来源：De Novo biosynthesis of scopoletin from glucose by engineered Saccharomyces cerevisiae（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
东莨菪内酯（Scopoletin）是一种植物来源的香豆素类化合物，具有抗炎、抗菌、抗结核、降血压等多种药理活性，传统上依赖植物提取获得，效率低且环境负担重。本研究以酿酒酵母为底盘细胞，通过逐步整合10个异源基因，首次实现了东莨菪内酯从葡萄糖的从头生物合成。工程菌株在摇瓶发酵条件下产量达55.32 mg/L，为微生物法生产东莨菪内酯及其衍生物建立了全新平台。
研究背景
东莨菪内酯（7-羟基-6-甲氧基香豆素）是一种低分子量植物抗毒素，通过莽草酸途径合成，在茄科、菊科、伞形科、龙胆科和豆科等多种植物中均有大量积累。研究表明，东莨菪内酯在抗炎、抗菌、抗结核、降血压、抗高尿酸血症和抗糖尿病等方面表现出显著活性，在医疗保健、营养和制药领域具有广阔应用前景。传统上，东莨菪内酯的商业化生产依赖天然植物提取，面临提取效率低、植物生长周期长、环境影响大等问题。代谢工程为构建微生物细胞工厂以生物合成天然化合物提供了最有前景的策略之一，微生物细胞工厂有望为东莨菪内酯提供高效可持续的生产平台。东莨菪内酯的生物合成以酪氨酸或苯丙氨酸为前体，合成途径涉及多种外源酶的参与，需要设计一系列化学转化级联反应。
研究方法
2.1 菌株、质粒与试剂
大肠杆菌DH5α用于质粒的复制与构建。本研究以本课题组前期报道的工程酿酒酵母菌株YT02为宿主菌。本研究所用酿酒酵母菌株列于表2。所有引物由北京擎科生物技术有限公司合成，列于表S1。所用质粒列于表S2。对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸标准品购自上海麦克林生化科技有限公司，东莨菪内酯标准品购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。高保真PCR用2 × Phanta Max Master Mix（Dye Plus）、菌落PCR用2 × Rapid Taq Plus Master Mix（Dye Plus）及ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。Dpn I消化酶购自上海碧云天生物技术有限公司。T4 DNA连接酶购自上海生工生物工程股份有限公司，QuickCut限制性内切酶购自宝日医生物技术（北京）有限公司。其余未提及的化学试剂均购自上海生工生物工程股份有限公司。
【数据】菌株：E. coli DH5α、S. cerevisiae YT02；试剂来源：擎科、麦克林、阿拉丁、诺唯赞、碧云天、生工、宝日医；原文未详述：表2、表S1、表S2具体内容
2.2 DNA操作
所有内源启动子、基因和终止子均通过PCR从酿酒酵母CEN.PK2–1C基因组DNA或相应质粒中扩增获得。At4CL1基因从拟南芥cDNA中PCR扩增，EcaroL从大肠杆菌基因组DNA中扩增。本研究使用的其他所有异源基因的密码子优化和基因合成由北京擎科生物技术有限公司完成，列于表S3。突变基因ARO3^D154N、ARO4^K229L、ARO7^G141S和PYK1^D146N通过重叠延伸PCR生成。这些候选基因通过限制性酶切连接或Gibson组装克隆到辅助质粒（pH1、pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pUMRI-A、pUMRI-B）中，或与相应启动子和终止子组装到pUC19中。此外，这些表达盒通过DNA assembler方法扩增并组装成多基因途径，随后整合到经验证能够实现稳定高水平表达的选定基因组位点。所有gRNA质粒均以pKan100-ADE2.1质粒为模板，使用相应引物对通过Gibson组装构建。gRNA序列在CRISPRdirect网站（https://crispr.dbcls.jp/）上设计，列于表S4。
【数据】模板：S. cerevisiae CEN.PK2–1C基因组DNA、A. thaliana cDNA、E. coli基因组DNA；突变方法：重叠延伸PCR；克隆方法：限制性酶切连接或Gibson assembly；gRNA设计：CRISPRdirect网站；原文未详述：表S3、表S4具体序列
2.3 酿酒酵母菌株的构建
工程酿酒酵母菌株YT02以CEN.PK2–1C（MATa; ura3–52; trp1–289; leu2–3112; his3Δ1; MAL2–8C; SUC2）为宿主构建。基因修饰通过将等摩尔的线性化DNA片段（50–100 ng/kb）和gRNA质粒（300–500 ng）使用标准LiAc/ssDNA/PEG方案共转化到酵母细胞中完成。转化子在含有200 μg/mL G418的YPD琼脂平板上筛选，阳性克隆通过PCR扩增验证。为消除游离型gRNA质粒，将正确克隆在非选择性培养基中培养，然后在无抗生素琼脂平板上划线。
【数据】转化方法：LiAc/ssDNA/PEG；DNA片段用量：50–100 ng/kb；gRNA质粒用量：300–500 ng；筛选：200 μg/mL G418 YPD平板；验证：PCR扩增
2.4 菌株培养条件
大肠杆菌在37°C的Luria-Bertani（LB）培养基中培养，培养基含5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl。必要时添加100 μg/mL氨苄青霉素或卡那霉素进行筛选。酿酒酵母在YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中于30°C、220 rpm振荡培养。必要时添加200 μg/mL G418筛选工程菌株。酵母摇瓶发酵时，工程酵母菌株首先在5 mL YPD试管中于30°C、220 rpm培养。然后将培养液以2%（v/v）接种量接种到含50 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中。本研究使用的YPD培养基（磷酸钠缓冲）补充了Na₂HPO₄·12H₂O（13.62 g/L）和NaH₂PO₄·2H₂O（9.68 g/L）。
【数据】E. coli培养：37°C，LB培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素或卡那霉素；S. cerevisiae培养：30°C、220 rpm，YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）；G418：200 μg/mL；接种量：2%（v/v）；摇瓶：250 mL瓶装50 mL YPD；缓冲液：Na₂HPO₄·12H₂O 13.62 g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 9.68 g/L
2.5 代谢物提取与检测方法
代谢物分析时，取200 μL发酵液与600 μL甲醇混合（4倍稀释），涡旋30 min，12,000 rpm离心10 min。上清液经0.22 μm有机滤膜过滤后用HPLC分析。所有样品通过高效液相色谱（HPLC）定量，使用Agilent 1260 HPLC系统，配备反相C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，Agilent）。检测模式为紫外-可见（UV-Vis）检测，配二极管阵列检测器（DAD）。流动相由20 mM乙酸铵（pH = 5，溶剂A）和乙腈（溶剂B）组成。梯度程序如下：0.00–14.00 min：90–65% A；14.00–15.00 min：65%–90% A；15.00–20.00 min：90% A。流速为1 mL/min，进样量为10 μL，柱温稳定在30°C。对香豆酸、咖啡酸和东莨菪内酯的检测波长分别设置为308 nm、323 nm和342 nm。从标准曲线获得的浓度乘以4以校正初始稀释倍数，反映发酵液中的实际代谢物浓度。使用紫外分光光度计测量600 nm处的光密度以监测细胞浓度。
【数据】提取：200 μL发酵液+600 μL甲醇，涡旋30 min，12,000 rpm离心10 min；过滤：0.22 μm有机滤膜；HPLC：Agilent 1260，C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：20 mM乙酸铵（pH=5）/乙腈；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30°C；检测波长：308 nm（对香豆酸）、323 nm（咖啡酸）、342 nm（东莨菪内酯）；稀释倍数：4倍
研究结果
3.1 酿酒酵母中咖啡酸生物合成途径的构建及其代谢通量增强
酿酒酵母YT02在YPD培养基中摇瓶发酵72小时后可产生146.79 mg/L的对香豆酸（p-CA）。因此，选择菌株YT02构建咖啡酸（CFA）生产平台（图2a）。前期研究表明，由FAD依赖的4-羟基苯乙酸3-单加氧酶（HpaB）及其伴侣NADPH-黄素氧化还原酶（HpaC）催化的细菌途径可在酵母中实现p-CA到CFA的高效转化。因此，选择来自铜绿假单胞菌的密码子优化PaHpaB和来自肠道沙门氏菌的SeHpaC进行异源表达。该特定酶组合已被验证在酵母系统中具有高催化活性。PaHpaB在强内源启动子P_TEF1下表达，SeHpaC由P_PGK1启动子驱动。所得工程菌株命名为C01，在YPD培养基中培养72小时。发酵后，菌株C01产生30.45 mg/L CFA，同时130.59 mg/L p-CA未被转化（图2b）。
为提高CFA产量，增加了HpaBC的拷贝数。所得菌株C02和C03分别携带两份和三份PaHpaB和SeHpaC拷贝，分别产生71.96 mg/L和151.67 mg/L的CFA（图2b）。这些效价分别比亲本菌株C01（30.45 mg/L）提高了2.4倍和5.0倍，证实增加HpaBC拷贝数可显著增强p-CA向CFA的转化。在酿酒酵母的芳香族氨基酸生物合成途径中，关键限速酶是ARO4（DAHP合酶）和ARO7（分支酸变位酶），两者均受酪氨酸的别构抑制。解除这种抑制可显著增强下游化合物（包括苯丙氨酸、酪氨酸及衍生的芳香族代谢物）的生产。为增强酿酒酵母中CFA的生物合成，通过染色体整合反馈抑制不敏感突变体ARO4^K229L和ARO7^G141S构建了菌株C04。该工程策略缓解了芳香族氨基酸途径中酪氨酸介导的反馈抑制，从而将代谢流重新导向前体供应。所得菌株C04在摇瓶发酵中产生160.87 mg/L CFA。
【数据】YT02产p-CA：146.79 mg/L（72 h）；C01产CFA：30.45 mg/L，残留p-CA：130.59 mg/L；C02产CFA：71.96 mg/L（2.4倍）；C03产CFA：151.67 mg/L（5.0倍）；C04产CFA：160.87 mg/L；酶来源：PaHpaB（铜绿假单胞菌）、SeHpaC（肠道沙门氏菌）；启动子：P_TEF1、P_PGK1
此外，来自大肠杆菌的莽草酸激酶（EcaroL）的表达被证明可提高酿酒酵母中莽草酸途径的通量，从而增强芳香族氨基酸的积累。由于杂醇/杂酸分支将苯丙氨酸和酪氨酸分流到不需要的副产物中，因此通过删除ARO10（苯丙酮酸脱羧酶）和PDC5（丙酮酸脱羧酶）来抑制这一竞争性汇点，改善碳分配流向CFA生物合成。将EcaroL整合到酿酒酵母的ARO10基因位点，ARO10被破坏以构建菌株C05，CFA效价增至267.27 mg/L。随后，用含有ARO2和苯丙氨酸不敏感反馈抗性突变体DAHP合酶（ARO3^D154N）的表达盒替换PDC5位点构建菌株C06，CFA效价增至271.28 mg/L。最后，将红冬孢酵母酪氨酸解氨酶（RgTAL）引入C06，建立L-酪氨酸到对香豆酸的单步转化，所得菌株C07在YPD摇瓶培养中产生301.98 mg/L CFA（图2c）。
【数据】C05产CFA：267.27 mg/L（整合EcaroL、敲除ARO10）；C06产CFA：271.28 mg/L（替换PDC5位点、表达ARO2和ARO3^D154N）；C07产CFA：301.98 mg/L（引入RgTAL）；基因操作：ARO10敲除、PDC5替换
3.2 东莨菪内酯生物合成途径的组装
从咖啡酸生物合成东莨菪内酯可分为两条不同的途径，涉及四种酶，在甲基转移酶步骤处分叉（图3a）。在途径1中，CFA首先被咖啡酸O-甲基转移酶（AtCOMT1）甲基化产生阿魏酸（FA）；然后FA被4-香豆酸：辅酶A连接酶1（At4CL1）转化为阿魏酰-CoA。最后，阿魏酰-CoA依次被阿魏酰-CoA 6′-羟化酶（AtF6′H1）羟化和香豆素合酶（AtCOSY）内酯化形成东莨菪内酯。在途径2中，CFA首先被At4CL1激活为咖啡酰-CoA，然后被咖啡酰-CoA O-甲基转移酶（AtCCoAOMT1）甲基化为阿魏酰-CoA。在AtF6′H1和AtCOSY的催化下，阿魏酰-CoA转化为东莨菪内酯。将途径1相关基因（At4CL1、AtF6′H1、AtCOSY和AtCOMT1）和途径2相关基因（At4CL1、AtF6′H1、AtCOSY和AtCCoAOMT1）分别整合到工程菌株C07的基因组中，构建菌株DL01和DL02。HPLC分析确认菌株DL01和DL02成功生物合成了东莨菪内酯（图3b）。DL01和DL02分别产生0.87 mg/L和10.12 mg/L的东莨菪内酯（图3c）。
At4CL1是东莨菪内酯生物合成途径中的关键酶，对多种底物具有催化活性，包括对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸。前期研究表明，At4CL1对对香豆酸（Km=38 μM）和咖啡酸（Km=11 μM）的亲和力显著高于对阿魏酸（Km=199 μM）的亲和力。这种底物偏好可能导致DL01菌株中中间产物积累，从而降低其东莨菪内酯产量。因此，DL02中的代谢途径通过替换甲基转移酶显著提高了东莨菪内酯的生物合成效率。
【数据】DL01产东莨菪内酯：0.87 mg/L；DL02产东莨菪内酯：10.12 mg/L；At4CL1动力学：p-CA Km=38 μM、CFA Km=11 μM、FA Km=199 μM；途径1基因：AtCOMT1、At4CL1、AtF6′H1、AtCOSY；途径2基因：AtCCoAOMT1、At4CL1、AtF6′H1、AtCOSY
为提高从咖啡酸到东莨菪内酯转化过程中目标基因的表达水平并增加东莨菪内酯产量，评估了半乳糖启动子替代组成型启动子的效果。半乳糖调控启动子受半乳糖和葡萄糖的调控。常规半乳糖调控启动子需要半乳糖作为诱导剂；在无半乳糖时，GAL80蛋白与转录因子GAL4结合形成复合物，抑制GAL4的转录激活能力，从而抑制GAL启动子的表达。在野生型酵母中，GAL启动子需要半乳糖激活，在无半乳糖时被GAL80抑制。在ΔGAL80菌株中，GAL启动子变为受葡萄糖调控：高葡萄糖水平时GAL4活性被抑制，低葡萄糖水平时GAL4活跃。这种动态调控策略模拟了从生长到生产阶段的代谢开关。为构建菌株DL03，通过整合四个启动子（P_GAL10、P_GAL1、P_GAL7和P_GAL2）驱动四个基因（At4CL1、AtF6′H1、AtCOSY和AtCCoAOMT1）表达的表达盒破坏了GAL80基因位点。该菌株产生10.87 mg/L的东莨菪内酯（图3c）。这些结果表明，经GAL调控系统改造的东莨菪内酯产量高于组成型调控系统。
【数据】DL03产东莨菪内酯：10.87 mg/L；启动子：P_GAL10、P_GAL1、P_GAL7、P_GAL2；基因：At4CL1、AtF6′H1、AtCOSY、AtCCoAOMT1；操作：GAL80位点破坏
为进一步提高酿酒酵母中东莨菪内酯的产量，通过增加AtCCoAOMT1、AtF6′H1和AtCOSY的拷贝数构建了菌株DL04。在摇瓶培养中，DL04产生13.20 mg/L的东莨菪内酯（图3d），比菌株DL03高21.4%。
【数据】DL04产东莨菪内酯：13.20 mg/L；较DL03提高：21.4%；操作：增加AtCCoAOMT1、AtF6′H1、AtCOSY拷贝数
3.3 代谢途径调控以增加前体供应
由于At4CL1催化p-CA转化为p-香豆酰-CoA，导致副产物积累。通过引入AtC3′H（肉桂酸3-羟化酶）和AtHCT（羟基肉桂酰-CoA转移酶）扩展途径构建菌株DL05（图4a）。这些酶将p-香豆酰-CoA转化为咖啡酰-CoA，丰富了东莨菪内酯的前体库。AtC3′H和AtHCT分别在P_GAL1和P_GAL10启动子下表达。DL05达到14.36 mg/L东莨菪内酯，比DL04提高8.8%（图4b）。
【数据】DL05产东莨菪内酯：14.36 mg/L；较DL04提高：8.8%；启动子：P_GAL1（AtC3′H）、P_GAL10（AtHCT）；操作：引入AtC3′H和AtHCT
中心代谢被重新配置以增加前体供应。莽草酸途径是芳香族氨基酸及其衍生物生物合成的关键代谢网络。其中，磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的胞内含量已成为莽草酸途径的关键限制因素。原文此处未详述后续具体操作细节。
【数据】代谢节点：PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）；操作：中心代谢重构；原文未详述：后续具体基因操作
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程策略，在酿酒酵母中实现了东莨菪内酯从葡萄糖的从头生物合成。十种异源基因（EcaroL、RgTAL、PaHpaB、SeHpaC、At4CL1、AtCCoAOMT1、AtF6′H1、AtCOSY、AtHCT和AtC3′H）分别来源于拟南芥、红冬孢酵母、铜绿假单胞菌、肠道沙门氏菌和大肠杆菌，成功整合到酵母基因组中。在摇瓶培养条件下，东莨菪内酯效价达到55.32 mg/L。据作者所知，这是首次在酿酒酵母中实现东莨菪内酯的从头生物合成，也是目前所有已发表文献中从葡萄糖从头微生物合成东莨菪内酯的最高效价。这一成果不仅证实了利用酿酒酵母作为底盘细胞生产东莨菪内酯的可行性，也为后续的产量优化和成本降低奠定了坚实基础。除现有的植物提取和化学合成方法外，该工作为通过酿酒酵母葡萄糖发酵生产东莨菪内酯提供了一种替代策略，为东莨菪内酯及其衍生物的微生物生物合成建立了具有广泛生物技术潜力的平台。
编译者解读：该研究展示了典型的"平台菌株+模块化组装"合成生物学策略——先在产对香豆酸的底盘菌株上逐步优化咖啡酸途径（拷贝数递增、解除反馈抑制、敲除竞争分支），再比较两条甲基化路线并引入动态调控。值得注意的是，研究者通过GAL80敲除实现了葡萄糖响应的生长-生产切换，避免了半乳糖诱导的成本；同时用PYK1^D146N弱化突变替代完全敲除，兼顾了生长与前体供应。最终55.32 mg/L的产量虽尚需提升，但作为首次报道的从头合成路线，为后续通过蛋白质工程和发酵优化提高产量提供了清晰的改进框架。
参考来源
Wang J. De Novo biosynthesis of scopoletin from glucose by engineered Saccharomyces cerevisiae. Biochemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.bej.2025.109934
DOI: 10.1016/j.bej.2025.109934