来源：Aspergillus niger growth on upcycled cyanobacterial biomass, and Martian and lunar minerals（Acta Astronautica）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
地外栖息地的建立不能完全依赖地球资源补给。蓝藻已被视为生物再生生命支持系统的关键组分，而真菌的潜力尚未充分挖掘。本研究以黑曲霉（Aspergillus niger）为对象，检验其能否利用月球与火星风化层模拟物的水释放矿物，以及两种鱼腥藻（Anabaena sp. PCC 7120 和 PCC 7938）的生物质作为营养源。结果显示，机械裂解的 PCC 7938 裂解液可支持黑曲霉生长，达到阳性对照约 30% 的生物量；FEP 袋式生物反应器在模拟微重力下表现良好，且检测到疑似柠檬酸的产生。
研究背景
距阿波罗任务最后一次登月已逾 50 年，载人深空探测正在重启。Artemis 计划目标是在 2025 年后将宇航员再次送上月球表面，ISECG 的太空探索路线图也将 2050 年前建立月球和火星前哨站列为目标。然而，这些前哨站无法完全依赖地球资源——目前将 1 kg 载荷送至月球表面的成本估计在 1.08 万美元至 120 万美元之间，运往火星表面的成本预计更高。长达数月的转运时间进一步加剧了后勤挑战，要求系统具备更高的自主性。
未来探索任务中的必需品生产将依赖两条互补的技术路径：生命支持系统（LSS）与原位资源利用（ISRU）。一个功能完备的 LSS 需能生产、回收和再生人类生存所需的全部资源——食物、饮用水、可呼吸空气，并维持温度、湿度、气压等关键环境参数。理想系统还应具备制药、燃料生产、辐射防护、按需制造等功能。当前的 LSS 和 ISRU 技术尚不足以确保月球和火星栖息地的完全自主运行。蓝藻被认为是生物再生生命支持系统中最有前景的组分之一，但真菌的研究仍相当匮乏。黑曲霉已证明在太空相关条件下具有耐受性，在生命支持系统中具有可观的应用潜力。本研究通过测试黑曲霉在月球和火星上可能获得的资源（风化层和蓝藻生物质）上的生长情况，对其纳入未来生命支持系统的可行性进行了概念验证评估。
研究方法
2.1 菌株与培养维持
测试了两种蓝藻菌株作为真菌生长的营养来源：Anabaena sp. PCC 7120（以下简称 PCC 7120）和 Anabaena sp. PCC 7938（以下简称 PCC 7938），均来自巴斯德蓝藻培养物保藏中心（法国巴黎）。PCC 7120 在 BG-11₀ 培养基（不含硝酸盐的 BG-11 培养基）中培养，光照强度 10–20 μmol photons⋅m⁻²⋅s⁻¹（16:8 h 光暗周期），温度 25 °C，温和振荡（60–80 rpm）。PCC 7938 同样在 BG-11₀ 培养基中培养，使用 5 L Schott 瓶，以约 1 L⋅min⁻¹ 的速率通入富含 1% CO₂ 的 N₂，光子通量密度为 10 μmol photons⋅m⁻²⋅s⁻¹（16:8 h 光暗周期）。培养基中未添加抗生素。
用于测试的真菌菌株为黑曲霉野生型（N402）。黑曲霉孢子溶液由 30 °C 下在完全培养基上培养 3 天的培养物制备。完全培养基组成：55 mM 葡萄糖、11 mM KH₂PO₄、7 mM KCl、178 nM H₃BO₃、2 mM MgSO₄、76 nM ZnSO₄、70 mM NaNO₃、6.2 nM Na₂MoO₄、18 nM FeSO₄、7.1 nM CoCl₂、6.4 nM CuSO₄、25 nM MnCl₂、174 nM EDTA、0.5%（w/v）酵母提取物、0.1%（w/v）酪蛋白氨基酸和每升 15 g 琼脂。用 10 mL 生理盐水（0.9% NaCl）淹没琼脂平板，用棉签收集孢子。为去除菌丝碎片，孢子悬液用 Miracloth（Millipore）过滤。孢子悬液保存在 4 °C，两周内使用。孢子计数使用 Neubauer 计数板进行。
【数据】培养基：BG-11₀；光照：10–20 μmol photons⋅m⁻²⋅s⁻¹；光周期：16:8 h；温度：25°C；振荡：60–80 rpm；通气速率：约 1 L⋅min⁻¹；CO₂：1%；真菌培养温度：30°C；培养时间：3 天；孢子储存：4°C、2 周内
2.2 水释放矿物（WRM）的制备
水释放矿物（WRM）溶液由月球高地模拟物 LHS-1 或火星全球模拟物 MGS-1（Space Resource Technologies，美国佛罗里达州；补充表 1）制备。WRM 制备遵循改编自 Fernandez 等人的方案。简要流程如下：将每种风化层模拟物悬浮于 1 L 去离子无菌水（dH₂O）中，终浓度为 40 g L⁻¹。锥形瓶在 200 rpm、室温（RT）下振荡过夜，随后以 100g 离心 10 min。收集上清液，用 0.2 μm 过滤器过滤至无菌玻璃瓶中，储存于 4 °C（图 1）。所得溶液分别称为月球 WRM（lWRM）和火星 WRM（mWRM）。两种溶液在过滤前后均测量了 pH，数值保持不变：mWRM 为 7.65，lWRM 为 9.10。
【数据】模拟物浓度：40 g L⁻¹；振荡：200 rpm、室温、过夜；离心：100g、10 min；过滤：0.2 μm；储存：4°C；pH：mWRM 7.65、lWRM 9.10
2.3 蓝藻生物质的制备
蓝藻细胞通过 6000g 离心 10 min 收集。所得沉淀用 1 mL dH₂O 洗涤两次，在 60 至 70 °C 的培养箱中干燥 3 至 5 天。机械裂解采用改编自 Santos de Sousa 等人的珠磨方案。将干燥沉淀重悬于 1 mL dH₂O、mWRM 或 lWRM 中，按与沉淀体积 1:1 的比例加入硅珠（直径 0.1 mm）。细胞破碎通过多轮 6800 rpm 均质 2 min（Precellys Evolution 均质仪，Bertin Technologies）实现，每轮之间在冰上间隔 1 min 以防止过热，总均质时间为 18 min。裂解液在光学显微镜下检查以确认细胞破碎成功（图 2）。所得悬浮液随后以 6000g 离心 5 min，收集上清液用作真菌生长培养基。溶液在使用前保存于 −20 °C。
【数据】离心：6000g、10 min；干燥：60–70°C、3–5 天；重悬体积：1 mL；硅珠直径：0.1 mm；硅珠比例：1:1（与沉淀体积比）；均质：6800 rpm、2 min/轮、共 18 min；冰上间隔：1 min；二次离心：6000g、5 min；储存：−20°C
2.4 标准地球重力下的真菌生长
所有标准地球重力（1g）下的真菌生长实验均在平底 12 孔板（Frilabo II，葡萄牙）中进行。每孔以每 mL 10⁶ 个黑曲霉孢子的接种量接种，终体积为 3 mL 测试培养基。培养物在室温下置于轨道振荡器上，设定 120 rpm，培养 7 天。培养结束后，将培养物转移至无菌 1.5 mL Eppendorf 管中，以 6000g 离心 10 min。生物量沉淀在 60–70 °C 下干燥 3 至 5 天，直至达到恒重。使用分析天平对生物量进行定量。表 1 描述了正常重力下测试的真菌生长培养基组成。
首先，为评估黑曲霉能否利用 mWRM 或 lWRM 中的无机营养物，进行了将月球或火星 WRM 稀释于极限培养基（MM；55 mM 葡萄糖、11 mM KH₂PO₄、7 mM KCl、178 nM H₃BO₃、2 mM MgSO₄、76 nM ZnSO₄、70 mM NaNO₃、6.2 nM Na₂MoO₄、18 nM FeSO₄、7.1 nM CoCl₂、6.4 nM CuSO₄、25 nM MnCl₂、174 nM EDTA）中的实验，WRM 终浓度分别为 99%、95%、90%、75% 和 50%（v/v）（实验 I 和 II，表 1）。同时，将 MM 稀释于 dH₂O 中，获得等效 MM 浓度 1%、5%、10%、25% 和 50%（v/v）（实验 III，表 1）。这些 dH₂O–MM 条件作为营养补充的阴性对照。实验设 6 个独立生物学重复（n = 6）。
其次，为评估蓝藻细胞作为黑曲霉营养源的适用性，进行了使用由 1 g L⁻¹ PCC 7120 稀释于 mWRM、lWRM 或 dH₂O（对照）制备的培养基来量化真菌生长的实验。PCC 7120 生物质以未经任何预处理（NT）或经机械裂解两种方式添加（实验 IV，表 1）。该实验用 PCC 7938 的生物质重复进行，但排除了 NT 条件——因为用 PCC 7120 进行的测试已证明未经处理的蓝藻生物质不适合作为黑曲霉生长的营养源（实验 V，表 1）。实验 IV 和 V 均设 3 个独立生物学重复（n = 3）。
【数据】接种量：10⁶ 孢子/mL；孔板体积：3 mL/孔；培养：室温、120 rpm、7 天；离心：6000g、10 min；干燥：60–70°C、3–5 天；WRM 浓度梯度：99%、95%、90%、75%、50%（v/v）；MM 浓度梯度：1%、5%、10%、25%、50%（v/v）；蓝藻生物质浓度：1 g L⁻¹；生物学重复：实验 I–III n=6，实验 IV–V n=3
2.5 模拟微重力下的真菌生长
黑曲霉进一步在模拟微重力（μg）条件下生长，使用改良型 IKA 滚轴-回转培养器（clinostat），转速 10 rpm（IKA-Werke GmbH & Co. KG，德国）。实验在具有透气膜的氟化乙烯丙烯（FEP）液体培养袋（C-bags，Saint Gobain）中进行，该培养袋先前已被验证为改变重力模拟的概念验证培养系统。培养基以每 mL 10⁶ 个黑曲霉孢子的密度接种，总体积 45 mL。生物反应器袋在室温（22°–24 °C）下于模拟微重力条件下培养 7 天——将袋子夹在两根金属棒之间，液体样品距旋转轴中心最大距离为 2 cm，以实现估计重力值 2.2 × 10⁻³ g（图 3）。地球重力（1g）下的对照袋置于架子上，以 120 rpm 振荡，室温培养。每个条件设两个独立生物学重复。
测试的培养基包括：阳性对照（100% MM）；由 1 g L⁻¹ PCC 7938 裂解液稀释于 mWRM 或 lWRM 中组成的培养基；以及 75% mWRM 和 lWRM 稀释于 MM（v/v）的培养基。选择 75% WRM 稀释度是基于正常地球重力下实验的初步结果（图 4）——25% MM 是仍能支持真菌生长显著高于阴性对照的最低 MM 浓度。7 天培养期结束后，将培养物转移至无菌 50 mL Falcon 管中，以 6000g 离心 10 min。所得沉淀在 60 至 70 °C 下干燥 3 至 5 天，直至达到恒重，使用分析天平定量生物量。
【数据】回转培养器转速：10 rpm；培养袋：FEP 透气膜袋；接种量：10⁶ 孢子/mL；总体积：45 mL；培养时间：7 天；温度：22–24°C；旋转半径：≤2 cm；估计重力：2.2 × 10⁻³ g；对照振荡：120 rpm；生物学重复：n=2；WRM 稀释度：75%（v/v）
2.6 模拟微重力下柠檬酸异构体的 LC-MS/MS 检测
模拟微重力实验 7 天培养期结束后，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析评估柠檬酸产量。为此，从每个 FEP 袋培养物中收集 1 mL 上清液，冻干后重悬于 100 μL 含 0.1% 甲酸的 50% 甲醇中。分析系统为 Thermo Finnigan Surveyor 高效液相色谱系统（Thermo Scie...（原文截断）
【数据】样品体积：1 mL 上清液；冻干后重悬：100 μL 50% 甲醇（含 0.1% 甲酸）；检测模式：负离子模式；目标离子：m/z 191 [M−H]⁻；产物离子：m/z 173 和 111
研究结果
3.1 黑曲霉在月球和火星模拟物水释放矿物上的生长
为评估黑曲霉利用月球和火星风化层模拟物中无机矿物的潜力，首先在三种不同溶液中测试了极限培养基稀释度（1%、5%、10%、25% 和 50%（v/v））下的生长情况：月球水释放矿物（lWRM）、火星水释放矿物（mWRM）和 dH₂O（阴性对照）。在多孔板中生长 7 天后（每孔总体积 3 mL），对生物量进行定量，结果如图 4 所示。
对于全部三个实验，统计学确认处理是生物量产量的主要决定因素（p < 0.0001，单因素方差分析）。正如预期，生物量积累随 MM 浓度增加而逐步上升，阳性对照（100% MM）中最大值为 7.5–8.6 mg（2.48–2.86 g L⁻¹）。阳性对照与阴性对照（dH₂O）之间的生物量积累差异始终具有统计学显著性（p < 0.0001）。
单独的火星或月球 WRM 不能支持真菌生长——100% mWRM 或 100% lWRM 的培养基条件下生物量产量可忽略不计。然而，当 WRM 与 MM 结合时，观察到具有统计学显著性的生物量产生（与 100% dH₂O 相比）。例如，在 MM 稀释于 mWRM 中生长的培养物（图 4(A)）中，实验条件与阴性对照（100% dH₂O）之间的统计学显著差异出现在 10%、25% 和 50% MM 处。这些条件下的生物量积累分别为 1.1 mg（0.36 g L⁻¹）、2.2 mg（0.72 g L⁻¹）和 3.4 mg（1.12 g L⁻¹）。
黑曲霉在 lWRM 稀释于 MM 中的生长呈现出类似结果（图 4(B)）。相对于阴性对照的统计学显著差异出现在 MM 浓度为 5%、10%、25% 和 50% 的 lWRM 条件下。这些条件下的生物量积累分别达到 1.6 mg（0.53 g L⁻¹）、2.1 mg（0.70 g L⁻¹）、2.7 mg（0.88 g L⁻¹）和 4.0 mg（1.32 g L⁻¹）。
另一方面，黑曲霉在 MM 稀释于 dH₂O 中的生长（图 4(C)）仅在 25% 和 50% MM 条件下显示出与阴性对照相比的统计学显著差异，生物量积累分别为 1.6 mg（0.53 g L⁻¹）和 2.7 mg（0.91 g L⁻¹）。
【数据】阳性对照（100% MM）最大生物量：7.5–8.6 mg（2.48–2.86 g L⁻¹）；mWRM 中 10%/25%/50% MM 生物量：1.1/2.2/3.4 mg（0.36/0.72/1.12 g L⁻¹）；lWRM 中 5%/10%/25%/50% MM 生物量：1.6/2.1/2.7/4.0 mg（0.53/0.70/0.88/1.32 g L⁻¹）；dH₂O 中 25%/50% MM 生物量：1.6/2.7 mg（0.53/0.91 g L⁻¹）；统计：p < 0.0001（单因素 ANOVA）
3.2 黑曲霉在蓝藻生物质和水释放矿物上的生长
为评估蓝藻生物质支持真菌生长的潜力，使用 Anabaena sp. PCC 7120 进行了初步实验（实验 IV，表 1）。测试了两种生物质条件——未经处理（NT）和机械细胞裂解——支持真菌生长的能力。蓝藻生物质稀释于不同培养基（dH₂O、mWRM 或 lWRM）中，多孔板中每孔总体积 3 mL。结果见补充图 1。
生物质预处理是结果变异的主要来源，对真菌生长具有统计学显著影响（p < 0.0001，双因素方差分析）。未经处理的生物质导致可忽略不计的生物量积累（0.1–0.2 mg）。显微镜检查显示，大多数孢子没有萌发迹象（补充图 2）。
相比之下，机械裂解的生物质在稀释于 WRM 溶液中时支持了真菌生长。裂解的 PCC 7120 在 mWRM 和 lWRM 中支持的真菌生长显著高于各自的 NT 条件（p < 0.0001，双因素方差分析），生物量积累分别为 1.5 mg（0.48 g L⁻¹）和 1.0 mg（0.32 g L⁻¹）。
由于未经处理的蓝藻生物质无法支持黑曲霉生长，后续实验仅使用裂解生物质。相应地，对裂解的 PCC 7120 和 PCC 7938（稀释于 dH₂O、mWRM 或 lWRM 中）进行了测试，以直接比较它们支持真菌生长的能力（实验 V，表 1）。结果如图 5 所示。
Kruskal-Wallis 检验表明各条件之间存在统计学显著差异（p = 0.0031）。使用 Dunn 多重比较检验的事后分析未发现稀释培养基相同但蓝藻菌株不同的条件之间存在统计学显著差异。尽管如此，在裂解的 PCC 7938 上生长的真菌生物量产量始终高于 PCC 7120。裂解的 PCC 7938 在水中平均产生 3.4 mg（1.13 g L⁻¹），在 mWRM 中为 3.6 mg（1.21 g L⁻¹），在 lWRM 中为 3.2 mg（1.06 g L⁻¹）。相比之下，裂解的 PCC 7120 仅达到约 0.4–1.0 mg 的生物量（0.13–0.33 g L⁻¹），取决于培养基。
【数据】NT 生物量：0.1–0.2 mg；裂解 PCC 7120 在 mWRM/lWRM 中：1.5/1.0 mg（0.48/0.32 g L⁻¹）；裂解 PCC 7938 在 dH₂O/mWRM/lWRM 中：3.4/3.6/3.2 mg（1.13/1.21/1.06 g L⁻¹）；裂解 PCC 7120 各培养基：0.4–1.0 mg（0.13–0.33 g L⁻¹）；统计：p < 0.0001（双因素 ANOVA）；p = 0.0031（Kruskal-Wallis）
3.3 模拟微重力下黑曲霉的生长
模拟重力条件下 7 天培养期后获得的真菌生物量结果如图 6 所示。在模拟微重力（μg）和标准地球重力（1g）下生长的培养物之间观察到宏观形态学差异。在 1g 条件下，真菌形成附着于袋式生物反应器内表面的生物膜。相比之下，μg 导致形成悬浮的生物量团块（补充图 3）。
最大生物量积累出现在 MM 中，1g 下达 81.9 mg（1.82 g L⁻¹），μg 下为 74.8 mg（1.66 g L⁻¹）。在 75% mWRM 稀释于 MM 中的生长在 1g 下产生 65.5 mg（1.47 g L⁻¹），μg 下产生 58.6 mg（1.30 g L⁻¹），分别相当于阳性对照（1g 下 MM）的 81% 和 72%。另一方面，在 75% lWRM 稀释于 MM 中生长的培养物产生的生物量低得多，1g 下仅 8.1 mg（0.18 g L⁻¹），μg 下 15.1 mg（0.33 g L⁻¹）。
使用裂解的 PCC 7938 生物质稀释于 mWRM 中生长时，1g 下产生 28.8 mg（0.64 g L⁻¹），μg 下产生 37.6 mg（0.83 g L⁻¹）；PCC 7938 稀释于 lWRM 中时，1g 下产生 27.7 mg（0.61 g L⁻¹），μg 下产生 22.7 mg（0.50 g L⁻¹）。
【数据】MM 阳性对照：1g 81.9 mg（1.82 g L⁻¹）、μg 74.8 mg（1.66 g L⁻¹）；75% mWRM/MM：1g 65.5 mg（1.47 g L⁻¹）、μg 58.6 mg（1.30 g L⁻¹）；75% lWRM/MM：1g 8.1 mg（0.18 g L⁻¹）、μg 15.1 mg（0.33 g L⁻¹）；PCC 7938 裂解液/mWRM：1g 28.8 mg（0.64 g L⁻¹）、μg 37.6 mg（0.83 g L⁻¹）；PCC 7938 裂解液/lWRM：1g 27.7 mg（0.61 g L⁻¹）、μg 22.7 mg（0.50 g L⁻¹）
3.4 模拟微重力下黑曲霉培养物中柠檬酸的积累
在 FEP 袋式生物反应器中培养 7 天后，在模拟微重力和标准地球重力下的培养物上清液中均检测到一种与柠檬酸一致的化合物。负离子模式 LC-MS/MS 分析显示去质子化分子离子为 m/z 191，对应柠檬酸的预期 [M−H]⁻ 离子。随后的 CID 碎裂产生特征性产物离子 m/z 173 和 111，在相同条件下分析的真实柠檬酸标准品中也观察到了这些离子。
被归属为柠檬酸样化合物的峰在 5.4 min 的保留时间处被检测到，而参考标准品在 3.9 min 处洗脱。尽管保留时间的差异排除了明确鉴定的可能，但前体离子和产物离子的一致性支持将该检测到的化合物初步归属为柠檬酸。定性结果总结于表 2，代表性色谱图见补充图 4–5。
简言之，在分析的时间点，柠檬酸样化合物在添加 mWRM 的黑曲霉培养物上清液中被检测到（75% mWRM 稀释于 MM，以及 PCC 7938 裂解液稀释于 mWRM 中）。在 μg 和 1g 条件下均检测到。相比之下，在阳性对照（100% MM）以及含有 lWRM 的培养物上清液（75% lWRM 稀释于 MM，以及 PCC 7938 裂解液稀释于 lWRM 中）中未鉴定出柠檬酸。
为获得样品中柠檬酸浓度的半定量结果，使用四种柠檬酸标准品绘制了校准曲线。回归方程 y = 787.52x + 251.50 在 0.5–10 mg L⁻¹ 范围内表现出优异的线性响应，决定系数 R² 为 0.9978（补充图 6，补充表 2）。仪器 LOQ 和 LOD 分别为 0.630 mg L⁻¹ 和 1.909 mg L⁻¹。方法 LOQ 和 LOD 相应计算为 0.126 mg L⁻¹ 和 0.382 mg L⁻¹。对于检测到柠檬酸的样品，估计的柠檬酸浓度和相应保留时间见表 3。
【数据】目标离子：m/z 191；产物离子：m/z 173、111；样品保留时间：5.4 min；标准品保留时间：3.9 min；校准曲线：y = 787.52x + 251.50；线性范围：0.5–10 mg L⁻¹；R² = 0.9978；仪器 LOQ/LOD：0.630/1.909 mg L⁻¹；方法 LOQ/LOD：0.126/0.382 mg L⁻¹
讨论与解读
本研究旨在提供概念验证，证明丝状真菌培养物可以可持续地整合到生物再生生命支持系统中。结果表明，黑曲霉可以通过 ISRU（月球和火星风化层）利用现场可用资源，以及通过升级循环预先建立的 BLSS 模块中的资源（蓝藻生物质）而纳入未来的太空栖息地。研究还提供了其在模拟微重力下生长的初步证据，使用的是经过太空验证的生物反应器。
WRM 制备方案在原有基础上增加了过滤步骤，以去除离心后仍悬浮在溶液中的细小矿物颗粒。这些颗粒在模拟微重力环境中可能造成显著问题——影响回转培养诱导的细胞浮力。过滤步骤对未来 WRM 应用有益，尤其是对光自养生物的生长——悬浮颗粒引起的浊度增加可能减少光穿透，从而限制光合效率。
黑曲霉在火星 WRM 条件下表现优于月球 WRM。在模拟微重力实验中，75% mWRM 稀释于 MM 中达到了阳性对照的 81%（1g）和 72%（μg），而 lWRM 条件下仅达到约 10–20%。这与 lWRM 较高的 pH（9.10 vs 7.65）可能有关——碱性环境不利于黑曲霉生长。
编译者解读
本研究巧妙地将"废弃物"转化为资源：蓝藻生物质经珠磨裂解后释放的胞内营养物，配合火星风化层浸出液中的无机矿物，构成了黑曲霉可用的复合培养基。FEP 袋在模拟微重力下与 1g 无显著差异的结果值得关注——这为未来空间站采用柔性膜反应器培养真菌提供了依据。局限在于柠檬酸的鉴定仅为初步（保留时间偏移 1.5 min），且未对真菌产物做进一步功能验证。从合成生物学角度看，黑曲霉作为著名的有机酸生产宿主，其在轨培养若能结合工程改造，有望成为地外环境中的"微型化工厂"。
参考来源
Santos de Sousa I. Aspergillus niger growth on upcycled cyanobacterial biomass, and Martian and lunar minerals. Acta Astronautica, 2026. DOI: 10.1016/j.actaastro.2026.07.034
DOI: 10.1016/j.actaastro.2026.07.034