来源：Enhancement of abscisic acid biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae via multidimensional engineering（Process Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
脱落酸（ABA）是一种具有高应用价值的倍半萜类植物激素，在农业、营养和医药领域前景广阔。本研究以酿酒酵母为底盘细胞，通过启动菌株筛选、MVA途径代谢流强化、BcABA3酶定向进化以及新型TPI1-delta驱动CRISPR-Cas9多拷贝整合系统等多维工程策略，逐步将ABA摇瓶产量提升至30.30 mg L⁻¹，创下酿酒酵母中de novo合成ABA的最高报道水平。研究还通过分子对接、qRT-PCR和发酵条件优化等手段系统解析了限速步骤，为萜类化合物的微生物细胞工厂构建提供了可借鉴的范例。
研究背景
倍半萜是一类高附加值的异戊二烯天然化合物，在制药、食品和农业领域具有巨大潜力。脱落酸作为倍半萜类植物激素，是五种天然植物生长调节剂之一。自1963年被发现以来，ABA因其在植物生长发育中的重要作用——包括应对紫外线照射、水分和养分供应变化、病原体侵袭等胁迫反应——而受到广泛关注。除农业应用外，ABA在人体免疫系统、心血管细胞、干细胞和糖尿病等方面也表现出调节功能。目前ABA的获取主要依赖化学合成和植物提取，但化学合成面临分子结构复杂的挑战，植物提取则受限于产量低、纯度低、生长周期长和纯化工艺繁琐等问题。因此，工程微生物细胞工厂实现ABA的de novo生物合成成为备受关注的替代路径。
研究方法
2.1 菌株、质粒与化学品
CICC33067、CICC33068、CICC1447和CICC32900购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。ZH-1、SC-1、M-1、RH2–16和NGER从自然环境中筛选获得。YS010和YS036在前期研究中构建。主要工程酵母菌株和构建的质粒分别汇总于表1和表2。密码子优化基因由天霖生物科技有限公司合成并构建于pESC-his质粒中，生成pESC-his-bcaba1&2和pESC-his-bcaba3&4，基因序列见补充文件。从pESC-his-bcaba1&2克隆的bcaba1/bcaba2基因、从酵母基因组克隆的启动子P_PGK1和终止子T_ADH1通过一步克隆法连接至载体pUC57，分别生成pUC57-bcaba1和pUC57-bcaba2。类似地，从pESC-his-bcaba3&4克隆的bcaba3/bcaba4基因、从酵母基因组克隆的启动子P_TEF1和终止子T_CYC1通过一步克隆法连接至载体pESC-his，分别生成pESC-his-bcaba3和pESC-his-bcaba4。从pUC57-bcaba1、pUC57-bcaba2、pESC-his-bcaba3和pESC-his-bcaba4克隆的P_PGK1-bcaba1-T_ADH1、P_PGK1-bcaba2-T_ADH1、P_TEF1-bcaba3-T_CYC1和P_TEF1-bcaba4-T_CYC1供体DNA分别整合至菌株RH2–16、YS010、CICC1447、CICC33067和YS036的XI-3、XII-5、X-4和XII-2位点，生成RH2–16-ABA、YS010-ABA、CICC1447-ABA、CICC33067-ABA和YS036-ABA。YS036-ABA-ΔTPI1菌株通过CRISPR-Cas9方法删除YS036-ABA中的TPI1基因获得。上游delta同源片段（δ1）、TPI1表达盒（粟酒裂殖酵母TPI1启动子-TPI1基因-TPI1终止子，由无锡天霖生物科技有限公司合成）、目标基因表达盒（P_PGK1-bcaba1-T_ADH1、P_PGK1-bcaba2-T_ADH1、P_TEF1-bcaba3-T_CYC1和P_TEF1-bcaba4-T_CYC1）及下游delta同源片段（δ2）通过融合PCR组装，生成四个TPI1标记表达盒（δ1-TPI1-bcaba1/bcaba2/bcaba3/bcaba4-δ2）。随后，构建的TPI1标记表达盒通过CRISPR-Cas9方法整合至YS036-ABA-ΔTPI1基因组的delta位点，生成YFT系列菌株，其中含ABA生物合成基因的TPI1标记表达盒以1:1:1:1的摩尔比转化。所有酵母基因、启动子和终止子均以CEN.PK2–1D基因组为模板通过PCR扩增获得。本研究构建的所有基因表达盒均通过重叠延伸PCR扩增，并使用Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™（Bjing Biotech，中国）整合至酵母基因组。所有其他化学品购自国药集团（上海，中国）和生工生物（上海，中国）。
【数据】菌株：CICC33067、CICC33068、CICC1447、CICC32900、ZH-1、SC-1、M-1、RH2–16、NGER、YS010、YS036；整合位点：XI-3、XII-5、X-4、XII-2；转化摩尔比：1:1:1:1；模板菌株：CEN.PK2–1D
2.2 发酵培养基
工程酿酒酵母菌株在YPD培养基中培养，成分为酵母提取物（10 g L⁻¹）、蛋白胨（20 g L⁻¹）和葡萄糖（20 g L⁻¹）。YS036-ABA-ΔTPI1菌株在YPE培养基中培养，成分为酵母提取物（10 g L⁻¹）、蛋白胨（20 g L⁻¹）、乙醇（10 mL L⁻¹）和葡萄糖（0.5 g L⁻¹）。YS036-ABAP系列突变菌株在SC-Ura培养基（标准合成培养基，尿嘧啶营养缺陷型）中培养。发酵条件优化实验中，氮源评估使用YPD/YPAD/YPBD/YPTD培养基，含酵母提取物（10 g L⁻¹）、蛋白胨（PP）/牛肉蛋白胨（PA）/大豆蛋白胨（PB）/胰蛋白胨（PT）（20 g L⁻¹）和葡萄糖（20 g L⁻¹）。碳源评估在改良发酵条件下进行，以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、海藻糖、甘油和半乳糖作为测试碳源，培养基成分为酵母提取物（10 g L⁻¹）、PA（20 g L⁻¹）和测试碳源（20 g L⁻¹）。碳源比例评估使用YPD（1×Glc）/YPD（2×Glc）/YPD（3×Glc），成分为酵母提取物（10 g L⁻¹）、PA（20 g L⁻¹）和葡萄糖（20/40/60 g L⁻¹）。
【数据】YPD培养基：酵母提取物10 g L⁻¹、蛋白胨20 g L⁻¹、葡萄糖20 g L⁻¹；YPE培养基：酵母提取物10 g L⁻¹、蛋白胨20 g L⁻¹、乙醇10 mL L⁻¹、葡萄糖0.5 g L⁻¹；碳源比例实验葡萄糖浓度：20/40/60 g L⁻¹
2.3 麦角固醇含量测定
本研究采用皂化提取法测定麦角固醇。收集培养24 h的发酵液1.5 mL，离心后的细胞称重并用于皂化反应。细胞与600 μL 20%氢氧化钾溶液和400 μL无水乙醇混合，在90°C孵育2 h。冷却至室温后，加入1 mL乙醚并涡旋10 min，静置分层后收集上清液。使用紫外分光光度计在281 nm处测定吸光度，通过标准曲线计算麦角固醇含量。计算公式如下：麦角固醇（%）= C×V/W ×100%，其中C为麦角固醇浓度，V为提取液体积（1 mL），W为细胞湿重（mg）。
【数据】发酵时间：24 h；KOH浓度：20%；孵育温度：90°C；孵育时间：2 h；乙醚用量：1 mL；涡旋时间：10 min；检测波长：281 nm；提取液体积：1 mL
2.4 HPLC和LC-MS分析
使用配备C18色谱柱（5 μm，4.6 mm × 250 mm；Waters，美国）的高效液相色谱仪（Waters，美国）分析ABA产量。色谱柱以甲醇:乙酸（45:54，v/v）为流动相洗脱，流速为1 mL min⁻¹。样品吸光度在254 nm处检测，进样体积为20 μL。液相色谱-质谱联用分析使用Thermo Scientific™ LTQ Orbitrap XL耦合质谱仪。每个样品分析10 μL，色谱条件为：洗脱液A（0.1% v/v甲酸+水）和洗脱液B（0.1% v/v甲酸+乙腈），流速为0.4 mL min⁻¹。
【数据】色谱柱：C18（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；流动相：甲醇:乙酸=45:54（v/v）；流速：1 mL min⁻¹；检测波长：254 nm；进样体积：20 μL；LC-MS进样量：10 μL；LC-MS流速：0.4 mL min⁻¹
2.5 工程菌株的生物学表征
取30 mL发酵样品上清液过滤后用于后续实验。选取若干苜蓿种子（由青海草原改良试验站提供），在过滤后的发酵液中浸泡8 h，然后转移至铺有两层滤纸的6孔板中（每孔放置10粒种子，每组设3个重复）。向板中加入适量无菌水。随后，6孔板在光照培养箱中培养（光照12 h，黑暗12 h），温度28°C，培养5天。每天早晚各添加一次无菌水，每次500 μL。第5天测定种子萌发率。
【数据】发酵液用量：30 mL；种子浸泡时间：8 h；每孔种子数：10粒；重复数：3；培养温度：28°C；培养时间：5天；光照周期：12 h光照/12 h黑暗；加水量：500 μL/次
2.6 克隆与突变
倍半萜环化酶BcABA3的单点突变采用已报道的方法进行，以pESC-his-bcaba3质粒为模板。野生型模板在37°C下用DpnI消化1 h。随后，消化产物在80°C灭活20 min后转化至大肠杆菌BL21（DE3），突变通过测序验证（擎科，北京，中国）。
【数据】DpnI消化温度：37°C；消化时间：1 h；灭活温度：80°C；灭活时间：20 min；宿主菌：E. coli BL21（DE3）
2.7 RNA提取与qRT-PCR
使用生工生物的RNA pure酵母试剂盒和Super RT cDNA试剂盒进行RNA提取和cDNA合成。使用Vazyme的ChamQ Universal SYBR qPCR预混液进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR），分析ABA合成基因的表达水平，以ACT1基因作为内参基因。qRT-PCR程序设置如下：95°C 1 min，40个循环的95°C 5 s和60°C 30 s。使用阈值循环（2^−ΔΔCT）法计算ABA合成基因的相对表达水平。
【数据】qRT-PCR程序：95°C 1 min；40个循环（95°C 5 s，60°C 30 s）；内参基因：ACT1；计算方法：2^−ΔΔCT
研究结果
3.1 筛选适合ABA生物合成的优良酵母菌株
为节省后续菌株改造的高昂成本，有必要选择具有抗逆性或营养利用背景的优良酵母菌株用于研究或工业生产。对于ABA生物合成的候选菌株，有两个关键特性：（1）强大的生长能力，可在发酵过程中实现经济最大化；（2）强大的MVA途径，与ABA前体供应相关。麦角固醇作为MVA途径的下游产物，与MVA途径的功能有一定相关性。因此，本研究以麦角固醇含量和菌株生长能力作为筛选理想ABA生产菌株的指标。如图2A所示，11种酿酒酵母菌株的麦角固醇含量存在显著差异，其中菌株YS010含量最高，达到0.9%，这可能与其MVA途径改造背景有关。其次是野生型菌株CICC 1447，麦角固醇含量为0.78%。菌株CICC 33067的麦角固醇含量最低，为0.37%，因此可作为对照菌株验证筛选方法的正确性。在生长能力方面，菌株RH 2–16表现出最快的生长速率，被选为进一步研究的候选菌株（图2B）。
酿酒酵母含有ABA合成所需的前体供应链，因此只需异源表达bcaba1、bcaba2、bcaba3和bcaba4即可实现ABA在酿酒酵母中的合成。通过将酿酒酵母密码子优化的基因（bcaba1、bcaba2、bcaba3和bcaba4）整合至酵母基因组的X-4、XI-3、XII-5和XII-2位点构建工程菌株，并通过HPLC分析产物。为进一步确认HPLC检测到的峰为ABA，以ABA标准品为对照，对发酵产物进行LC-MS分析。结果表明，ABA标准品在7 min出峰（图2C），分子量为263（图2D）。麦角固醇含量最低的菌株33067-ABA的ABA产量也最低（图2E），为0.61 mg L⁻¹，证明麦角固醇是初步检测ABA产量的合理筛选条件。菌株YS010-ABA、RH2–16-ABA和CICC1447-ABA的ABA产量分别达到1.93 mg L⁻¹、1.82 mg L⁻¹和1.69 mg L⁻¹。随后选择菌株YS010作为ABA生物合成的最优菌株。此外，作为植物激素，ABA在较低浓度下即可显著抑制种子萌发，因此进行了植物生理实验以验证生物合成ABA的功能。实验中以ABA处理的苜蓿种子萌发情况来指示发酵液中ABA的生物活性。如图2F所示，浸泡在野生型发酵液中的苜蓿种子5天后的萌发率为100%，而经工程菌株YS010-ABA发酵液处理的苜蓿种子萌发率仅为20%，进一步证实功能性ABA已在酿酒酵母中成功合成。
【数据】YS010麦角固醇含量：0.9%；CICC 1447麦角固醇含量：0.78%；CICC 33067麦角固醇含量：0.37%；33067-ABA产量：0.61 mg L⁻¹；YS010-ABA产量：1.93 mg L⁻¹；RH2–16-ABA产量：1.82 mg L⁻¹；CICC1447-ABA产量：1.69 mg L⁻¹；ABA标准品出峰时间：7 min；分子量：263；野生型发酵液种子萌发率：100%；YS010-ABA发酵液种子萌发率：20%
3.2 FPP合成代谢流增强提高ABA生物产量
在酿酒酵母中，ABA合成始于MVA途径，这是萜类化合物合成的通用途径。如图1所示，为促进ABA生物合成，通过过表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶（ERG10）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶（ERG13）、来自Ruegeria pomeroyi的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（RpHMGR）、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（t-HMGR）、甲羟戊酸激酶（ERG12）和异戊烯基二磷酸异构酶（IDI）来增强起始菌株YS010-ABA的MVA途径。同时，通过替换葡萄糖敏感的HXT1启动子来减弱角鲨烯合酶（ERG9），以消除角鲨烯生产的竞争。工程菌株命名为YS036-ABA。YS036-ABA的产量达到2.45 mg L⁻¹，仅比YS010-ABA的1.93 mg L⁻¹提高1.3倍（图3A）。与先前报道的通过增强MVA途径和FPP积累来提高其他萜烯产物产量的结果相比，增强MVA途径似乎对ABA的最终产量没有显著影响（图3A）。由于怀疑ABA积累可能抑制酵母菌株的生长，因此对菌株YS036进行了ABA耐受性测试。结果表明，不同浓度的ABA对YS036的生长没有影响（图3B），说明工程酵母合成的ABA浓度并不是限制ABA产量的因素。异源ABA合成途径本身的代谢通量可能才是限制ABA生产的主要原因。
【数据】YS036-ABA产量：2.45 mg L⁻¹；YS010-ABA产量：1.93 mg L⁻¹；产量提高倍数：1.3倍
3.3 BcABA3的理性设计与定向进化提高ABA生物产量
代谢工程旨在增加前体供应和平衡胞内途径。尽管ABA的微生物合成途径已被阐明，但发现并经过功能验证的ABA合成酶数量仍然有限。此外，一些异源酶可能尚未进化到支持高通量的程度。因此，增强限速酶的催化性能是优化目标产物生物合成的另一策略。BcABA3是来自灰葡萄孢的倍半萜环化酶，负责催化FPP生成α-紫罗酮亚乙烷（α-IE），是ABA合成中的第一个关键酶。为进一步提高ABA合成途径对FPP的竞争力，通过理性设计和定向进化来提高BcABA3的催化性能。由于BcABA3的晶体结构迄今尚未报道，且与已报道的倍半萜环化酶同源性较低（最高序列一致性为31.9%），本研究使用基于深度学习的AlphaFold2预测BcABA3的三维结构（图4A），并通过Schrödinger软件判断所得三维结构氨基酸残基的质子化状态。FPP分子从PubChem下载获得，其结构由Schrödinger Ligprep生成。此外，由于BcABA3催化活性中心存在镁离子，参考其他I类萜烯合酶中镁离子结合位点的特征，初步确定了三个镁离子的位置：GLU124、GLU253和GLU255（图4B）。由于AlphaFold2预测的BcABA3结构不含任何底物分子，因此需要使用Schrödinger的SiteMap模块搜索活性蛋白口袋。最终选择得分最高的口袋，并使用Receptor Grid Generation生成受体网格文件。将上一步生成的FPP分子构象和受体网格文件载入Schrödinger的Glide软件模块进行分子对接计算（选择OPLS3力场、半柔性和Glide SP模式）。选择能够与镁离子配位且对接得分较高的FPP构象作为候选对接构象，所选对接构象如图4C所示，底物FPP和镁离子在活性口袋中良好结合。分析表明，ASP205、LYS249、ARG312和TYR313可直接与FPP焦磷酸基团形成氢键；GLU124、GLU253和GLU255可通过与镁离子的配位作用与焦磷酸基团相互作用；PHE125和VAL344与底物FPP碳链形成疏水相互作用。因此，基于以上分析和Rosetta突变预测结果，采用定向进化来增强BcABA3的催化性能。
【数据】BcABA3与已知倍半萜环化酶最高序列一致性：31.9%；镁离子结合位点：GLU124、GLU253、GLU255；氢键相互作用残基：ASP205、LYS249、ARG312、TYR313；疏水相互作用残基：PHE125、VAL344
3.4 多拷贝整合策略提高ABA产量
（原文此部分在节选范围内未完整呈现，但根据上下文和图表清单，该部分涉及TPI1-delta驱动CRISPR-Cas9（TDI-CRISPR）系统的开发与应用。图5展示了TDI-CRISPR系统示意及ABA产量和基因表达分析结果。）
【数据】原文未详述
3.5 发酵条件优化提高ABA产量
（原文此部分在节选范围内未完整呈现，但根据上下文和图表清单，该部分涉及氮源、碳源、碳源比例及NADPH供应对ABA产量的影响评估。）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过多维工程策略系统优化了酿酒酵母中的ABA生物合成。从11种酿酒酵母菌株中筛选出麦角固醇含量最高的YS010作为起始菌株，通过异源表达ABA合成途径获得1.93 mg L⁻¹的产量。增强MVA途径代谢流仅使产量提升1.3倍，提示异源途径本身的通量是限制因素。通过BcABA3的理性设计与定向进化，突变菌株YS036-ABAPA206D产量达2.64 mg L⁻¹。进一步开发TDI-CRISPR多拷贝整合系统实现关键基因的高拷贝稳定表达，产量跃升至17.47 mg L⁻¹。最终通过发酵培养基优化，ABA产量达到30.30 mg L⁻¹，为酿酒酵母中de novo合成ABA的最高报道水平。研究表明，酿酒酵母的ABA产量适中，而米曲霉（8 mg/L）和解脂耶氏酵母（263.5 mg/L）在特定条件下可达到相当或更高的产量。米曲霉天然产生倍半萜，可能增强ABA生物合成；解脂耶氏酵母因其高脂质含量为类胡萝卜素衍生化合物如ABA提供了独特的代谢环境。然而，酿酒酵母在对各种发酵条件的适应性方面具有突出优势。
编译者解读
本研究展示了多维工程策略在萜类化合物微生物合成中的系统应用价值。值得关注的是，MVA途径增强对ABA产量提升有限，而酶工程和多拷贝整合策略效果显著——这提示在异源途径构建中，限速酶的催化效率和基因拷贝数往往是比前体供应更关键的瓶颈。TDI-CRISPR系统的开发为多基因稳定整合提供了新工具。不过，与解脂耶氏酵母263.5 mg/L的产量相比，酿酒酵母仍有较大提升空间，未来可探索ABA转运蛋白工程或区室化合成等策略。此外，BcABA3的AlphaFold2结构预测与分子对接分析为缺乏晶体结构的酶提供了可行的改造范式。
参考来源
期刊：Process Biochemistry, 2024
DOI: 10.1016/j.procbio.2024.09.029
DOI: 10.1016/j.procbio.2024.09.029