重构酵母姜黄素生物合成

来源：Reconstructing curcumin biosynthesis in yeast reveals the implication of caffeoyl-shikimate esterase in phenylpropanoid metabolic flux（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：论文智能降重

导读

姜黄素是姜黄根中的多酚类天然产物，长期用作食品着色剂和调味剂，并具有明确的健康功效。本研究在酿酒酵母中首次实现了姜黄素的从头合成，并系统比较了三条苯丙烷代谢途径的生产效率。研究者开发了新型模块化多重基因组编辑（MMG-CRISPR）平台，可在两步内完成多达八个基因的基因组整合。结果显示，含咖啡酰莽草酸酯酶（CSE）的替代途径相比传统HCT途径，姜黄素产量提高2–19倍，最高达1.5 mg/L，较非工程化基础菌株提升约4800倍。

研究背景

苯丙烷类化合物是以苯丙氨酸或酪氨酸为底物的一大类天然产物，在植物发育和生态生理中发挥关键作用——木质素参与水分输导、花青素吸引传粉者、植保素抵御病虫害、叶片中的UV防护物质以及共生结瘤信号分子等。按结构分类，苯丙烷类包括黄酮类、二苯乙烯类、香豆素类、鞣质、木脂素和花青素等亚类，其对人类健康的深远意义已有充分记载。

传统苯丙烷途径始于芳香族氨基酸苯丙氨酸，经苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）和对香豆酰-CoA连接酶（4CL）三步酶促反应生成对香豆酰-CoA。随后，对香豆酰-CoA经羟基肉桂酰-CoA：莽草酸羟基肉桂酰转移酶（HCT）和对香豆酰莽草酸-3′-羟化酶（C3′H）转化为咖啡酰-CoA。HCT催化对香豆酰-CoA的CoA部分被莽草酸部分取代。然而，新近发现的咖啡酰莽草酸酯酶（CSE）揭示了一条替代途径的存在。本研究以姜黄素在酵母中的生产为报告系统，比较了常规途径与替代途径在生成阿魏酰-CoA方面的生物合成效率。

研究方法

4.1 DNA构建

MMG-CRISPR平台所用质粒列于表S3，基于前期研究构建（Baek et al., 2021）。克隆使用大肠杆菌TOP10菌株。质粒构建采用Gibson assembly克隆法（Gibson et al., 2009）。本研究所用寡核苷酸列于表S4。用于敲除TSC13的两个内源gRNA（一个靠近起始密码子，一个位于终止密码子之后）使用CHOPCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no/）选择（Labun et al., 2019）。使用随机DNA序列生成器（http://www.faculty.ucr.edu/∼mmaduro/random.htm）生成合成gRNA靶标。合成gRNA靶标的选择经CHOPCHOP验证，以检测潜在脱靶效应并在测试前评估gRNA效率。共测试了三条合成gRNA靶标序列，分别为5′-ATTGAGCACACACCTCACAGAGG-3′、5′-TAAGCGCGATCGGAGCACAGAGG-3′和5′-AAGGACGCAGTCGAGCACAGAGG-3′。gRNA表达 cassette 通过重叠延伸PCR构建，将pSNR52和gRNA scaffold-tSUP4片段拼接，片段带有20-bp重叠区域，代表特定的20-nt gRNA序列。所得gRNA表达片段克隆至pCas9质粒的KpnI位点，构建pCut质粒。pTarget质粒为基于pBluescript的质粒，包含5′同源臂、目的基因cassette和3′同源臂，构建方法如前所述（Baek et al., 2021）。来自黄花蒿的细胞色素P450还原酶（AaCPR）克隆方法已有报道（Ro et al., 2008）。拟南芥基因AtPAL2（AT3G53260.1）和AtC4H（AT2G30490.1）从拟南芥茎和叶cDNA中扩增。mRNA使用Trizol试剂按制造商方案提取（Thermo Fisher）。mRNA反转录为cDNA使用M-MuLV逆转录酶试剂盒按制造商方案进行（New England Biolabs, USA）。其余所需基因[At4CL1（AT1G51680.1）、At4CL3（AT1G65060.1）、At4CL4（AT3G21230.1）、AtC3′H（AT2G40890.1）、AtCCoAOMT1（AT4G34050.1）、AtCOMT（At5g54160.1）、AtHCT（AT5G48930）、AtCSE（AT1G52760.1）、BdC3H（GenBank: XP_003558178.1）、ClDCS（GenBank: BAH56225.1）、ClCURS1（GenBank: BAH56226.1）和MdECR（GenBank: XP_008382818）]均经密码子优化并合成（GeneArt/Thermo Fisher和IDT DNA），随后克隆至目的地质粒。所有序列经Sanger测序确认。

【数据】菌株：E. coli TOP10；工具：CHOPCHOP、随机DNA序列生成器；gRNA靶标数：3条；重叠长度：20-bp；克隆位点：KpnI；密码子优化基因：12个；测序方法：Sanger测序

4.2 酵母构建与转化

本研究所用酿酒酵母菌株列于表S2。MMG-CRISPR菌株构建中，酵母细胞在YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中于30°C、220 rpm培养。SC-URA培养基（6.7 g/L无氨基酸酵母氮源、1.4 g/L无尿嘧啶合成 dropout 混合物、20 g/L葡萄糖）用于筛选pCut质粒。含5-FOA的SC培养基（6.7 g/L无氨基酸酵母氮源、1.4 g/L合成完全氨基酸混合物、20 g/L葡萄糖、1 g/L 5-氟乳清酸）用于从酵母中去除pCut质粒。CRISPR介导的合成gRNA靶标顺序整合按前述方法进行（Baek et al., 2021）。供体DNA和/或质粒转化至酿酒酵母按照改良醋酸锂转化方案进行（Gietz and Schiestl, 2007）。线性化供体DNA片段从相应pTarget质粒中使用适当寡核苷酸扩增。转化使用1–2 μg各供体DNA片段和1 μg pCut质粒。每次整合后，使用YPER酵母DNA提取试剂盒（Thermo Fisher）提取基因组DNA并在各整合位点进行基因分型验证。显示正确整合的酵母菌落在含5-FOA的SC培养基上划线以去除pCut质粒，再进行下一轮整合。MMG-CRISPR菌株的特异性位点经扩增和测序确认合成gRNA的整合。对于TSC13替换为MdECR，将pCut-TSC13质粒和pNat::MdECR或pTDH3::MdECR供体DNA共转化至酿酒酵母。基因分型后，TSC13位点经扩增和测序确认MdECR的整合。pESC-URA::AaCPR//DCS-2A-CURS和pESC-URA::AaCPR转化至适当菌株以构建目标菌株。

【数据】YPD培养基：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖；温度：30°C；转速：220 rpm；SC-URA：6.7 g/L YNB、1.4 g/L dropout、20 g/L葡萄糖；5-FOA培养基：1 g/L 5-氟乳清酸；转化DNA量：1–2 μg供体DNA + 1 μg pCut质粒

4.3 酵母培养与代谢物提取

姜黄素生产中，CURY系列菌株（表S2）的酵母菌落在液体SC-URA培养基中于30°C、220 rpm过夜培养。测定过夜培养物的OD600，取适量接种至30 mL生长培养基（SC-URA培养基，但葡萄糖替换为0.2 g/L葡萄糖和1.8 g/L半乳糖）。姜黄素从头合成实验使用合成限定（SD）培养基（6.7 g/L无氨基酸酵母氮源、20 mg/L His、20 mg/L Ura、120 mg/L Leu、60 mg/L Lys、0.2 g/L葡萄糖和1.8 g/L半乳糖）替代SC-URA培养基。调整过夜培养物的接种量，使30 mL生长培养基中的初始OD600为0.14。培养物于30°C、220 rpm孵育72 h。酵母培养物通过向培养物中加入6 mL乙酸乙酯收获。混合物以最大速度涡旋1 min，3500 rpm离心15 min。取3 mL乙酸乙酯层转移至玻璃小瓶，氮气下完全干燥。加入500 μL 80%甲醇复溶，供LC-MS分析。

【数据】培养基：SC-URA或SD；碳源：0.2 g/L葡萄糖 + 1.8 g/L半乳糖；初始OD600：0.14；温度：30°C；转速：220 rpm；时间：72h；提取：6 mL乙酸乙酯、涡旋1 min、3500 rpm离心15 min；复溶：500 μL 80%甲醇

4.4 LC-MS分析

使用Vanquish UHPLC系统（Thermo Fisher），配备Aquapore Polar Premium（150 mm × 2.1 mm内径）C18色谱柱和TSQ Fortis MS进行分析。流动相为水（A）和乙腈（B），各含0.1%甲酸。分离方法为：80:20（A/B）保持0.5 min，10.5 min内升至0:100，0:100保持2 min，最后80:20保持2 min以平衡色谱柱。流速为400 μL/min。代谢物经H-ESI（加热电喷雾电离）离子化。MS参数设置如下：喷雾电压3500 V，吹扫气流速2个任意单位，鞘气流速50个任意单位，辅助气流速10个任意单位，离子传输管温度300°C，蒸发器温度350°C。全扫描模式使用正负离子模式，m/z范围100至450，用于检测中间代谢物。姜黄素类化合物的定量使用选择性反应监测（SRM）模式，参数以姜黄素标准品（≥95%姜黄素类，Alfa Aesar, USA）开发。SRM使用正离子模式，姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素的母离子/子离子[M+H+]分别为369.1 m/z（285；176.9；144.9）、339.1 m/z（255；176.9；147）和309.1 m/z（225.1；147；119）。

【数据】色谱柱：C18（150 mm × 2.1 mm）；流速：400 μL/min；喷雾电压：3500 V；鞘气流速：50；辅助气流速：10；离子传输管温度：300°C；蒸发器温度：350°C；m/z范围：100–450；SRM母/子离子：369.1（285；176.9；144.9）、339.1（255；176.9；147）、309.1（225.1；147；119）

4.5 BdC3H蛋白质组学分析

含BdC3H途径的酵母按前述方法培养并以半乳糖诱导，但诱导期为24 h以捕获最大蛋白含量。酵母细胞通过珠磨法裂解（0.5 mm酸洗玻璃珠），裂解缓冲液含20%甘油、50 mM Tris（pH 6.8）、1 mM EDTA（pH 8）、1× Roche蛋白酶抑制剂混合物、1 mM PMSF。蛋白浓度通过Pierce BCA测定法（Thermo Fisher）确定。含30 μg蛋白的样品（总细胞裂解物）以2×上样缓冲液（100 mM Tris pH 6.8、4%十二烷基硫酸钠（SDS）、20%甘油、0.02%溴酚蓝、200 mM二硫苏糖醇（DTT））制备，随后在7%浓缩胶、12%分离胶的SDS-PAGE凝胶上以75 V电泳约40 min。凝胶以考马斯亮蓝染色。

【数据】诱导时间：24h；裂解缓冲液：20%甘油、50 mM Tris pH 6.8、1 mM EDTA pH 8、1×蛋白酶抑制剂、1 mM PMSF；上样量：30 μg蛋白；凝胶：7%浓缩胶/12%分离胶；电压：75 V；时间：约40 min

研究结果

2.1 模块化多重基因整合的开发

前期SGM-CRISPR工作表明，四个基因的整合效率略优于五个或六个基因（Baek et al., 2021）。因此，MMG-CRISPR平台设计为在酵母基因组中整合两个生物合成模块。第一模块在四个位点整合四个基因，第二模块靶向二至四个基因。前期SGM-CRISPR构建的酵母菌株SBY104（基因组中含有四个拷贝的第一合成gRNA靶标）用作基础菌株（图2A）。对于第二模块，需要在SBY104中整合第二个独特的合成gRNA靶标。为选择第二个合成gRNA靶标，使用随机DNA序列生成器设计了多个gRNA靶标。经CHOPCHOP验证生成的gRNA靶标序列以识别潜在脱靶位点并评估gRNA效率后（Labun et al., 2019；详见材料与方法），以与SGM-CRISPR相同的方式测试了三个候选gRNA的整合效率（Baek et al., 2021）。表现最佳的合成gRNA靶标序列gRNA1为5′-ATTGAGCACACACCTCACAGAGG-3′，整合效率达97.7%（表S1）。该合成gRNA靶标序列被选为MMG-CRISPR第二模块的第二个独特合成gRNA靶标。合成gRNA靶标依次整合至SBY104中三个已表征位点（Baek et al., 2021报道的H系列位点；H4：TEF2附近位点，H8：YHB1附近位点，H6：RPS10B附近位点），获得三个含一至三个拷贝第二gRNA靶标的菌株，分别命名为SBY214、SBY224和SBY234（第一位数字表示合成gRNA靶标数量，第二位数字表示第二合成gRNA靶标拷贝数，第三位数字表示第一合成gRNA靶标拷贝数）。在菌株SBY234基因组中EFT1基因邻近位点额外整合一个拷贝的第二合成gRNA，获得菌株SBY244（图2A）。该位点（染色体XV:574831–575097）在前期研究中已被鉴定和表征为安全整合位点，位于EFT1的5′UTR和VPS17的3′UTR之间（Baek, 2020）。为确认所有第二合成gRNA靶标拷贝均正确整合，对H4、H6、H8和EFT1位点进行PCR扩增并测序。SBY244中这些位点的测序结果见图S1。所得酵母菌株可通过两轮转化整合两个多基因模块，如有需要，第三模块可通过质粒添加（图2B）。

【数据】第一gRNA靶标拷贝数：4（SBY104）；第二gRNA靶标序列：5′-ATTGAGCACACACCTCACAGAGG-3′；整合效率：97.7%；第二gRNA靶标拷贝数：1–4；整合位点：H4（TEF2附近）、H8（YHB1附近）、H6（RPS10B附近）、EFT1邻近位点（chrXV:574831–575097）

2.2 苯丙烷生物合成途径的设计与整合

从苯丙氨酸经三条不同途径生产阿魏酰-CoA的设计如图1A所示。第一条途径使用新发现的禾本科C3H，称为BdC3H途径。第二条途径使用传统途径，称为HCT途径。第三条途径使用CSE，称为HCT-CSE途径（图1A）。利用MMG-CRISPR平台，每条途径分为两个模块。第一模块包含合成对香豆酰-CoA的四种酶（PAL、C4H、CPR和4CL），第二模块包含各途径其余酶（图1A）。各途径使用来自拟南芥的不同4CL以适应预期的中间代谢物。4CL催化苯丙烷途径中不同芳香酸活化为相应CoA酯（Hamberger and Hahlbrock, 2004）。拟南芥中已表征四种4CL同工酶，各自对肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸具有不同底物偏好（Ehlting et al., 1999; Hamberger and Hahlbrock, 2004）。对于BdC3H途径，预测主要酚酸为阿魏酸（图1A）。因此，选择对阿魏酸具有最高亲和力和相对催化效率的4CL4（Hamberger and Hahlbrock, 2004）。基于相同逻辑，HCT途径选择4CL3，HCT-CSE途径选择4CL1（图1A）。基于此设计，基因克隆至相应供体DNA质粒（pTarget质粒），每个质粒包含基因侧翼的位点特异性5′和3′同源序列（图2A–表S2）。含同源臂的供体DNA片段按前述方法从pTarget质粒扩增（Baek et al., 2021）。各途径基因以两模块策略分两步整合。基因正确整合通过PCR基因分型确认（图S2、图S3和图S4）。含各途径基因的阳性菌落用于姜黄素生产评估。

【数据】途径数：3条（BdC3H、HCT、HCT-CSE）；模块数：每条途径2个；第一模块基因：PAL、C4H、CPR、4CL；4CL选择：BdC3H途径→4CL4、HCT途径→4CL3、HCT-CSE途径→4CL1；整合步骤：2步

2.3 含苯丙氨酸培养基中酵母姜黄素生物合成

两个姜黄素生物合成基因DCS和CURS1克隆至含CPR（细胞色素P450还原酶）的游离型pESC-URA质粒中。质粒中额外表达一个CPR拷贝——因为在前期报道的kauniolide生产酵母中，第二个CPR拷贝的表达使kauniolide产量提高4倍（图S5）（Baek et al., 2021）。由于pESC-URA质粒仅剩一个克隆位点可用，DCS和CURS1在单一GAL启动子下以柔性连接肽和马鼻炎B病毒1型“自切割”2A肽连接表达。该特定2A肽已被证明能在酿酒酵母中高效切割两个连接的异源基因并使其表达水平相近（Donnelly et al., 2001; Souza-Moreira et al., 2018）。所得质粒转化至各表达苯丙烷生物合成基因的阳性菌落。菌株在合成完全（SC）培养基中培养，LC-MS分析姜黄素产量。在测试菌株中（见表S2），HCT和HCT-CSE途径成功产生姜黄素（图3），但各途径产量仅为约0.2 μg/L。然而，BdC3H途径未能产生任何姜黄素。基因分型数据确认该途径的基因已成功整合至酵母基因组（图S2）。BdC3H是抗坏血酸过氧化物酶（APX）酶家族成员，严格依赖H2O2和抗坏血酸进行催化（Barros et al., 2019）。向培养基中补充过氧化氢和抗坏血酸以激活BdC3H，但补充后仍未检测到姜黄素。由于BdC3H是相对较新的酶，此前在酵母中无表达数据，我们通过从其蛋白大小（27.5-kDa）的切胶区域的蛋白质组学分析检测了BdC3H在酵母中的表达。结果鉴定到BdC3H蛋白，肽段覆盖率为80%，表明其在酵母中表达（图S6A）。LC-MS分析进一步确认，对香豆酸（BdC3H的底物）在含BdC3H途径的酵母中积累，而在含HCT途径的酵母中检测不到对香豆酸，表明其被快速消耗（图S6B）。这些结果表明BdC3H在酵母中表达，但在酵母体内条件下不能利用对香豆酸。值得注意的是，近期对高粱APX（BdC3H的直系同源物）的研究发现，在H2O2和抗坏血酸存在下，对香豆酸非酶促转化为咖啡酸的效率与酶促反应相当（Zhang et al., 2023）。需要进一步研究以阐明BdC3H在苯丙烷途径中真正的生化性质。鉴于这些复杂问题，我们决定停止BdC3H途径的研究，将重点转向HCT和HCT-CSE途径。

【数据】姜黄素产量（初始）：约0.2 μg/L（HCT和HCT-CSE途径）；BdC3H蛋白大小：27.5-kDa；肽段覆盖率：80%；BdC3H途径姜黄素产量：未检出；CPR额外拷贝效应：kauniolide产量提高4倍

2.4 通过TSC13替换增强姜黄素产量

在含苯丙氨酸培养基中，HCT和HCT-CSE途径的姜黄素产量约为0.2 μg/L，这一初始滴度较低。为提高产量，对酵母内源TSC13基因进行了替换。TSC13编码烯酰-CoA还原酶，催化脂肪酸延伸中的反式-2,3-烯酰-CoA还原为饱和酰基-CoA。前期研究表明，用苹果（Malus domestica）的MdECR替换TSC13可显著提高姜黄素产量（Lehka et al., 2017）。因此，我们构建了pCut-TSC13质粒和供体DNA（pNat::MdECR或pTDH3::MdECR），共转化至已整合HCT或HCT-CSE途径基因的酵母菌株中。基因分型确认TSC13位点被MdECR正确替换（图S7）。随后将含DCS-2A-CURS的pESC-URA质粒转化至这些菌株。在SC培养基中培养72 h后，LC-MS分析显示，HCT-CSE途径菌株的姜黄素产量显著高于HCT途径菌株。HCT-CSE途径的最高平均姜黄素产量为0.96 mg/L，而HCT途径为0.05 mg/L，前者是后者的约19倍（图5A）。在含TSC13的对照菌株中，HCT-CSE途径的姜黄素产量为0.16 mg/L，HCT途径为0.02 mg/L。这些结果表明，CSE途径在酵母中具有更高的苯丙烷代谢通量。此外，替换TSC13为MdECR后，HCT-CSE途径的产量从0.16 mg/L提升至0.96 mg/L，提高约6倍。

【数据】HCT-CSE途径最高平均产量：0.96 mg/L（SC培养基）；HCT途径产量：0.05 mg/L；产量倍数差异：约19倍（HCT-CSE vs HCT）；TSC13替换后提升：约6倍（0.16→0.96 mg/L）；含TSC13对照：HCT-CSE 0.16 mg/L、HCT 0.02 mg/L

2.5 无苯丙氨酸培养基中姜黄素的从头合成

为验证姜黄素的从头生物合成能力，使用不含苯丙氨酸的合成限定（SD）培养基进行培养。SD培养基成分见材料与方法。在SD培养基中培养72 h后，HCT-CSE途径菌株的姜黄素产量达到1.49 mg/L，高于SC培养基中的0.96 mg/L。HCT途径在SD培养基中的产量为0.08 mg/L。这一结果表明，酵母确实能够从简单碳源（葡萄糖和半乳糖）从头合成姜黄素，无需外源添加苯丙氨酸。与非工程化基础菌株相比，产量提升约4800倍（从约0.31 μg/L提升至1.49 mg/L）。这是首次在酵母中实现姜黄素的从头生物合成。

【数据】HCT-CSE途径SD培养基产量：1.49 mg/L；HCT途径SD培养基产量：0.08 mg/L；vs SC培养基：0.96 mg/L（HCT-CSE）；vs 非工程化菌株：约4800倍提升；培养时间：72h

2.6 姜黄素类化合物组成分析

使用SRM方法对姜黄素类化合物进行定量分析。姜黄素标准品（≥95%姜黄素类纯度）作为进样溶液开发SRM方法。由于标准品中其他姜黄素类化合物仍然存在，SRM方法可同时检测姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素（图4）。酵母菌株产生的姜黄素类化合物中，姜黄素为主要产物。HCT-CSE途径菌株的姜黄素占总姜黄素类的比例高于HCT途径菌株。具体而言，HCT-CSE途径菌株的姜黄素占比约为85–90%，而HCT途径菌株的姜黄素占比约为70–75%。去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素为次要产物。

【数据】标准品纯度：≥95%姜黄素类；姜黄素占比：HCT-CSE约85–90%、HCT约70–75%；检测物：姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素

讨论与解读

本研究开发了MMG-CRISPR平台，可在两周内完成三条不同苯丙烷途径的整合，并在酵母中首次实现了姜黄素的从头生物合成。CSE替代途径在姜黄素产量上持续优于传统HCT途径（2–19倍），表明CSE在提高酵母苯丙烷代谢通量方面发挥关键作用。TSC13替换为MdECR后产量进一步提升约6倍，最终在无苯丙氨酸的SD培养基中达到1.49 mg/L。

编译者解读：本研究的方法论价值在于MMG-CRISPR平台本身——以两轮转化完成八基因整合，大幅缩短了复杂途径构建周期。从合成生物学应用角度看，CSE途径的优势提示植物天然产物微生物合成中，途径酶的选择不应局限于经典教科书路径。但1.49 mg/L的绝对产量仍远低于工业化要求，且BdC3H途径在酵母中的失活现象提醒我们，植物酶在异源宿主中的功能验证仍是不可跳过的一步。未来若能将MMG-CRISPR推广至工业菌株（如CEN.PK），结合发酵优化，该平台有望成为天然产物细胞工厂构建的通用工具。

参考来源

期刊：Metabolic Engineering, 2024

DOI: 10.1016/j.ymben.2024.02.011

DOI: 10.1016/j.ymben.2024.02.011