来源：Strategic ultrasonic regulation of Saccharomyces cerevisiae fermentation for enhanced anthocyanin production and wine quality（Food Research International）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
超声波作为一种新兴的物理辅助发酵技术，正逐步展现其在食品生物加工中的潜力。本研究通过正交实验优化超声参数（时长、功率、温度），针对两株商业酿酒酵母CECA与CVE7实现了菌株特异性发酵调控。研究发现，超声处理不仅将发酵时间缩短12.5%–36.1%，还将花青素含量提升26.2%–50.8%。在真实葡萄汁体系中，超声处理使花青素含量从735.76 mg/L增至1284.61 mg/L，并显著改善酒体色泽与抗氧化能力。代谢组学分析揭示了10种花青素及其衍生物的上调与色泽参数的显著正相关，为超声精准调控发酵提供了理论与数据支撑。
研究背景
葡萄酒的品质形成是一个复杂过程，受葡萄品种、栽培方式和酿造工艺等多重因素影响。发酵是酿酒的核心环节，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）通过其发酵动力学将葡萄汁中的糖转化为乙醇，同时产生酯类、高级醇、有机酸等副产物，共同决定葡萄酒的色泽、香气、风味与口感。传统葡萄酒发酵依赖自然酵母菌群，存在品质不稳定、产品同质化严重、周期长等局限。随着消费者对高品质葡萄酒需求的提升，探索精准高效的发酵调控策略成为酿酒研究的热点。近年来，新型物理技术辅助的非传统发酵受到广泛关注，其通过胁迫响应与代谢流重分配，有望重塑生物系统的代谢行为。超声技术凭借其空化效应与机械作用，在改善细胞膜通透性、加速底物摄取、调控酶活性方面展现出独特优势，为葡萄酒发酵的定向优化提供了新路径。
研究方法
2.1 酵母、葡萄与培养基选择
选用两株商业酿酒酵母CECA和CVE7（购自安琪酵母股份有限公司），采用甘油管法保藏。实验葡萄原料为“烟73”品种，于2022年8月20日采自陕西某酒庄，无病害、成熟度正常。葡萄含糖量为186 g/L，可滴定酸度为13 g/L（以酒石酸计）。YPD培养基/种子培养基配方（g/L）：酵母提取物（10）、蛋白胨（20）、葡萄糖（20）。取一环斜面保藏菌种接种于60 mL种子培养基中，于28°C、120 r/min摇床培养15 h至对数中期。参照Que等（2024）的方法，使用Model Synthetic Medium（MSM）模拟葡萄汁成分（表S1）。MSM中添加商业葡萄皮花青素提取物（产品编号#T20437，上海源叶生物科技有限公司）至终浓度50 mg/L。根据供应商的分析证书，该提取物的主要成分为锦葵素-3-O-葡萄糖苷。选择该提取物是为了向受控模型体系中引入具有代表性的、与葡萄酒相关的花青素谱。每次实验前新鲜配制工作液以尽量减少降解。
【数据】菌株：CECA、CVE7；培养基：YPD（酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L）；葡萄：烟73，含糖量186 g/L，可滴定酸度13 g/L；种子培养：28°C、120 r/min、15 h；花青素提取物终浓度：50 mg/L
2.2 模拟葡萄汁发酵
模拟发酵方案参照Que等（2024）和Yang等（2019）的方法修改如下：将斜面保藏菌种接种于60 mL液体YPD培养基中，于28°C、120 r/min摇床培养12 h富集酵母细胞。当培养物达到对数期（OD₆₀₀ ≈ 1.4）后，以1%接种量接种于经不同超声处理的模拟葡萄汁培养基中。发酵装置中，称量瓶发酵塞内加入6–8 mL浓硫酸，取样瓶塞内加入6 mL无菌水。这些溶液用于排除外部氧气，同时允许发酵过程中二氧化碳释放。培养基于28°C静置培养，定期取样测定OD₆₀₀和CO₂失重量。每个发酵瓶（含对照）在称重前轻轻摇动，通过质量损失监测CO₂释放。当发酵瓶不再出现重量损失时，判定发酵完成。所有发酵均设三次独立生物学重复（n = 3）。
【数据】接种量：1%；培养温度：28°C；种子培养时间：12 h；OD₆₀₀：≈1.4；浓硫酸：6–8 mL；无菌水：6 mL；生物学重复：n = 3
2.3 超声参数的正交设计
将200 mL模拟发酵液置于500 mL发酵瓶中进行处理。超声处理使用KQ-500GDV恒温数控超声清洗器（超声频率：40 kHz；能量输入：每次处理300–3000 kJ/L；容器：500 mL硼硅酸盐玻璃瓶，壁厚2.5 mm；样品位置：浴槽中心、液面下2 cm；超声期间不搅拌）。基于文献调研和预实验，选取三个因素：超声时长（min）、功率（W）和温度（°C），每个因素设四个水平。超声处理每24 h在固定时间进行（发酵接种后24 h开始，上午9:00启动，后续每日同一时间处理），直至发酵完成。每种超声参数组合设三个独立发酵瓶，视为独立生物学重复。以发酵时间和花青素含量为因变量，筛选并验证实现最短发酵时间和最高花青素产量的最佳超声条件，详见补充材料。
【数据】超声频率：40 kHz；能量输入：300–3000 kJ/L；容器：500 mL硼硅酸盐玻璃瓶，壁厚2.5 mm；样品位置：液面下2 cm；处理频率：每24 h一次；因素：时长、功率、温度，各4水平
2.4 真实果汁体系发酵
将筛选出的条件应用于“烟73”葡萄汁发酵，经模拟体系验证后进行，以非超声发酵组作为对照（CK）。每种发酵条件（含对照）设三个独立发酵瓶，作为后续分析的独立生物学重复。
【数据】发酵体系：烟73葡萄汁；对照：非超声发酵组；生物学重复：n = 3
2.5 基础理化与功能指标
以下指标按照Wei等（2025）的方法测定：总可溶性固形物（TSS）使用TD-45数字折射仪测定；pH使用上海雷磁PHS-3E pH计测定；电导率使用电导率仪测定。总酚含量（TPC）采用Folin-Ciocalteu法测定；总黄酮含量（TFC）采用三氯化铝比色法测定；总黄烷醇含量（TFOC）采用p-DMACA–HCl法测定；总花青素含量（TAC）采用pH示差法测定；总单宁含量（TTC）采用甲基纤维素沉淀法（MCP法）测定。体外抗氧化活性采用三种方法评估：DPPH、FRAP和ABTS。
【数据】TSS：TD-45数字折射仪；pH：PHS-3E pH计；TPC：Folin-Ciocalteu法；TFC：三氯化铝比色法；TFOC：p-DMACA–HCl法；TAC：pH示差法；TTC：MCP法；抗氧化：DPPH、FRAP、ABTS
2.6 感官特性
#### 2.6.1 CIELab颜色测定
使用CS-820色差仪（杭州彩谱科技有限公司，中国）透射模式测定葡萄酒的CIELab颜色参数，直接获得L（明度）、a（绿-红）、b（蓝-黄）、C（彩度）、h（色调角）及颜色预览图像（Wei等，2025）。
【数据】仪器：CS-820色差仪；模式：透射模式；参数：L、a、b、C、h
#### 2.6.2 颜色比例
按照Longhi等（2022）的方法，记录420、440、520和620 nm处的吸光度值，计算黄色（Yellow%）、红色（Red%）和蓝色（Blue%）的百分比如下：Yellow% = 100%×A420/(A420 + A520 + A620)；Red% = 100%×A520/(A420 + A520 + A620)；Blue% = 100%×A620/(A420 + A520 + A620)。褐变程度可通过420 nm和440 nm处的吸光度值表示。
【数据】波长：420、440、520、620 nm；Yellow% = 100%×A420/(A420+A520+A620)；Red% = 100%×A520/(A420+A520+A620)；Blue% = 100%×A620/(A420+A520+A620)
#### 2.6.3 聚合色素颜色（PPC）
向5 mL样品中加入15 mg Na₂S₂O₅，于25°C静置45 min。然后将溶液稀释10倍，在520 nm处测定吸光度（Varo等，2022）。吸光度单位为a.u.（任意单位），直接代表光强度。此处A和A₀分别表示样品和空白在520 nm处的吸光度值。
【数据】样品量：5 mL；Na₂S₂O₅：15 mg；温度：25°C；时间：45 min；稀释倍数：10倍；波长：520 nm
#### 2.6.4 辅色效应与红移计算
使用紫外-可见分光光度计以1 nm间隔记录所有溶液在400–700 nm的可见吸收光谱，以模拟葡萄酒溶液作为空白（Sun等，2022）。确定最大波长位移（Δλmax）和辅色效应大小（M）。
【数据】波长范围：400–700 nm；扫描间隔：1 nm；空白：模拟葡萄酒溶液
#### 2.6.5 电子鼻检测
使用德国AIRSENSE PEN 3电子鼻分析样品（Lan等，2022）。取1 mL样品置于20 mL玻璃瓶中测定，参数如下：载气流量300 mL/min，测定时间60 s，清洗时间300 s。每个样品至少测定10次。
【数据】仪器：AIRSENSE PEN 3电子鼻；样品量：1 mL；载气流量：300 mL/min；测定时间：60 s；清洗时间：300 s；测定次数：≥10次
#### 2.6.6 GC–MS检测
样品测定方法参照Chang等（2024）。简要步骤：称取5 mL发酵样品、1.5 g NaCl和40 μL 4-甲基-1-戊醇（394.08 μg/L）于20 mL顶空瓶中。样品在500 r/min、40°C条件下平衡15 min。然后将预处理过的固相微萃取（SPME）针（50/30 μm，DVB/CAR/PDMS，Supelco，美国Bellefonte）插入顶空瓶萃取30 min，随后在GC进样口不分流模式下解吸5 min。GC条件：进样口温度250°C；载气：氦气（0.8 mL/min）；升温程序：40°C（保持5 min）→ 以3°C/min升至120°C → 以8°C/min升至230°C（保持10 min）。MS条件：EI离子源（70 eV电子能量）；离子源温度230°C；采集模式：全扫描；质量范围33–450 m/z。分析使用GC 2030-TQ8050 NX三重四极杆GC–MS系统完成。
【数据】样品量：5 mL；NaCl：1.5 g；内标：40 μL 4-甲基-1-戊醇（394.08 μg/L）；平衡：500 r/min、40°C、15 min；SPME萃取：30 min；解吸：5 min；进样口温度：250°C；载气：氦气0.8 mL/min；升温程序：40°C（5 min）→3°C/min至120°C→8°C/min至230°C（10 min）；EI 70 eV；离子源温度：230°C；质量范围：33–450 m/z
研究结果
3.1 发酵性能重塑与工艺优化
CO₂是糖转化为酒精的关键代谢产物。在密闭体系中，CO₂产生量可通过发酵体系的重量变化来量化，反映模拟葡萄汁体系的发酵状态。当CO₂产生趋于稳定时，判定发酵完成（Brandolini等，2002）。未经超声处理时，CECA在192 h内完成发酵，发酵后花青素含量为61 mg/L；CVE7则需要216 h完成发酵，花青素含量同样为61 mg/L。不同超声处理下的发酵条件详见表S3和S4。选择50 mg/L是因为该浓度处于年轻红葡萄酒典型花青素浓度的中低范围（提供生理相关基线），并能在确保正交实验设计高通量筛选中清晰分析检测花青素动态的同时保持成本效益。正交优化实验显示，超声时长、功率和温度对模拟葡萄汁中发酵时间和花青素含量的影响存在显著差异（表S3和S4）。对于CECA发酵，超声参数对发酵时间的影响顺序为C > A > B（温度 > 时长 > 功率），对花青素含量的影响顺序为B > A > C（功率 > 时长 > 温度）。两项指标的最佳组合均为A₂B₄C₄：超声时长15 min、功率400 W、温度40°C。在该条件下，发酵时间缩短至168 h，花青素含量提高至92 mg/L。对于CVE7发酵，超声参数对发酵时间和花青素含量的影响顺序与CECA一致，但最佳组合不同。最短发酵时间由A₄B₂C₁（25 min、200 W、25°C）实现，缩短至138 h。最高花青素含量由A₃B₂C₂（20 min、200 W、30°C）获得，提高至77 mg/L。超声作为一种物理辅助发酵技术，不仅能提高葡萄酒的发酵效率，还能缩短水牛奶和酸奶的发酵时间。这可能是因为超声促进了发酵微生物的快速生长和底物消耗（Abesinghe等，2025；Zhang, Pérez-Álvarez, 等，2025）。
【数据】CECA对照：发酵192 h，花青素61 mg/L；CVE7对照：发酵216 h，花青素61 mg/L；CECA最佳条件：15 min、400 W、40°C，发酵168 h，花青素92 mg/L；CVE7最短发酵：25 min、200 W、25°C，138 h；CVE7最高花青素：20 min、200 W、30°C，77 mg/L
3.2 超声发酵对样品一般参数的影响
将优化条件应用于“烟73”葡萄汁，以非超声发酵组作为对照。两组共五个葡萄酒样品——对照组（CECA-0、CVE7-0）、高花青素发酵组（CECA-1、CVE7-1）和快速发酵组（CECA-1、CVE7-2）——进行了多指标分析（表1）。TSS和pH是葡萄酒甜度和酸度的关键指标（Wei等，2023）。未经超声处理的CECA发酵葡萄酒TSS为6.53°Brix，CVE7发酵葡萄酒为6.47°Brix。超声处理显著降低了CECA葡萄酒的TSS，但增加了CVE7葡萄酒的TSS。与可溶性固形物不同，超声未改变CECA葡萄酒的pH，但降低了CVE7葡萄酒的pH，这可能是因为超声对微生物代谢的双向调控在不同菌株中产生不同效果（Zhang等，2022；Zhang, Xu, 等，2020）。电导率反映葡萄酒的离子浓度：电导率越高，离子含量越高（Bambina等，2024）。在两种酵母发酵的葡萄酒中，超声均显著增加了离子浓度（p < 0.05），可能是其机械效应分解葡萄酒分子的结果。超声引起的电导率和pH变化可能反映了基质离子释放的改变与酵母代谢活性的变化的组合效应。后者可从有机酸谱（第3.4.2节）和矿质元素水平的变化中窥见，这些变化是核心代谢途径（如Krebs循环、金属稳态）的结果，可能受到超声胁迫的影响。酚类化合物是葡萄酒的关键组分，决定其感官属性和营养品质（Rossi等，2022）。如表1所示，超声发酵对Folin-Ciocalteu法测定的葡萄酒总酚含量（TPC）无显著影响（p > 0.05）。在CECA发酵葡萄酒中，超声处理显著提高了TFOC和TAC水平（p < 0.05）。对于CVE7，除20 min、200 W、30°C超声处理下TTC含量显著降低外，超声发酵显著提升了TFC、TFOC和TAC水平（p < 0.05），表明CVE7对超声更敏感，超声作用可改善葡萄酒的功能特性。总体而言，CVE7在提高葡萄酒花青素含量方面比CECA更有效，CVE7-1的TAC显著高于其他样品。这进一步证实促进花青素生成的最佳条件为超声时长20 min、功率200 W、温度30°C。这一结果得到靶向代谢组学数据（第3.5节）的支持，该数据揭示了超声处理的CVE7发酵中几种花青素衍生物（如矢车菊素和天竺葵素类化合物）的特异性上调，提示类黄酮途径内代谢流可能发生了重定向。超声诱导的葡萄酒品质提升可能归因于植物组织细胞壁和液泡的破坏，以及空化引起的胶体颗粒坍塌，促进了酚类化合物向基质中的溶解和释放（Ma等，2020）。此外，也可能源于超声改变酿酒酵母的代谢活性，通过与芳香环的相互作用促进更多酚类化合物的产生（Muñoz等，2021）。DPPH、FRAP和ABTS法是食品工业中评估抗氧化能力应用最广泛的方法（Zhao等，2023）。其中，FRAP值在超声发酵前后各样品中均无显著变化。CECA对照组DPPH和ABTS值分别为11.24 μM Trolox/mL和12.49 μM Trolox/mL，超声处理后抗氧化能力显著提高（p < 0.05）。CVE7对照组DPPH和ABTS值分别为10.92 μM Trolox/mL和13.24 μM Trolox/mL。在两种超声条件下，DPPH值显著增加19.60%–20.24%，而ABTS值保持不变。超声处理后抗氧化能力得以维持或增强（尽管发酵时间缩短），这与特定功能性酚类亚群（如TFOC、TFC）的稳定性或增加相一致。代谢组学谱进一步表明原花青素B1/B2/C1等化合物的增加，这些化合物以强抗氧化活性著称。这表明超声除了提高提取效率外，还可能选择性保留或促进代谢来源抗氧化剂的合成（Harahap等，2026）。总体而言，超声处理缩短了发酵时间，同时维持甚至增强了葡萄酒的抗氧化能力。各超声条件间的非显著差异可能归因于超声处理后抗氧化剂（如多酚）的释放和氧化酶的失活（Ma等，2020）。
【数据】CECA-0 TSS：6.53°Brix；CVE7-0 TSS：6.47°Brix；CECA对照DPPH：11.24 μM Trolox/mL，ABTS：12.49 μM Trolox/mL；CVE7对照DPPH：10.92 μM Trolox/mL，ABTS：13.24 μM Trolox/mL；CVE7超声DPPH增幅：19.60%–20.24%；CECA超声TAC显著升高（p < 0.05）；CVE7超声TFC、TFOC、TAC显著升高（p < 0.05）
3.3 超声发酵对样品颜色品质的影响
颜色是消费者判断葡萄酒品质最直观的指标，可能影响其购买决策和对风味特征的感知（Parpinello等，2009）。常用颜色空间包括CIE Lab、LCh、RGB和Luv等。本研究使用CIELab系统表征干红葡萄酒的颜色，其中L表示明度，a表示红-绿轴。
超声发酵改变了葡萄酒样品的CIELab颜色参数。经超声处理的样品表现出更高的a值（红度）和更低的褐变程度。CVE7-1样品的a值升至60.88，Red%达到55.41%，表明超声处理显著增强了葡萄酒的红色调。颜色比例的测定结果显示，超声处理增加了红葡萄酒中红色所占比例，同时降低了黄色和蓝色的比例，使酒体呈现更鲜艳的红色。聚合色素颜色（PPC）的测定进一步证实了超声处理对葡萄酒颜色稳定性的积极影响。
辅色效应与红移的测定结果显示，超声处理增强了花青素与辅色因子之间的分子间相互作用，导致最大吸收波长发生红移（Δλmax增大），辅色效应大小（M）增加。这种分子层面的颜色稳定机制有助于葡萄酒在储存过程中保持其色泽品质。
【数据】CVE7-1 a值：60.88；Red%：55.41%；超声处理增加a值、降低褐变程度；Δλmax和M值增大（原文未给出具体数值）
3.4 超声发酵对辅色因子组成的影响
超声处理显著影响了葡萄酒中辅色因子的组成。单体酚类化合物是有助于花青素辅色作用的重要成分。在超声处理的样品中，部分单体酚的含量发生变化，这些变化与花青素的稳定性密切相关。有机酸作为辅色因子之一，其组成在超声发酵后也发生了改变。矿质元素的测定结果显示，超声处理影响了葡萄酒中金属离子的含量，这可能与电导率的变化相一致。
靶向代谢组学分析揭示了超声发酵对代谢产物的整体影响。图3A展示了样品的总体聚类情况，超声处理组与对照组明显分离。PCA分析（图3B）和OPLS-DA分析（图3C）进一步确认了超声处理引起的代谢谱差异。差异代谢物与颜色特征之间的相关性分析（图3D）显示，超声上调了10种花青素及其衍生物的水平（如矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷、飞燕草素-5-O-鼠李糖苷），这些化合物与颜色参数（a值、Red%）呈显著正相关（p < 0.05）。
【数据】上调花青素及衍生物：10种；代表化合物：矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷、飞燕草素-5-O-鼠李糖苷；与a值、Red%相关性：p < 0.05
3.5 电子鼻分析
电子鼻技术用于分析超声发酵样品的香气特征。图4A显示了各样品传感器响应过程，图4B为各传感器响应的雷达图，图4C为PCA判别分析结果。
电子鼻分析结果表明，超声处理改变了葡萄酒的香气轮廓，影响了酯类和萜烯类化合物的组成。不同超声条件处理后的样品在香气特征上存在可区分的差异，这反映了超声对酵母代谢的调控作用延伸到了挥发性化合物的合成途径。
【数据】传感器响应模式因超声处理而异；酯类和萜烯类组成发生改变（原文未给出具体数值）
讨论与解读
本研究证实，超声辅助发酵能显著提升葡萄酒的生产效率与品质。优化超声参数后，发酵时间缩短了12.5%–36.1%，花青素含量增加了26.2%–50.8%。超声的机械和空化效应改善了细胞膜通透性，加速了底物摄取，并调控了酶活性，从而提高了目标代谢物的产量。值得注意的是，经超声处理的葡萄酒表现出更优的颜色特征（如红度增加、褐变减少）和更高的抗氧化能力，这归因于酚类化合物和花青素衍生物的上调。然而，不同酵母菌株对超声的响应存在差异，CVE7在花青素合成方面对超声更为敏感。这些结果凸显了超声技术作为一种高效、精准的发酵调控策略，具有巨大的工业应用潜力。未来研究应优先关注三个方向：陈酿过程中葡萄酒颜色的稳定性、不同葡萄品种在超声下的感官变化，以及大规模超声技术应用的经济可行性。此外，整合多组学方法（如转录组学和蛋白质组学）将有助于揭示超声诱导代谢转变的分子通路。
编译者解读
本研究在超声辅助发酵领域提供了一个方法学范例——通过正交实验对两株商业酵母进行“菌株特异性”参数筛选，体现了合成生物学中“宿主-条件”匹配的工程思维。值得关注的是，超声对CECA与CVE7的最优条件截然不同，提示物理胁迫调控并非“一刀切”，菌株代谢背景决定了响应方向。从应用角度看，CVE7体系中花青素含量近乎翻倍（735.76→1284.61 mg/L）且颜色参数同步提升，具备工业转化潜力。然而，超声同时改变了香气轮廓，这种“颜色-香气”权衡在精准发酵设计中需谨慎考量。未来若能将超声参数与代谢网络模型耦合，实现动态调控，将更接近“按需合成”的理想。
参考来源
Wang, J. (2026). Strategic ultrasonic regulation of Saccharomyces cerevisiae fermentation for enhanced anthocyanin production and wine quality. Food Research International, 2026. DOI: 10.1016/j.foodres.2026.118996
DOI: 10.1016/j.foodres.2026.118996