来源：DNA dumbbell-switched CRISPR/Cas13a biosensor for detecting human glycosylases with target-initiated cleavage-ligation-transcription cascade（Microchemical Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
人8-氧鸟嘌呤糖基化酶1（hOGG1）是碱基切除修复通路的关键酶，其异常表达与多种癌症密切相关。本研究构建了一种哑铃状DNA探针开关的CRISPR/Cas13a荧光生物传感器，将hOGG1对8-氧鸟嘌呤（8-oxoG）的特异性识别转化为滚环转录产生的crRNA，进而激活Cas13a的反式切割活性。该方法无需洗涤步骤，检测限达0.008 U/mL，并在细胞系和临床组织样本中验证了实用性。
研究背景
人类基因组持续遭受大量DNA损伤的挑战，每细胞每天因环境和内源性因素可产生超过10万处细胞毒性损伤。其中，氧化损伤是对基因组完整性的主要威胁。作为碱基切除修复（BER）通路的核心组分，hOGG1通过识别并切除8-oxoG:C碱基对中的8-oxoG来启动修复，清除这一高度致突变的氧化产物。研究表明，hOGG1不仅保护核DNA，还参与线粒体DNA维护、细胞氧化应激响应调控，并减少癌症倾向突变。hOGG1功能异常会导致损伤切除不彻底，直接引发G:C到T:A的颠换和基因组不稳定性升高。多项研究已将hOGG1失调与前列腺癌、肺癌、结直肠癌和胃癌等发病机制紧密关联，确立了其作为诊断生物标志物和潜在治疗靶点的临床价值。
研究方法
2.1 材料与试剂
HPLC纯化的DNA和RNA寡核苷酸由上海生工生物技术有限公司提供，序列列于支持信息表S1。hOGG1、hAAG、UDG、FEN1、Exo I、APE1、T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶反应缓冲液（50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl₂，1 mM ATP，10 mM DTT，pH 7.5）、T7 RNA聚合酶、RNAPol反应缓冲液（40 mM Tris-HCl，6 mM MgCl₂，1 mM DTT，2 mM亚精胺，pH 7.9）及rNTP混合物均购自New England BioLabs（美国马萨诸塞州）。LwaCas13a核酸酶（C2c2）购自近岸蛋白（苏州）。细胞培养用品包括胎牛血清（FBS）、1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）和DMEM培养基，由Gibco（上海）提供。GES-1、HGC-27和AGS细胞系购自ATCC（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。TAE缓冲液、核蛋白提取试剂盒、上样缓冲液、琼脂糖、4S Red Plus核酸染料、DNA marker A（25–500 bp）及焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水均由上海生工生物技术有限公司供应。
【数据】缓冲液成分：T4 DNA连接酶缓冲液（50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl₂，1 mM ATP，10 mM DTT，pH 7.5）；RNAPol缓冲液（40 mM Tris-HCl，6 mM MgCl₂，1 mM DTT，2 mM亚精胺，pH 7.9）；细胞系：GES-1、HGC-27、AGS
2.2 DNA储备溶液的制备
寡核苷酸储备溶液以Tris-HCl缓冲液配制。功能探针（FPs）通过热退火过程组装。具体而言，FPs溶液加热至95°C保持5分钟，随后缓慢冷却至25°C，使其折叠形成哑铃状功能探针（DFPs）。
【数据】退火温度：95°C（5 min）→ 25°C（缓慢冷却）
2.3 哑铃开关CRISPR/Cas13a生物传感器检测hOGG1的操作流程
检测hOGG1活性时，将底物探针（5 nM）与不同浓度的hOGG1在37°C孵育20分钟。随后向混合物中加入T4 DNA连接酶，连接反应进行45分钟。之后添加T7 RNA聚合酶和rNTPs启动滚环转录（RCT）反应1小时。最后，将RCT产物与Cas13a蛋白、RNA激活剂（ssRNA）和FQ报告分子混合，在37°C进行Cas13a切割反应1小时。荧光光谱以488 nm激发、520 nm发射记录。
【数据】底物探针浓度：5 nM；hOGG1孵育：37°C、20 min；T4 DNA连接酶连接：45 min；RCT转录：1 h；Cas13a切割：37°C、1 h；荧光检测：激发488 nm/发射520 nm
2.4 细胞提取物制备
GES-1、HGC-27和AGS细胞系在含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM中培养。所有细胞在37°C、含5% CO₂的湿润气氛中维持。细胞活力和计数使用Vi-cell™ XR活力分析仪（Beckman Coulter，美国）测定。核蛋白提取物按照商业核蛋白提取试剂盒说明书制备。细胞样本中hOGG1活性分析遵循第2.3节所述流程，以等体积制备的核蛋白提取物替代hOGG1标准溶液。
【数据】培养基：DMEM + 10% FBS + 100 U/mL青霉素 + 100 μg/mL链霉素；培养条件：37°C、5% CO₂
2.5 组织样本分析
人组织样本包括正常胃组织、胃癌组织和配对癌旁组织，取自复旦大学附属华东医院患者。所有涉及人类受试者的程序均按照复旦大学附属华东医院机构审查委员会批准的伦理标准进行。使用核蛋白提取试剂盒从组织样本中提取核蛋白。组织提取物中hOGG1活性分析方法与第2.3节所述方法相同，以组织核蛋白提取物替代hOGG1标准品。
【数据】组织类型：正常胃组织、胃癌组织、配对癌旁组织；样本来源：复旦大学附属华东医院
研究结果
3.1 哑铃开关CRISPR/Cas13a生物传感器检测hOGG1的原理
本研究采用CRISPR/Cas13a系统同时作为信号放大器和报告模块来检测hOGG1。传感机制示意于图1和图S1。作为碱基切除修复通路的关键酶，hOGG1识别并切除双链DNA中的8-oxoG损伤。为利用这一活性，研究设计了含有嵌入8-oxoG残基的哑铃状功能探针（DFPs）。探针茎部的一段序列与Cas13a crRNA激活区互补，环状结构域则用于促进转录起始和crRNA支架装配。哑铃探针通过单链DNA模板的自折叠构建，无需杂交多条寡核苷酸，简化了探针组装过程。
存在hOGG1时，8-oxoG碱基首先被切除，产生脱碱基位点。该位点随后被相关的AP内切酶活性切割，产生带有可连接末端的切口探针。切口位点由T4 DNA连接酶封闭，形成环化探针，再由T7 RNA聚合酶通过体外转录进行转录。这一过程产生含有重复crRNA序列的长RNA转录本。这些crRNA引导Cas13a发生靶标诱导的构象变化，激活其非特异性反式切割活性。激活的Cas13a随即切割周围淬灭的荧光ssRNA报告分子，导致荧光恢复。
不存在hOGG1时，探针保持完整，无法环化，RCT和Cas13a激活均被阻止。因此，荧光增强仅在靶标存在时发生。该设计的一个关键优势在于，Cas13a仅在hOGG1依赖的切割、连接和转录之后才被激活，无需中间洗涤步骤即可最小化背景信号。通过将hOGG1特异性碱基切除与连接介导的环化及CRISPR扩增相结合，该策略为检测DNA修复酶活性提供了特异性强、灵敏度高且免洗涤的平台。
【数据】探针结构：哑铃状单链DNA自折叠；含8-oxoG残基；信号机制：hOGG1切割→连接酶环化→RCT转录→Cas13a反式切割
3.2 自生成crRNA依赖的Cas13a激活系统验证
哑铃开关CRISPR/Cas13a生物传感器依赖于hOGG1对损伤碱基的切除，以实现后续的连接、转录和Cas13a激活。为阐明探针底物经hOGG1、T4 DNA连接酶和T7 RNA聚合酶依次处理后的逐步构象变化，通过琼脂糖凝胶电泳分析了反应过程（图2A和S2）。泳道1为完整的哑铃状功能探针（DFPs）。与hOGG1孵育后产生电泳迁移率增加的产物（泳道2），对应特异性切割的探针。随后经T4 DNA连接酶连接切割探针产生环化产物（泳道3），其迁移率相似，表明分子密度无显著变化。泳道4中明显的拖尾条带确认为RCT衍生的RNA转录本。相比之下，省略hOGG1则阻止了必要的结构改变，从而阻断T4 DNA连接酶介导的封闭和后续的RCT转录，表现为转录本条带的缺失（泳道5）。
随后，为评估各组分的贡献并确认Cas13a反式切割，使用淬灭报告分子记录了荧光响应（图2B）。省略hOGG1时仅观察到可忽略的背景信号。稳健的荧光增强需要所有元素同时存在，证实了CRISPR/Cas13a反式切割的成功激活。
进一步研究了不同的孵育模式（图2C）。比较了两种策略：一步法——将hOGG1切割和连接在同一管中同时进行；两步法——切割和连接独立进行。相应地，评估两种模式下荧光响应与hOGG1浓度的关系，结果显示分步方法产生了最佳信号输出（图2D）。综上，这些结果表明分步孵育方案在给定hOGG1浓度下最大化RCT产物，从而显著提高了检测灵敏度。
【数据】电泳验证：泳道1=完整DFPs；泳道2=hOGG1切割产物（迁移率增加）；泳道3=环化产物；泳道4=RCT转录本（拖尾条带）；泳道5=无hOGG1对照（无转录本条带）；孵育模式：分步法优于一步法
3.3 传感条件优化
基于所提出的传感方案，哑铃开关CRISPR/Cas13a生物传感器的性能受反应组分浓度和每步持续时间的影响。因此，通过评估关键参数系统优化了分析条件。
首先考察了T4 DNA连接酶的浓度（图3A-B）。荧光强度快速增加并在200 U/mL以上趋于稳定，选择该浓度作为提供最高信噪比（S/N）的最佳浓度。连接时间对扩增效率同样关键（图3C-D）。S/N比随时间上升并在45分钟达到峰值，表明连接步骤完成。进一步延长时间无法改善信号，因此选择45分钟作为最佳时长。
接下来评估了T7 RNA聚合酶的浓度。T7 RNA聚合酶是源自噬菌体T7的DNA依赖性酶，可在等温条件下实现高产率RNA合成。如图3E-F所示，荧光快速增加并在400 U/mL以上趋于平缓。然而，更高浓度导致背景信号升高。因此，100 U/mL被确定为最大化S/N比的最佳浓度。同样，转录时间也经过优化（图3G-H）。S/N比在60分钟后达到最大值，确认转录充分，更长的孵育时间无额外收益。
随后优化了rNTPs和ssRNA的浓度。荧光随rNTPs浓度增加而增强，在150 nM以上达到平台期（图3I-J），确定最佳rNTP水平为150 nM。同样，荧光随ssRNA浓度增强并在120 nM以上趋于稳定（图3K-L），确定120 nM为最佳ssRNA浓度。
最后考察了Cas13a浓度和激活时间。荧光随Cas13a浓度上升，25 nM时获得最佳S/N比（图3M-N）。激活反应中，S/N比随时间增加并在60分钟达到最大值（图3O-P），表明激活完全，更长时间孵育无额外益处。这些优化条件被用于后续实验。
【数据】T4 DNA连接酶最佳浓度：200 U/mL；最佳连接时间：45 min；T7 RNA聚合酶最佳浓度：100 U/mL；最佳转录时间：60 min；最佳rNTP浓度：150 nM；最佳ssRNA浓度：120 nM；最佳Cas13a浓度：25 nM；最佳激活时间：60 min
3.4 哑铃开关CRISPR/Cas13a生物传感器的分析性能
在优化条件下，哑铃开关CRISPR/Cas13a生物传感器对不同浓度hOGG1的信号响应如图4A所示。随着hOGG1水平增加，荧光强度逐渐增强，与系统的开启型特征一致（图4B-C）。数据在hOGG1浓度0.05至96 U/mL的动态范围内良好拟合线性回归模型，方程为F = 1888c(hOGG1) + 32,564.4（R² = 0.9928），其中F代表520 nm处的荧光强度（图4D）。根据3σ/k准则，检测限（LOD）计算为0.008 U/mL。
值得注意的是，与已报道的hOGG1生物传感器相比，该分析性能具有竞争力（表S2）。高灵敏度可归因于整合的级联放大策略——RCT转录扩增、非靶标激活的Cas13a附带切割以及开启型荧光读出模式。此外，该策略有效最小化了无hOGG1时的背景信号，进一步提升了分析性能。低背景可能源于hOGG1的高底物特异性、高效的连接封闭以及Cas13a激活的严格门控特性。
【数据】线性范围：0.05–96 U/mL；回归方程：F = 1888c + 32,564.4；R² = 0.9928；检测限：0.008 U/mL（3σ/k准则）
3.5 生物样本中hOGG1表达分析
为验证该生物传感器在复杂生物环境中的实用性，首先检测了不同细胞系核提取物中的hOGG1活性（图5）。HGC-27（胃癌细胞系）和AGS（胃腺癌细胞系）表现出较强的荧光信号，而正常胃上皮细胞GES-1的信号相对较低。这一结果与胃癌细胞中hOGG1过表达的现象一致。进一步对HGC-27细胞提取物进行不同处理：加热灭活或添加hOGG1抑制剂后，荧光信号显著降低，证实了信号确实来源于hOGG1的酶活性。
【数据】细胞系信号：HGC-27（高）、AGS（高）、GES-1（低）；灭活/抑制处理后信号显著降低
讨论与解读
本研究展示了一种哑铃开关CRISPR/Cas13a生物传感器，通过自生成crRNA依赖的Cas13a激活系统实现hOGG1的灵敏、特异检测。在该系统中，hOGG1响应的哑铃DNA探针被特异性切割并封闭为环状模板，使滚环转录产生大量crRNA，触发Cas13a的强效附带切割。实际应用通过细胞裂解液和临床组织标本中hOGG1的准确定量得到验证，凸显了在生化研究和伴随诊断中的潜力。
与已报道的hOGG1检测方法相比，该系统具有明显优势。第一，协同整合hOGG1启动的碱基切除、结构选择性连接和聚合酶驱动的转录，实现高效级联放大，检测限达0.008 U/mL。第二，哑铃探针的结构特异性设计和T7启动子非依赖性转录大幅简化了实验流程和探针设计。此外，通过简单重编程哑铃探针的底物区域，该系统可轻松扩展以检测多种DNA糖基化酶，凸显其普适性。
编译者解读：该工作的核心创新在于将hOGG1的碱基切除活性与CRISPR/Cas13a的信号放大能力通过"哑铃探针开关"巧妙耦合，实现了无需洗涤步骤的均相检测。从合成生物学应用角度看，这种"靶标识别→结构转换→核酸扩增→CRISPR效应"的模块化设计思路具有很高的可移植性——只需更换探针的底物识别序列，即可适配不同DNA修复酶的检测需求。检测限0.008 U/mL优于多数已报道方法，且临床组织样本验证增强了转化潜力。局限在于当前仍以荧光读数为输出，未来若与便携式设备或侧向层析结合，有望进一步推向床旁检测场景。
参考来源
Xia X. DNA dumbbell-switched CRISPR/Cas13a biosensor for detecting human glycosylases with target-initiated cleavage-ligation-transcription cascade. Microchemical Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.microc.2026.117541
DOI: 10.1016/j.microc.2026.117541