来源：Transcription factor shielding yields a highly specific and sensitive whole-cell biosensor for Pb2+ detection（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
全细胞生物传感器（WCBs）检测铅离子（Pb²⁺）时常受化学性质相似的汞离子（Hg²⁺）干扰，导致非特异性信号响应。本研究以肺炎克雷伯菌CG43质粒pLVPK来源的铅抗性转录调控因子PbrR-kp为基础构建野生型Pb²⁺ WCB，通过定向进化提升灵敏度，并创新性地提出转录因子（TF）屏蔽策略——引入汞抗性TF突变体MerR∗竞争性螯合Hg²⁺，使优化后的RBSM480传感器检出限达0.03 nM，特异性提升5倍，在混合Pb²⁺/Hg²⁺实际样本中实现与ICP-MS一致的准确检测。
研究背景
基于转录因子的全细胞生物传感器凭借模块化架构、成本效益和实时监测能力，在工业生物技术、环境监测和临床诊断领域具有广阔应用前景。合成生物学的进展推动了这类传感器的发展，使其能够快速高灵敏地检测典型环境污染物。然而，同时实现高灵敏度与强特异性仍是挑战，尤其是对于配位化学性质相似的金属离子——如铅离子和汞离子。野生型WCB的灵敏度和特异性不足，促使研究者对其传感电路中的关键遗传元件进行大量优化。尽管WCB优势公认，但特异性不足和缺乏便携式部署方案仍制约其实际应用。
研究方法
2.1 菌株、培养条件与试剂
大肠杆菌K-12亚株JudeI用于所有克隆操作，并作为荧光生物传感器的底盘菌株。大肠杆菌BL21 (DE3)作为蛋白表达与纯化宿主。细菌生物传感器在无菌10 mL试管中、3 mL LB培养基（含20 μg/mL卡那霉素，生工生物，上海）内、37°C、200 rpm条件下过夜培养。如前所述（Shen et al., 2025），随后以1%接种量转接至MOPS培养基，培养至对数生长期（OD600 = 0.4-0.6），进行后续2小时诱导。本研究所用试剂见补充材料Text S1，质粒和生物传感器菌株列于表S1和表S2。
【数据】菌株：E. coli K-12 JudeI、BL21 (DE3)；培养基：LB（含20 μg/mL卡那霉素）；温度：37°C；转速：200 rpm；接种量：1%；培养基：MOPS；OD600：0.4-0.6；诱导时间：2h
2.2 质粒构建
本研究所用引物列于补充信息表S3，相关基因详细序列见表S4。所有引物、TF pbrR-kp（GenBank: AAR07820.1）及其诱导型启动子Ppbr均由GENEWIZ（苏州，江苏，中国）合成。野生型WCB质粒pSB1K3-PbrR-kp-GFP的构建见Text S2。为增强进化后Pb²⁺生物传感器对Hg²⁺的特异性，使用相应引物（F-B0029-MerR/F-B0032-MerR/F-B0034-MerR和R-MerR-EcoRI）扩增包含不同RBS序列（B0029、B0032和B0034）的MerR∗基因。该扩增产物作为模板，使用引物F-J23100-XbaI和R-MerR-EcoRI插入生物传感器质粒的XbaI/EcoRI限制性酶切位点。含ArsR基因的对照质粒及经TF屏蔽优化的Cd²⁺生物传感器质粒的构建过程与上述含MerR∗基因的质粒构建类似（Text S3）。使用引物对F-PbrR-3-NdeI和R-PbrR-3-XhoI从进化后的Pb²⁺生物传感器质粒扩增突变体PbrR-kp基因，克隆至NdeI/XhoI消化的pET28a (+)中，生成pET28a (+)-PbrR-3用于蛋白纯化。所选RBS序列相对强度的对应质粒构建见Text S4。
【数据】限制性酶切位点：XbaI/EcoRI、NdeI/XhoI；引物：F-B0029-MerR、F-B0032-MerR、F-B0034-MerR、R-MerR-EcoRI、F-J23100-XbaI、F-PbrR-3-NdeI、R-PbrR-3-XhoI；基因：pbrR-kp (AAR07820.1)、MerR∗、ArsR；质粒：pSB1K3-PbrR-kp-GFP、pET28a (+)-PbrR-3
2.3 PbrR-kp的定向进化
使用易错PCR（EP-PCR）对PbrR-kp基因进行PCR诱变，方法如前所述（Copp et al., 2014）。随机文库构建过程见Text S5。突变文库在MOPS培养基中诱导，随后使用MoFlo XDP细胞分选仪（Beckman Coulter，美国）进行荧光激活细胞分选（FACS）（Ex/Em: 488/520 nm）。采用双向分选策略以降低传感器对Hg²⁺的响应。在每轮定向进化中，突变文库依次进行负筛选（Hg²⁺诱导）和正筛选（Pb²⁺诱导）。负筛选过程中，筛选对Hg²⁺响应荧光低的突变菌用于后续正筛选。正筛选中，以之前轮次的突变体作为对照，鉴定暴露于Pb²⁺时荧光水平较高的约1%突变体。具体而言，以前一轮筛选获得的突变体传感器作为对照，基于对照组对铅离子的响应，建立约前1%的正筛选门。分选该门右侧的文库菌落进行鉴定。负筛选的Hg²⁺筛选浓度为1 μM，而正筛选中Pb²⁺诱导浓度逐轮降低（第1轮：0.24 μM，第2轮：0.24 μM，第3轮：0.14 μM）。保留荧光响应增强的突变体，提取生物传感器质粒并重新转化以验证性能。每轮成功验证的最优突变体作为下一轮进化的模板。
【数据】诱变方法：易错PCR；分选仪器：MoFlo XDP（Ex/Em: 488/520 nm）；负筛选Hg²⁺浓度：1 μM；正筛选Pb²⁺浓度：第1轮0.24 μM、第2轮0.24 μM、第3轮0.14 μM；正筛选门：约前1%
2.4 核糖体结合位点（RBS）微调优化特异性
RBS命名B0029、B0032和B0034均为Community Collection中的常见合成生物学元件（Ribosome Binding Sites/Prokaryotic/Constitutive/Community Collection - parts.igem.org）。基于参考文献（Gao et al., 2025; Joshi et al., 2022）及上述数据库，这些RBS的相对强度排序为B0032 < B0029 < B0034。使用引物R-MerR-EcoRI和含有NNN密码子（N代表A、T、G或C）的F-MerRRBS-library扩增RBS B0034序列。PCR产物随后作为模板，使用引物F-J23100-XbaI和R-MerR-EcoRI进行扩增，连接至XbaI/EcoRI消化的含进化后PbrR-3生物传感器的质粒中，构建RBS B0034饱和突变文库。为评估不同RBS序列的效果，对文库进行筛选。首先，使用0.01 μM Pb²⁺诱导对文库进行正筛选，确认对Pb²⁺的响应。随后，将筛选出的突变体用1 μM Hg²⁺诱导，根据其对Hg²⁺的荧光响应强度分为三个文库：Hg-L（低响应）、Hg-M（中响应）和Hg-H（高响应）。最后通过挑菌过程验证筛选结果。使用酶标仪（SpectraMax 190 & SpectraMax GEMINI XPS，Molecular Devices，美国）进行荧光检测，平均相对荧光值基于平均荧光值/OD600计算。从饱和突变文库中共挑选2138个克隆。为从饱和文库中鉴定性能稳定的生物传感器，通过两轮独立的质粒提取、转化及后续性能验证确认所选克隆的稳定性。去除重复突变体和自连结果后，鉴定出16个确保传感器响应Pb²⁺的不同RBS序列。这些选定的RBS以字母"RBS"加不同数字命名，具体序列见表S5。
【数据】RBS强度排序：B0032 < B0029 < B0034；正筛选Pb²⁺浓度：0.01 μM；Hg²⁺诱导浓度：1 μM；筛选克隆数：2138个；鉴定RBS序列数：16个；检测仪器：SpectraMax 190 & GEMINI XPS
2.5 MerR∗和PbrR-3蛋白的表达与纯化
MerR∗和PbrR-3蛋白按前述方法纯化（Zhu et al., 2023）。简言之，使用IPTG诱导含表达质粒（pET28a (+)-MerR∗和pET28a (+)-PbrR-3）的BL21细菌过夜生长。细菌超声破碎后，通过Ni-NTA 6FF（His-Tag）预装重力柱（生工生物，上海，中国）纯化蛋白。蛋白最终透析并浓缩至PBS缓冲液（pH 7.4）中。
【数据】表达宿主：BL21；诱导剂：IPTG；纯化柱：Ni-NTA 6FF (His-Tag)；缓冲液：PBS（pH 7.4）
2.6 蛋白与Hg²⁺的相互作用
通过SDS-PAGE确定蛋白大致纯度，并使用Bradford检测试剂盒（碧云天生物技术，上海，中国）测定蛋白浓度后，在Biacore 8K仪器（Cytiva）上以CM5芯片（GE Healthcare）于室温进行表面等离子体共振（SPR）实验。芯片用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC，Cytiva）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，Cytiva）活化。配体蛋白用醋酸钠稀释至50 μg/mL，固定于芯片的不同通道。将Hg²⁺标准溶液稀释，评估不同浓度Hg²⁺与配体蛋白之间的相互作用。结合和解离常数的计算由Biacore Insight评价软件（Cytiva，Marlborough, MA, USA）完成。为评估MerR∗和PbrR-3对Hg²⁺的竞争性结合，先将一种蛋白固定在SPR芯片上，另一种蛋白预先与Hg²⁺孵育后作为流动相注入。
【数据】SPR仪器：Biacore 8K；芯片：CM5；活化试剂：EDC/NHS；配体蛋白浓度：50 μg/mL（醋酸钠稀释）；缓冲液：PBS（pH 7.4）
2.7 WCB的表征
荧光生物传感器的表征方法如下——原文此处未详述。
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 Pb²⁺ WCB的定向进化
PbrR属于MerR家族转录调控因子，是介导细菌响应Pb²⁺的特征最明确的TF之一（Hui et al., 2023; Naik and Dubey, 2013）。来自肺炎克雷伯菌CG43质粒pLVPK的pbrR-kp基因（GenBank: AAR07820.1）（Chen et al., 2004）被用于构建基于非偶联基因回路的野生型Pb²⁺ WCB。如图S1所示，pbrR-kp基因的表达由组成型启动子J23109结合RBS B0032驱动，而绿色荧光蛋白（GFP）的表达由诱导型启动子Ppbr和RBS B0030调控。在无Pb²⁺条件下，组成型表达的PbrR-kp蛋白结合诱导型启动子Ppbr，从而抑制下游报告基因的转录（OFF状态）。当暴露于Pb²⁺时，PbrR-kp在金属结合后发生构象变化，解除对Ppbr的抑制，启动报告基因表达，产生可测量的荧光信号（ON状态）（图1a）。由于TF PbrR-kp在感知Pb²⁺和调控信号输出中的作用，它对系统性能至关重要（Liu et al., 2022a; Mahr and Frunzke, 2016; Moraskie et al., 2021）。
采用定向进化增强PbrR-kp的功能特性。为减少Hg²⁺的干扰（Hui et al. 2021, 2022），实施"负/正分选"策略优化野生型WCB。具体而言，首先采用负筛选消除对高浓度Hg²⁺响应升高的突变体，随后进行正筛选以鉴定对低浓度Pb²⁺敏感性增强的突变体（图1b）。经过三轮定向进化，最终突变基因累积了六个碱基突变，其中两个为密码子优化，四个为氨基酸突变（图S2a）。在低浓度Pb²⁺（0.01 μM）条件下，每轮进化的荧光响应持续上升（图S2b）。然而，进化后的突变体在1 μM Hg²⁺诱导时也表现出逐渐升高的响应（图S2b）。升高的交叉反应性损害了痕量Pb²⁺水平的准确检测。
为进一步研究定向进化的效果，检测了野生型和PbrR-3荧光WCB的灵敏度和特异性。PbrR-3 WCB对Pb²⁺的最大荧光输出信号较野生型增加约1.5倍（图1c）。此外，进化后的PbrR-3 WCB展现出跨越三个数量级的线性响应范围（0.48-482.63 nM，约0.1-100 μg/L），这使其在实际应用中具有高度优势（图S3）。基于3σb/slope（Reddy et al., 2017），从低Pb²⁺浓度响应的线性拟合曲线确定LOD，其中σb为空白样本的标准偏差（图1d）。野生型WCB的LOD为0.82 nM，而进化后的PbrR-3 WCB显著提升至0.08 nM，灵敏度提高约10倍。进化后PbrR-3 WCB的LOD远低于WHO设定的饮用水安全阈值（10 μg/L，约0.05 μM），这对样本中痕量Pb²⁺的检测至关重要。
在特异性方面，系统比较了WCB对污染环境中常与铅共存的多种重金属的响应（图1e和f）。对WCB响应不同重金属的分析表明，基于PbrR-kp的Pb²⁺生物传感器主要受Hg²⁺干扰，仅在Cd²⁺高浓度下观察到可忽略的响应。参照先前研究方法（Jia et al., 2021），并综合考虑高浓度金属离子对细菌生长的潜在抑制效应及实际样本中痕量检测的需求，特异性量化为0.01 μM Pb²⁺诱导的荧光强度与1 μM其他重金属诱导的荧光强度之比的最小值。与野生型WCB（特异性= 0.66）相比，进化后的PbrR-3生物传感器特异性为1.25。具体而言，在1 μM诱导浓度下，野生型WCB对Hg²⁺的响应为对照的7.5倍；而进化后的PbrR-3 WCB相应增加至15.6倍。尽管计算分析提示特异性增加，但这种增强主要源于定向进化使Pb²⁺响应的增幅大于Hg²⁺。定向进化非但没有减弱对干扰离子Hg²⁺和Cd²⁺的响应，反而增强了它们——这证明WCB的特异性并未得到本质改善。
在以往的WCB优化研究中，同时提高灵敏度和特异性一直被认为是持久性挑战。为增强这两个关键性能，研究者对TF进行定向进化。然而，以往研究（Bahls et al., 2022; Li et al., 2015a; Shen et al., 2025）和本研究结果均表明，仅增强目标灵敏度只能提高相对特异性，并不能消除非目标物质的干扰。
【数据】野生型WCB：LOD 0.82 nM，特异性0.66，1 μM Hg²⁺响应为对照7.5倍；PbrR-3 WCB：LOD 0.08 nM，特异性1.25，1 μM Hg²⁺响应为对照15.6倍；线性范围：0.48-482.63 nM（约0.1-100 μg/L）；最大荧光输出：较野生型增加约1.5倍；突变累积：6个碱基突变（2个密码子优化+4个氨基酸突变）
3.2 Pb²⁺ WCB特异性的TF屏蔽策略
为解决Pb²⁺ WCB中非特异性干扰问题，基于传感原理提出了TF屏蔽概念（图2a）。具体而言，基于TF的生物传感器通过特异性相互作用识别目标物质（Ding et al., 2021）。然而，结构相似性导致的目标与干扰物质之间的非特异性结合事件会产生混淆性荧光信号。为此，我们提出在生物传感器回路中引入专门靶向干扰物质的TF B。凭借其对干扰分子更高的结合亲和力，TF B将竞争性螯合这些物质，从而屏蔽负责目标识别的TF A免受非特异性激活。
PbrR-3 WCB的特异性评估表明Hg²⁺产生最大的干扰效应。在我们此前的研究中，通过定向进化获得了具有强Hg²⁺结合亲和力的MerR∗突变体（Zhu et al., 2023）。使用该突变体构建的Hg²⁺ WCB对Pb²⁺表现出可忽略的响应，这支持其作为PbrR-3 WCB系统中"TF B"的应用。为验证TF屏蔽策略的理论假设，纯化了突变蛋白PbrR-3和MerR∗（图S4），并通过SPR分析测定它们与Hg²⁺的相互作用（图2b和c）。SPR拟合结果表明，MerR∗与Hg²⁺的相互作用显著强于PbrR-3蛋白，二者解离常数相差三个数量级（表S6）。我们还使用SPR测试了混合系统中MerR∗和PbrR-3对Hg²⁺的竞争性结合——两种蛋白分别固定在芯片上。与单一蛋白和Hg²⁺的结合动力学（图2c）相比，混合系统中引入MerR∗蛋白显著干扰了PbrR-3蛋白与Hg²⁺的结合（图2e）。在预先与MerR∗蛋白孵育的混合物中，需要将Hg²⁺浓度提高约10倍才能在与PbrR-3蛋白相互作用时获得相似的信号强度。混合系统计算得到的结合参数（表S6）进一步支持了本研究提出的TF屏蔽优化的竞争原理，为其进一步应用提供了理论基础。
基于上述SPR实验，进一步研究了TF屏蔽策略在PbrR-3 WCB中的可行性。强组成型启动子——原文此处未详述。
【数据】MerR∗与Hg²⁺解离常数：较PbrR-3低三个数量级；竞争结合所需Hg²⁺浓度：提高约10倍
3.3 突变筛选WCB的灵敏度与特异性
原文此处未详述具体结果内容，但对应图表如下：
【数据】原文未详述
3.4 屏蔽优化中WCB的转录因子表达与特异性
原文此处未详述具体结果内容，但对应图表如下：
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究将TF屏蔽策略与TF PbrR-kp的定向进化相结合，构建了高灵敏度、高特异性的Pb²⁺ WCB。优化后的RBSM480 WCB的LOD（0.03 nM）比野生型WCB低28倍。通过降低对Hg²⁺的干扰响应，特异性提高了约5倍。优化WCB在实际样本中检测到的Pb²⁺浓度与ICP-MS结果一致。此外，对TF屏蔽策略的机制进行了初步探究。该策略在Cd²⁺生物传感器上的成功验证证明了其优化其他TF类生物传感器特异性的能力。
编译者解读
本研究最值得关注的方法创新在于"TF屏蔽"概念的提出——不同于传统上仅对目标识别元件进行定向进化以提升特异性，该策略通过引入第二个TF竞争性螯合干扰离子，从源头阻断非特异性激活。SPR实验从分子层面证实了MerR∗对Hg²⁺的竞争性结合优于PbrR-3，为策略提供了定量依据。RBS文库筛选进一步揭示了翻译起始效率与特异性之间的潜在关联，体现了合成生物学"定量调控"思维。该策略的模块化特性使其具备向其他重金属传感器推广的潜力，但需注意：引入额外TF增加了回路复杂性，实际应用中可能面临代谢负担与长期稳定性问题。
参考来源
Shen, L. (2026). Transcription factor shielding yields a highly specific and sensitive whole-cell biosensor for Pb2+ detection. Biosensors and Bioelectronics, 2026.
DOI: 10.1016/j.bios.2026.118801
DOI: 10.1016/j.bios.2026.118801