甲酚绿（BCG）作为 pH 指示剂：pH〈3.8 时为黄色，pH〉5.4 时为蓝色，pH 3.8–5.4 之间为绿色，可实现两菌株的视觉区分。
【数据】培养基：YPD（1%酵母提取物/2%蛋白胨/2%葡萄糖/1.5%琼脂）；培养温度：30°C；转速：200rpm；初始OD₆₀₀：0.1；接种量：10⁶CFU/mL；WL琼脂浓度：8.025% w/v；pH指示范围：〈3.8黄/3.8–5.4绿/〉5.4蓝
2.4 麦汁制备与接种
酿造麦汁使用 4 kg 粉碎的淡色大麦麦芽（Ireks Pale Ale Malt，德国）与 25 L 过滤水在 20-L Braumeister 系统（Speidels Braumeister，德国）中糖化制备。糖化程序起始于 43°C，随后在 64°C 进行 60 分钟的糖化休止，最后在 76°C 进行 10 分钟的灭酶（mash-out）阶段结束。过滤和用 5 L 热水（78°C）洗糟后，麦汁煮沸 60 分钟。酒花（28 g Cascade；Yakima Chief, WA, USA）在煮沸 45 分钟时添加。煮沸结束后，麦汁用不锈钢浸入式冷却器快速冷却至 25–28°C，并分为三个 5-L 发酵批次：（i）酿酒酵母 US-05 单菌发酵，（ii）克鲁维毕赤酵母 TP1 单菌发酵，（iii）顺序共发酵。顺序共发酵处理中，麦汁先用克鲁维毕赤酵母 TP1 预发酵 48 小时，再接种酿酒酵母 US-05。所有处理组的初始酵母接种密度统一为 10⁵ 细胞/mL。
【数据】麦芽用量：4kg；水：25L；糖化温度：43°C→64°C/60min→76°C/10min；洗糟水：5L/78°C；煮沸：60min；酒花：28g Cascade（煮沸45min时添加）；冷却温度：25–28°C；接种密度：10⁵细胞/mL；顺序共发酵间隔：48h
2.5 发酵监测与分析方法
发酵在 20°C 下进行 7 天，每组设三个生物学重复。每天无菌采集 20 mL 样品，用无菌生理盐水系列稀释后涂布于 YPD 和 WL 营养琼脂平板，监测种群动态和菌株活力。化学分析前，样品经超声处理 15 分钟脱气，4°C、5000 rpm 离心 20 分钟澄清。主要可发酵糖（葡萄糖、果糖、麦芽糖）浓度和酒精体积分数（ABV）使用 CDR BeerLab 分析仪（CDR，佛罗伦萨，意大利）测定。该酶促分光光度平台专为啤酒厂质量控制校准，并已对照官方 EBC（欧洲酿造公约）和 ASBC 参考方法验证，确保与传统 HPLC 和密度测定法高度相关。7 天主发酵结束后，嫩啤酒倒入消毒过的二级容器中去除酵母沉淀，装瓶后在 20°C 条件下陈酿 30 天。成熟样品用于最终挥发性风味谱分析（HS-SPME-GC-MS）和风味评价。
【数据】发酵温度：20°C；发酵时间：7天；取样量：20mL/天；超声脱气：15min；离心：5000rpm/20min/4°C；陈酿：20°C/30天
2.6 固相微萃取（SPME）
成熟啤酒的挥发性化合物使用 HS-SPME 配合聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB）纤维（Supelco, Bellefonte, PA, USA）萃取，参照已建立的方法（Balasubramanian & Panigrahi, 2011）。使用前，纤维在 GC 进样口 250°C 条件下预处理以去除残留污染物。每次萃取，取 5 mL 啤酒转移至 20-mL 琥珀色顶空瓶中，加入 1 µL 反式肉桂醛（≥98%，以己烷 1:100 稀释）作为内标（IS）。样品基质中内标终浓度为 2.0 ppm，用于归一化纤维吸附和检测器响应的变异。样品瓶立即密封，在 50°C 水浴中平衡 15 分钟。随后将 SPME 纤维暴露于顶空 30 分钟，确保不与液相直接接触。所有样品均进行三次重复分析。鉴于所有发酵处理均来自相同麦汁基质，挥发性浓度以相对丰度（归一化至内标）报告，以利于不同接种策略间的比较分析。
【数据】SPME纤维：PDMS/DVB；内标：反式肉桂醛1µL（1:100己烷稀释）；内标终浓度：2.0ppm；平衡温度：50°C/15min；萃取时间：30min；样品量：5mL
2.7 气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析
吸附的挥发性物质在 GC-MS 系统（Shimadzu GCMS-QP 2010 SE，日本）中热脱附。分离使用 Rtx-5MS 毛细管柱（30 m × 0.25 mm 内径 × 0.5 µm 膜厚），氦气为载气（1.1 mL/min）。柱温箱程序如下：初始温度 40°C（保持 2 分钟），以 10°C/min 升至 140°C，再以 7°C/min 升至 280°C（保持 3 分钟）。总运行时间：35 分钟。检测使用四极杆分析器，电子轰击电离 70 eV，离子源温度 260°C（da Mota, Batista, Rabelo, Ribeiro, Borém & Schwan, 2020）。挥发性化合物通过将质谱与 NIST 库数据库匹配进行鉴定。
【数据】色谱柱：Rtx-5MS（30m×0.25mm×0.5µm）；载气：氦气/1.1mL/min；升温程序：40°C(2min)→10°C/min→140°C→7°C/min→280°C(3min)；总时长：35min；电离能：70eV；离子源温度：260°C
2.8 统计分析
所有实验处理均设三个生物学重复，结果以平均值 ± 平均标准误（SEM）或标准差（SD）表示（视情况而定）。组间统计显著性使用单因素方差分析（ANOVA）后进行 Tukey 事后多重比较检验评估。两组间直接比较采用非配对 Student's t 检验。使用参数检验的依据是 ANOVA 模型在平衡实验设计（等样本量，n = 3）下固有的稳健性。所有生物学重复在分析前均经过仔细的技术误差筛查以确保数据完整性。当观察到高方差时（原文此处未详述后续处理方式）。
【数据】重复数：n=3；统计方法：单因素ANOVA+Tukey事后检验；两组比较：非配对Student's t检验
研究结果
3.1 克鲁维毕赤酵母分离株 TP1 的鉴定与安全性表征
从梅花中分离的野生酵母克鲁维毕赤酵母 TP1（Chen et al., 2026）经系统表征确认其分类学身份和生物安全性。为确认物种身份，分析了两个保守核糖体 DNA 区域。内转录间隔区（ITS）序列与克鲁维毕赤酵母分离株 JYC2095（GenBank: MF692839.1）显示 100% 一致性匹配，如图 S1A 所示。此外，大亚基（26S）D1/D2 结构域序列与克鲁维毕赤酵母菌株 S1–5（GenBank: KU862648.1）显示 100% 一致性匹配，如图 S1B 所示。这些分子证据有力证明梅花分离株 TP1 确为克鲁维毕赤酵母。
温度依赖性生长监测用于评估菌株的生理稳健性及其对人类定殖潜在风险的安全谱。该菌株在 30°C 下表现出旺盛生长，与其在 YPD 等营养丰富培养基中观察到的高生长速率一致。然而，在 37°C——标准人体温度——下生长显著受阻，42°C 下即使培养 48 小时也未观察到生长（图 S2）。在酵母生物技术中，在 37°C 及以上温度生存能力有限是关键安全指标，因为这可显著降低菌株作为机会性病原体的风险。从食品安全角度看，克鲁维毕赤酵母是非致病物种，在葡萄酒酿造和啤酒酿造中用于增香已有悠久历史（Miguel et al., 2022; Renan Eugenio Araujo Piraine et al., 2023）。本发酵中观察到的快速酸化（pH ∼ 4.50），加上食品级酿酒酵母 US-05 的竞争性存在，为抵御潜在腐败或生物胺产生污染物提供了额外一层生物保护。这些结果共同支持克鲁维毕赤酵母 TP1 适用于受控啤酒发酵。
【数据】ITS序列一致性：100%（与JYC2095，GenBank: MF692839.1）；26S D1/D2一致性：100%（与S1–5，GenBank: KU862648.1）；生长温度：30°C旺盛/37°C受阻/42°C无生长；发酵pH：∼4.50
3.2 克鲁维毕赤酵母 TP1 与酿酒酵母 US-05 在 YPD 中的生长动力学
为评估克鲁维毕赤酵母 TP1 相对于商业酿造菌株酿酒酵母 US-05 的生长特性，两种酵母以初始 OD₆₀₀ 0.1 接种于 YPD 培养基中培养。通过光密度（图1A）和活菌计数（图1B）监测生长动态。两菌株均表现出短暂延滞期（≈0–2小时），随后在 2 至 8 小时之间进入活跃指数期。值得注意的是，TP1 表现出显著更高的生长速率，在 8 小时时间点 OD₆₀₀ 约为 US-05 的 3.5 倍。活菌数（CFU/mL）证实了这些发现；TP1 更早达到更高密度，并在整个监测期间维持更高的生物量浓度。这些结果表明克鲁维毕赤酵母 TP1 在营养丰富的培养基中具有优越的生长动力学，可能由增强的代谢效率、快速营养摄取或对早期代谢副产物更高的耐受性驱动。这种快速初始生长是非酿酒酵母在接种更具优势的酿酒酵母菌株之前于发酵培养基中建立"立足点"的理想特性。这一竞争优势可能促进香气化合物的早期生成，这一现象在葡萄酒酿造和啤酒酿造的非传统酵母中常有报道（Capece et al., 2018）。然而，值得注意的是，在 YPD 中的优越表现并不必然保证在啤酒麦汁等复杂基质中的高效糖分衰减，这强调了在后续发酵试验中进行情境特异性评估的必要性。
【数据】初始OD₆₀₀：0.1；延滞期：≈0–2h；指数期：2–8h；8h时TP1 OD₆₀₀为US-05的3.5倍
3.3 碳水化合物利用谱
为评估底物灵活性，两菌株均以葡萄糖为参照评估其代谢各种碳源的能力（图2）。两种酵母均高效利用单糖果糖、半乳糖和甘露糖。然而，两菌株在木糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、乳糖、海藻糖和纤维二糖上均未表现出显著生长。二糖代谢方面观察到关键差异。酿酒酵母 US-05 有效利用麦芽糖和蔗糖，而克鲁维毕赤酵母 TP1 在这些底物上生长可忽略不计。鉴于麦芽糖和麦芽三糖通常占标准啤酒麦汁可发酵糖的 70–80%（Faz-Cortez et al., 2025; Yabaci Karaoglan et al., 2022），这种受限的代谢能力可能限制克鲁维毕赤酵母在传统酿造环境中的发酵效率（Dietvorst, Londesborough & Steensma, 2005; Magalhães, Vidgren, Ruohonen & Gibson, 2016）。事实上，克鲁维毕赤酵母已被表征为麦芽糖阴性酵母，这一特性使其被定向用于低醇和无醇啤酒的生产（Huang et al., 2024; Miguel, Carlsen, Almeida-Faria, Saerens & Arneborg, 2024）。因此，克鲁维毕赤酵母 TP1 与商业艾尔菌株相比表现出显著更窄的糖利用谱，基本上无法代谢麦汁中的主要二糖。这种代谢特征限制了其作为高浓度酿造独立菌株的应用，但与此前关于许多非酿酒酵母缺乏麦芽糖发酵所需的转运和酶系统的发现一致（Huang et al., 2024）。虽然这是完全衰减的不利因素，但也为受控生产低乙醇含量和高残余甜度的啤酒提供了战略机遇。
【数据】可利用碳源：果糖、半乳糖、甘露糖；不可利用：木糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、乳糖、海藻糖、纤维二糖；麦芽糖/蔗糖：US-05可利用，TP1不可利用；麦芽糖+麦芽三糖占麦汁可发酵糖比例：70–80%
3.4 溶解氧对酵母增殖和代谢稳健性的影响
氧气可用性是酵母生理和代谢通量的关键决定因素。虽然初始生长表征在高通气（200 rpm）条件下进行以观察最大生物量潜力，但工业麦汁发酵迅速向限氧或厌氧条件转变。因此，评估克鲁维毕赤酵母 TP1 在不同氧张力下的代谢稳健性对于排除厌氧生长抑制作为后续发酵试验中的混淆变量至关重要。通气（200 rpm）和静置（0 rpm）条件下的比较生长试验显示，克鲁维毕赤酵母 TP1 对低氧环境表现出稳健耐受性，两种处理之间的生物量积累差异可忽略不计。相比之下，酿酒酵母 US-05 在静置条件下最大细胞密度出现中等程度降低（图3A），这一响应与其兼性厌氧特性及氧限制下生物量合成的能量需求一致（Bisson, 1999; Gibson et al., 2007）。在共培养中，无论通气条件如何，两菌株均保持相似的生长轨迹（图3B），确认两物种不会以损害活力的方式竞争氧气。在 WL 营养琼脂上，菌株通过其形态型可轻松区分：克鲁维毕赤酵母产生特征性的黄色锯齿边缘菌落，而酿酒酵母 US-05 产生光滑的蓝色菌落（图 S3）。这些发现作为 7 天麦汁发酵研究的生理"守门员"；它们确认克鲁维毕赤酵母 TP1 在静置酿造环境中保持高度活力。因此，后续衰减或乙醇产量的任何限制均可归因于菌株的"麦芽糖阴性"基因型，而非在发酵容器的厌氧条件下存活失败（Methner, Hutzler, Zarnkow, Prowald, Endres & Jacob, 2022）。
【数据】通气条件：200rpm vs 0rpm；TP1两处理生物量差异：可忽略；US-05静置下最大细胞密度：中等程度降低；WL琼脂上TP1菌落：黄色锯齿边缘；US-05菌落：光滑蓝色
3.5 麦汁中的发酵性能：单菌发酵 vs. 顺序接种
为在工业相关条件下评估菌株，使用三种不同接种策略在啤酒麦汁中进行发酵：（i）克鲁维毕赤酵母 TP1 单菌发酵，（ii）酿酒酵母 US-05 单菌发酵，（iii）顺序共发酵（TP1 提前 48 小时接种）。发酵过程中通过活菌计数（log₁₀CFU/mL）监测生长动态（图4A）。US-05 单菌发酵和顺序共发酵的酒精含量分别达到约 3.83% 和 3.75% ABV，两者之间无显著差异（图4B）。相比之下，TP1 单菌发酵的酒精产量有限，仅约 0.42% ABV。残余糖分析显示，顺序共发酵的残余糖水平（14.60 g/L）与 US-05 单菌发酵在统计上相当，而 TP1 单菌发酵的残余糖水平显著更高。这些结果表明，顺序共发酵策略成功利用了克鲁维毕赤酵母 TP1 的芳香潜力，同时保持了酿酒酵母 US-05 的发酵效率。
【数据】US-05单菌ABV：∼3.83%；顺序共发酵ABV：3.75%；TP1单菌ABV：∼0.42%；顺序共发酵残余糖：14.60g/L；TP1提前接种时间：48h
3.6 挥发性化合物谱：HS-SPME-GC-MS 分析
成熟啤酒样品（20°C 陈酿 1 个月）的挥发性化合物通过 HS-SPME-GC-MS 分析。共鉴定出 15 种关键挥发性化合物。顺序共发酵显著增加了乙酸酯类物质，特别是乙酸异戊酯和苯乙酸乙酯，其相对气味活度值（rOAV）分别为 4.61 和 2.45（图5）。主成分分析（PCA）基于 HS-SPME-GC-MS 鉴定的 15 种关键挥发性化合物的相对峰面积进行，证实共发酵啤酒占据独特的协同风味空间（图6）。这些结果表明，顺序共发酵策略不仅保持了发酵效率，还通过增加高价值乙酸酯的浓度提升了啤酒的风味复杂度。
【数据】关键挥发性化合物数：15种；乙酸异戊酯rOAV：4.61；苯乙酸乙酯rOAV：2.45；陈酿条件：20°C/1个月
讨论与解读
本研究系统表征了野生克鲁维毕赤酵母分离株 TP1 与商业酿造菌株酿酒酵母 US-05 的发酵性能。研究结果表明，虽然克鲁维毕赤酵母具有快速初始生长动力学和对低氧环境的稳健耐受性，但其在麦汁中的代谢活性受到窄糖利用谱的严格限制。具体而言，无法代谢麦芽糖等二糖将其单独乙醇产量限制在约 0.42% ABV。利用 48 小时提前接种时间的顺序共发酵策略被证明是利用该非酿酒酵母芳香潜力而不损害最终衰减度的可行方法。PCA 和相对气味活度值（rOAV）确认这些混合发酵占据独特的芳香空间，特征是高价值乙酸酯浓度升高。然而，需注意本研究鉴定的芳香增强基于仪器挥发性谱分析和 rOAV 计算。虽然 rOAV 是预测风味贡献的有力工具，但缺乏直接的人类感官评价是当前工作的局限。未来研究应侧重于使用经培训的感官评价小组进行描述性感官分析和消费者接受度测试，以进一步验证感官影响和实用性。
编译者解读：本研究展示了"功能分工"式共发酵策略的巧妙之处——利用克鲁维毕赤酵母快速生长和产酯能力作为"风味前奏"，再引入酿酒酵母完成酒精发酵主体任务。这种思路对合成生物学有借鉴意义：非模式酵母的独特代谢能力不必通过工程改造强行植入主发酵菌株，通过时序调控即可实现功能整合。不过，rOAV 预测与实际感官感知之间仍存在差距，后续如能结合消费者测试或开发香气释放可控的工程菌株，将更具应用价值。此外，TP1 的麦芽糖阴性特征在低醇啤酒领域反而是可开发的优良性状。
参考来源
Lu, J.-Y. (2026). Sequential co-fermentation of Pichia kluyveri and Saccharomyces cerevisiae enhances volatile complexity while retaining fermentation efficiency in wort. Applied Food Research, 2026. DOI: 10.1016/j.afres.2026.102210
DOI: 10.1016/j.afres.2026.102210