来源：Single tube cell-free transcription and autocatalytic signal amplification based fluorescent biosensor for microRNA detection（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
传统无细胞生物传感系统虽具备可编程、快速、低成本等优势，但多依赖多种酶和分离式扩增步骤，限制了其应用场景。本研究以miRNA-21为模型靶标，构建了一种单管、等温、无细胞生物传感平台，将SplintR连接酶介导的模板组装与T7 RNA聚合酶驱动的产物辅助自催化转录循环相整合。该平台无需逆转录、热循环或预扩增，检测限达0.52 pM，线性范围覆盖5个数量级，并在临床血清样本中成功验证。
研究背景
合成生物学的进展为分子传感系统设计开辟了新路径。无细胞系统通过纯化酶组分重建中心法则过程，已成为下一代诊断工具的重要平台。其中，基于RNA聚合酶介导的转录型无细胞系统因酶需求少、反应动力学快、等温条件下操作简便，特别适合即时检测应用。T7 RNA聚合酶以其高持续合成能力和启动子特异性脱颖而出，单条DNA模板可生成数千条RNA转录本，是信号放大的强大引擎。然而，现有方法大多需要多酶体系和分离的扩增步骤，限制了其便携性和实用性。本研究试图以miRNA-21为模型，开发一种真正意义上的单管一体化检测策略。
研究方法
2.1 试剂
SplintR连接酶及其配套的SplintR连接酶反应缓冲液（含50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、1 mM ATP、10 mM DTT，pH 7.5）购自New England Biolabs（NEB，美国马萨诸塞州），用于高保真RNA引导的DNA连接。TO1-3PEG-Biotin荧光团（简称TO1-Biotin）由Applied Biological Materials Inc.（加拿大不列颠哥伦比亚省里士满）提供，该组分可通过生物素-链霉亲和素相互作用实现荧光检测或亲和捕获。RNA合成与稳定所需的关键试剂——包括RNase抑制剂（防止RNA降解）、T7 RNA聚合酶（用于体外转录）、核苷三磷酸（NTPs，作为RNA合成底物）——均购自上海生工生物工程股份有限公司。RNAiso Plus购自Takara（货号9109）。血清样本采集自莆田学院附属医院。此外，经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水（严格去除RNase污染）以及所有用于特异性杂交或模板作用的定制寡核苷酸序列同样来源于生工生物，序列列于原文表1。所有寡核苷酸均经高效液相色谱（HPLC）严格纯化，以确保序列保真度并最大限度减少非特异性相互作用。
【数据】缓冲液组分：50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、1 mM ATP、10 mM DTT（pH 7.5）；RNase抑制剂：40 U/μL；RNAiso Plus：Takara货号9109；纯化方式：HPLC
2.2 荧光检测
荧光检测实验使用Tecan Infinite 200 Pro酶标仪，由Tecan i-control软件（版本2.0.10.0）操作。样品分析采用Corning 96孔平底黑色聚苯乙烯微孔板。检测在顶部读取荧光模式下进行，激发波长固定为485 nm，发射扫描范围为516至616 nm。发射带宽设为20 nm，激发带宽设为5 nm。
【数据】激发波长：485 nm；发射扫描范围：516–616 nm；发射带宽：20 nm；激发带宽：5 nm；仪器：Tecan Infinite 200 Pro
2.3 miRNA-21检测流程
反应在单一100 μL混合体系中完成，整合了连接识别与聚合步骤。反应体系包含以下组分：2 μL T7 RNA聚合酶（用于RNA转录）、10 μL不同浓度的miRNA-21（浓度范围为1 pM至1 μM，为目标分析物）、8 μL NTPs（含25 mM ATP、CTP、GTP和UTP的混合物）、0.2 μL TO1-Biotin荧光团（0.5 g/L；用于实时荧光检测或后续链霉亲和素捕获）、2 μL SplintR连接酶（25 U/μL；用于模板引导的DNA连接）、10 μL 10× SplintR连接酶反应缓冲液（含50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、1 mM ATP、10 mM DTT，pH 7.5）。其他组分包括1 μL 10 μM受体DNA寡核苷酸、1 μL 10 μM 5′-磷酸化DNA供体寡核苷酸（连接底物）、1 μL RNase抑制剂（40 U/μL；防止RNA降解）以及2 μL无核酸酶ddH₂O。混合物充分涡旋混匀后，在37°C孵育3.5小时。孵育结束后，通过65°C热灭活10分钟终止反应，随后进行荧光测量。
【数据】总反应体积：100 μL；T7 RNA聚合酶：2 μL；miRNA-21浓度范围：1 pM–1 μM；NTPs：8 μL（各25 mM）；TO1-Biotin：0.2 μL（0.5 g/L）；SplintR连接酶：2 μL（25 U/μL）；10×缓冲液：10 μL；受体探针：1 μL（10 μM）；供体探针：1 μL（10 μM）；RNase抑制剂：1 μL（40 U/μL）；ddH₂O：2 μL；孵育温度：37°C；孵育时间：3.5 h；热灭活：65°C，10 min
2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
配制12%凝胶：混合6 mL 30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺、5.84 mL水、3 mL 5×TBE和165 μL 10% APS；短暂脱气后加入15 μL TEMED，将溶液注入带有梳子的玻璃板间，在37°C聚合30分钟。样品在避光条件下制备：将2 μM DNA与预混染料溶液（Super Green核酸染液与6×上样缓冲液按1:1（v/v）体积比混合）混合，随后按样品与染料体积比2:1（v/v）进一步混合，电泳前孵育10–15分钟。DNA marker以相同方式制备。凝胶固化后安装于电泳槽中，加入1×TBE，清理上样孔，分别上样3 μL marker和5 μL样品。使用DYY-8C电泳仪（北京六一生物科技有限公司，中国）在100 V下电泳1小时，凝胶成像采用JS-2012凝胶成像系统（上海培清科技有限公司，中国）。
【数据】凝胶浓度：12%；丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺：30%，6 mL；水：5.84 mL；5×TBE：3 mL；10% APS：165 μL；TEMED：15 μL；聚合温度：37°C；聚合时间：30 min；样品DNA浓度：2 μM；样品与染料体积比：2:1；上样量：marker 3 μL，样品 5 μL；电泳电压：100 V；电泳时间：1 h
2.5 血清样本中miRNA-21的检测
志愿者血清样本获取自莆田学院附属医院。该方案经医院伦理委员会依据《赫尔辛基宣言》审查批准（中国福建省莆田市，批准号2025390）。所有参与者在参与前均签署书面知情同意书。血清样本处理流程如下：将200 μL正常人血清转移至1.5 mL离心管中，加入1 mL RNAiso Plus试剂并标记。匀浆后室温静置5分钟，4°C下12,000×g离心15分钟；将上清转移至新管。加入200 μL氯仿，剧烈手动振荡15秒，静置5分钟。再次离心（12,000×g，15分钟）后，小心将上层水相（含RNA）转移至新鲜离心管中，避免触及中间层。加入500–1000 μL异丙醇沉淀RNA（孵育10分钟），随后离心（12,000×g，10分钟，4°C）收集沉淀。弃去上清，沉淀用1 mL 75%乙醇洗涤（上下颠倒混匀），随后离心（7500×g，5分钟，4°C）。去除残留乙醇后，沉淀在层流下风干约5分钟。RNA溶于30–100 μL无RNase超纯水中（根据沉淀大小决定），保存于−70°C。后续操作按2.2和2.3节方法进行。
【数据】血清用量：200 μL；RNAiso Plus：1 mL；室温静置：5 min；首次离心：12,000×g，15 min，4°C；氯仿：200 μL；振荡：15 s；静置：5 min；二次离心：12,000×g，15 min；异丙醇：500–1000 μL；沉淀孵育：10 min；沉淀离心：12,000×g，10 min，4°C；75%乙醇洗涤：1 mL；洗涤离心：7500×g，5 min，4°C；风干：约5 min；RNA溶解体积：30–100 μL；保存温度：−70°C
研究结果
3.1 系统验证
如图2A所示，miRNA-21桥接供体和受体探针，使SplintR连接酶能够将它们共价连接为全长的转录模板。该新形成的模板一端含有功能性T7启动子序列。连接产物通过天然PAGE验证（图2B），连接后的模板由T7 RNA聚合酶转录生成适配体，用于荧光读出（图2C和2D）。
首先进行凝胶电泳分析以确认该过程。反应混合物包含：供体DNA寡核苷酸（2 μM）、受体DNA寡核苷酸（1 μM）、全长DNA模板（阳性对照，2 μM）、miRNA-21（200 nM）和SplintR连接酶（25 U）。如图2B所示，第2至第6泳道观察到明显的电泳条带模式。第2和第3泳道分别显示单个供体和受体DNA寡核苷酸对应的条带，前者因浓度更高而显示更强的条带强度。第4泳道同时含有两种探针但不含连接酶或靶标，其条带模式与第2、3泳道一致，确认无自发连接发生。第5泳道包含两种探针、miRNA-21和SplintR连接酶，在與第6泳道全长DNA对照相同的位置出现明显条带，证明靶标依赖性连接成功。第5泳道还观察到另一条迁移较慢且强度更高的条带，可能由过量DNA供体探针与miRNA-21杂交形成高分子量复合物所致。这些结果确认了连接反应的特异性，并强调了探针化学计量比优化对减少非特异性相互作用的重要性。
如图2C示意，T7 RNA聚合酶识别启动子区域并驱动连接模板的高效转录，合成RNA适配体。这些适配体随后折叠为能够结合荧光染料的具体结构，从而产生报告靶标存在的荧光信号。进一步实验也验证了这一点。如图2D所示，仅在含有miRNA-21的样品中观察到显著的荧光强度增强。该结果表明连接、T7聚合酶驱动的转录以及随后激活荧光染料的RNA适配体生成均成功实现。相比之下，不含靶标的对照反应显示极低荧光，确认无非特异性扩增或信号产生。这些发现共同验证了所提系统用于miRNA-21特异性和灵敏检测的可行性。
【数据】供体DNA寡核苷酸：2 μM；受体DNA寡核苷酸：1 μM；全长DNA模板（阳性对照）：2 μM；miRNA-21：200 nM；SplintR连接酶：25 U；非靶标对照：荧光极低
3.2 实验条件优化
为获得系统最佳性能，对T7 RNA聚合酶浓度、反应温度、转录时间和NTP浓度等关键反应参数进行了系统优化。如图3A所示，荧光强度随T7 RNA聚合酶浓度呈剂量依赖性增加，在2 U/μL时达到平台期。该饱和点表明可用模板已被充分利用，确定了高效转录的最佳酶浓度，同时避免不必要的试剂消耗。
温度显著影响反应效率（图3B）。荧光信号从4°C到37°C逐渐增强，与高温下酶活性和杂交动力学增强一致（Lei et al., 2022）。45°C时观察到急剧下降，可能归因于T7 RNA聚合酶的部分变性或核酸复合物的结构不稳定（Jin et al., 2016）。因此，37°C被选为最佳温度，兼顾了反应速率与酶稳定性。
转录反应动力学随时间评估（图3C）。荧光强度稳步增加，在210分钟达到最大值，此后无显著信号增强，表明RNA合成已完成。该时长被确定为后续所有实验的标准孵育时间。
NTP浓度对转录效率同样关键（图3D）。信号强度随NTP水平从0.5 mM增至2.0 mM而增加，在2.0 mM时达到最大值。更高浓度下出现的轻微下降可能反映了过量底物或离子条件改变引起的抑制效应。因此，2.0 mM被确定为首选NTP浓度。这些优化条件共同提升了SplintR-T7级联系统的灵敏度、效率和可重复性，为其在miRNA检测中的应用提供了坚实基础。
【数据】T7 RNA聚合酶最佳浓度：2 U/μL；最佳温度：37°C（45°C时信号骤降）；最佳转录时间：210 min；最佳NTP浓度：2.0 mM（0.5–2.0 mM范围内递增）
3.3 系统分析性能
在优化条件下，通过测量对不同浓度miRNA-21的荧光响应来评估所开发系统的分析性能。如图4A所示，荧光强度随miRNA-21浓度从1 pM增至1 μM而逐步增加，呈现剂量依赖性扩增行为。在536 nm处测量的荧光强度与miRNA-21浓度的对数值在该范围内呈现强线性相关。校准曲线拟合方程为Y = 480.54X + 7132.80（R² = 0.9957），其中X代表miRNA-21浓度的对数值，Y代表荧光强度。该检测方法的线性动态范围跨越5个数量级（1 pM至1 μM，相当于每反应6.02 × 10⁷至6.02 × 10¹³拷贝），计算检测限为0.52 pM（每反应3.13 × 10⁷拷贝，基于S/N = 3）。
原文表S1将本无细胞检测方法与代表性荧光策略进行了比较。虽然灵敏度和动态范围处于当前方法的典型性能范围内，但本设计独特地在单管等温条件下完成了模板组装、T7驱动的转录和信号放大。这种整合优化了操作步骤并降低了交叉污染的可能性，相比多步骤格式实现了更简化的流程。值得注意的是，在已报道的一锅法荧光检测中，本方法实现了亚皮摩尔级检测限和五个数量级的线性动态范围，其分析性能与大多数现有单管策略相当或更优。
除分析灵敏度和线性外，酶兼容性和操作稳健性对即时检测（POCT）至关重要。本系统采用最小化的、相互兼容的双酶组合（SplintR连接酶和T7 RNA聚合酶），在单一等温条件和统一缓冲液中运行，减少了酶间干扰并有助于稳定的线性表现。此外，简化的酶架构从本质上限制了批次相关变异性，支持可靠性能和POCT转化。
【数据】线性方程：Y = 480.54X + 7132.80；R² = 0.9957；线性范围：1 pM–1 μM（5个数量级）；检测限：0.52 pM（3.13 × 10⁷拷贝/反应，S/N = 3）；检测波长：536 nm；拷贝数范围：6.02 × 10⁷–6.02 × 10¹³拷贝/反应
3.4 系统特异性评估
通过测试系统对miRNA-21及若干潜在干扰miRNA（包括miRNA-141、miRNA-155、miRNA-221和miRNA-222）的响应，严格评估了系统特异性。如图5A所示，每种非靶标miRNA均以1 nM浓度单独测试，而靶标miRNA-21则以1 pM低浓度检测。仅在miRNA-21存在时观察到显著的荧光增强，而非靶标miRNA产生的荧光信号与空白对照相当，表明交叉反应可忽略不计。此外，含有1 nM非靶标miRNA和1 pM miRNA-21的混合样本（Mix1）也表现出显著高于不含miRNA-21的对应混合物（Mix2）的荧光强度，证明过量非靶标序列的存在不会干扰靶标检测。
【数据】非靶标miRNA测试浓度：1 nM；靶标miRNA-21测试浓度：1 pM；Mix1：1 nM非靶标+1 pM miRNA-21；Mix2：1 nM非靶标不含miRNA-21；非靶标信号：与空白对照相当
讨论与解读
本研究开发了一种单管、等温、无细胞的miRNA超灵敏特异性检测平台。该系统整合了SplintR连接酶介导的模板组装与T7 RNA聚合酶驱动的转录扩增，实现了靶标依赖的自持续信号增强，无需热循环、逆转录或多酶级联。检测性能突出：低检测限（0.52 pM）、宽动态范围（5个数量级）、高特异性和良好的可重复性。在人类血清样本中的成功应用凸显了其强大的基质耐受性和临床样本分析的实用性。由于检测在RNA提取后的无细胞系统中进行，该平台可便捷地扩展至全血和细胞裂解液等其他样本类型。未来的动力学和建模研究将阐明自催化扩增动力学并指导检测性能的进一步优化。
编译者解读
该工作巧妙利用RNA适配体同时作为信号输出和"分子夹板"的双重角色，实现了真正的自催化循环——这避免了传统核酸扩增中反复添加酶或更换温度的需求。从合成生物学应用角度看，双酶最小化设计降低了系统复杂度和批次变异性，为POCT场景提供了务实方案。值得关注的是，该策略的模块化特征使其理论上可通过更换探针序列快速适配不同miRNA靶标。局限在于RNA提取步骤仍为离线操作，且3.5小时的孵育时间对急诊场景偏长。未来若能整合裂解与检测步骤，将更具现场应用价值。
参考来源
Xie Q. Single tube cell-free transcription and autocatalytic signal amplification based fluorescent biosensor for microRNA detection. Biosensors and Bioelectronics, 2026. DOI: 10.1016/j.bios.2026.118626
DOI: 10.1016/j.bios.2026.118626