来源：Multilevel cytochrome P450 engineering integrating protein language model-guided evolution enables de novo biosynthesis of amentoflavone in Escherichia coli（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
穗花杉双黄酮类双黄酮化合物具有显著的神经保护活性，但天然含量极低、化学合成困难，制约了其开发应用。本研究通过多层级工程策略改造大肠杆菌平台，系统优化了关键P450酶GbCYP90J6的氧化偶联模块——从氧化还原伴侣筛选、N端表达调控到蛋白语言模型引导的定向进化，最终实现穗花杉双黄酮从头生物合成产量8.34倍提升（摇瓶达6.59 mg/L），并在5-L生物反应器中通过补料分批发酵将产量推至22.01 mg/L。
研究背景
随着人口老龄化加剧，神经退行性疾病全球患者数预计到2050年将达1.39亿。双黄酮类天然产物比其单体形式具有更强的多靶点药理活性，在神经退行性疾病、心血管疾病和免疫调节中表现突出。其中以分子间C3′-C8′′偶联为特征的穗花杉双黄酮型双黄酮，因强效神经保护特性而备受关注。然而，植物中该类化合物天然丰度极低（典型分离得率<0.001%），化学合成又依赖苛刻条件、多步复杂操作且立体控制差，难以规模化生产。合成生物学为穗花杉双黄酮类化合物的可持续制造提供了有前景的替代路径。
研究方法
2.1 菌株、质粒与化学品
大肠杆菌DH5α用于常规质粒构建与扩增。全细胞生物转化实验使用大肠杆菌JM109(DE3)。从头合成穗花杉双黄酮发酵实验采用大肠杆菌DJm3（原名GJA3）及其衍生菌株。载体pCDFDuet-1和pACYCDuet-1（Novagen，德国）用于多基因表达与组装。使用市售标准品进行产物鉴定与定量：穗花杉双黄酮（货号FY1576）购自南通飞宇生物；芹菜素（货号CFN98843）和(S)-柚皮素（货号CFN98742）购自武汉ChemFaces。所有限制性内切酶购自纽英伦生物技术（上海）。分子克隆使用In-Fusion ClonExpress II一步克隆试剂盒（南京诺唯赞，货号C112）。本研究所用引物、质粒和菌株列于表S1–S3。
【数据】菌株：E. coli DH5α、JM109(DE3)、DJm3；载体：pCDFDuet-1、pACYCDuet-1；标准品来源：Feiyubio、ChemFaces
2.2 质粒构建
质粒通过反向PCR或In-Fusion克隆构建，使用相应模板。对应引物、模板及所得质粒列于表S1。反向PCR产物经DpnI处理去除甲基化模板DNA后转化至大肠杆菌DH5α。阳性克隆通过Sanger测序确认。基因组编辑按照Li等描述的CRISPR-Cas9方案进行。
【数据】克隆方法：反向PCR/In-Fusion；DpnI消化；测序：Sanger；基因组编辑：CRISPR-Cas9
2.3 SCANEER辅助突变筛选与EVOLVEpro引导的GbCYP90J6定向进化
为获得催化活性增强的GbCYP90J6变体，采用整合序列共进化分析与蛋白语言模型预测的定向进化策略。首先使用SCANEER基于序列共进化分析预测潜在有益突变。该方法为每个突变分配SCANEER置信指数（SCI）评分，反映其提升酶活性的可能性。基于SCI排名，选择前五个候选突变进行实验验证，并总结其结构分布与预测稳定性效应（ΔΔG）（图S1）。将此前报道的GbCYP90J6单突变体活性数据，连同经实验表征的SCANEER预测变体，汇编为蛋白语言模型的初始训练数据集（第1轮）（图S2）。模型训练中，变体活性以相对野生型（WT）产物滴度的倍数变化表示，作为归一化适应度值。双突变体M1（L382F_A426P）的实验活性数据随后纳入训练数据集，进行第二轮模型训练（第2轮）（图S2）。基于第2轮更新训练数据，应用EVOLVEpro蛋白语言模型预测催化性能改善的组合突变。第2轮训练完成后，选择EVOLVEpro预测的前六个候选变体进行实验验证。测得活性数据随后作为第三轮模型训练输入（第3轮）。该迭代设计-测试-学习循环共重复五轮（第1–5轮），使模型性能和突变选择准确性逐步提升。每轮测试的所有变体及其对应活性值均记录并附于补充材料中，可完整重建训练过程。获得多个催化活性显著增强的GbCYP90J6组合变体用于下游生产评估。SCANEER分析使用其在线平台（https://sbi-web.postech.ac.kr:3051/w/SCANEER/introduction/）完成。EVOLVEpro的安装与执行遵循官方文档（https://github.com/mat10d/EvolvePro）。
【数据】SCANEER：SCI评分前5突变；EVOLVEpro：每轮前6候选；迭代轮数：5轮；活性表征：相对WT产物滴度倍数变化
2.4 eGFP荧光强度归一化至细胞密度的定量
表达eGFP的大肠杆菌菌株的荧光强度和对应细胞密度（OD600）使用全波长多功能酶标仪（Varioskan™ Flash，Thermo Fisher Scientific，美国）测量。荧光测量前，细胞沉淀用去离子水洗涤以去除残留培养基，并重悬于等体积去离子水中。取100 μL洗涤后的细胞悬液转移至黑色96孔板进行荧光测量。荧光信号以激发波长485 nm、发射波长520 nm记录。细胞密度测定时，取100 μL发酵液用去离子水稀释20倍后转移至透明96孔板，测量OD600值。荧光强度值归一化至对应OD600以校正细胞密度差异。所有测量使用三个独立生物学重复。
【数据】激发波长：485 nm；发射波长：520 nm；稀释倍数：20倍；生物学重复：3次
2.5 分子动力学（MD）模拟
WT-底物复合物结构来自前期研究，A426P和M7模型通过PyMOL在WT结构中引入突变后经MD模拟获得稳定构象。使用GROMACS（版本2021.3）软件对蛋白-配体复合物进行100 ns分子动力学模拟。选择AMBER99SB-ILDN力场生成蛋白拓扑文件，小分子配体拓扑文件使用Amber20软件的MCPB模块和GAFF力场生成。体系采用截断八面体TIP3P溶剂盒，边界距离1 nm，添加Na⁺/Cl⁻离子中和体系电荷。能量最小化采用2500步最陡下降法后接2500步共轭梯度法。体系随后在298.15 K下进行100 ps NVT系综模拟和100 ps NPT系综模拟平衡。随后在周期性边界条件下进行100 ns MD系综模拟。长程静电相互作用采用Particle Mesh Ewald方法，非键相互作用截断1 nm，碰撞频率2 ps，体系压力101.325 kPa，积分步长2 fs，每10 ps记录轨迹。从平衡轨迹最后20 ns提取稳定分子构象，用于分析模型及蛋白-配体间相互作用强度。
【数据】MD模拟：100 ns；力场：AMBER99SB-ILDN/GAFF；溶剂：TIP3P截断八面体；温度：298.15 K；压力：101.325 kPa；积分步长：2 fs；轨迹记录：每10 ps
2.6 大肠杆菌中芹菜素的全细胞生物转化
工程化大肠杆菌菌株先在LB培养基中37°C过夜预培养。随后以1:100稀释接种至添加20 g/L甘油的TB培养基中。每个实验设置三个生物学重复。当细胞密度达到OD600 0.6–0.8时，培养物冷却至室温，加入终浓度0.1 mM的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导。同时加入溶于50 mM甲基-β-环糊精（MCD）的芹菜素底物至终浓度50 μM，对应MCD终浓度4.75 mM。诱导和底物添加后，培养物在22°C振荡孵育72小时进行生物转化。培养结束后收集全细胞反应混合物进行后续分析。
【数据】预培养：LB、37°C、过夜；接种比：1:100；培养基：TB+20 g/L甘油；诱导OD600：0.6–0.8；IPTG：0.1 mM；底物：50 μM芹菜素（溶于50 mM MCD）；MCD终浓度：4.75 mM；转化条件：22°C、72 h、振荡；重复：3个生物学重复
2.7 摇瓶培养中穗花杉双黄酮的从头合成
工程化大肠杆菌菌株在LB培养基中37°C过夜预培养，然后以1:100稀释接种至……
（后续方法内容原文节选在此截断，以下按原文已提供内容继续）
研究结果
3.1 工程化CPR配对与空间组织增强GbCYP90J6电子传递效率
在前期工作中，我们构建了菌株sXH140——一种L-酪氨酸过表达的GJA3衍生菌，携带芹菜素合成模块（pYH57）和芹菜素二聚化模块（pBIF21，含GbCYP90J6的L382F变体）。L382F活性比WT高2.1倍。尽管在大肠杆菌中实现了穗花杉双黄酮的从头生物合成，但最终产物滴度相对于其前体芹菜素仍然过低，转化率仅约2.5%。这种严重的通量失衡表明，由L382F催化的氧化C-C偶联步骤是途径的主要瓶颈。
细胞色素P450单加氧酶依赖CPR从NADPH传递电子，电子传递效率往往决定异源微生物系统中的催化转换速率。次优的P450-CPR配对可能限制电子通量，导致产物形成减少。因此，改善L382F与其CPR之间的氧化还原伴侣兼容性和空间邻近性，预期可增强氧化二聚化效率和整体途径输出（图2A）。
为系统评估氧化还原伴侣兼容性，我们选择了多个物种中此前报道能在微生物宿主中高效工作的CPR。候选包括来自巨大芽孢杆菌的BmCPR（GenBank: AKP78169）、来自银杏的GbCPR（GenBank: UTS77797）和来自甜叶菊的SrCPR（GenBank: ABB88839），并与前期系统中使用的还原酶AtCPR2进行比较。所有CPR基因均按大肠杆菌密码子优化，并替换原始质粒骨架中的AtCPR2以确保一致比较。每个构建体在大肠杆菌JM109(DE3)中表达，并在补充50 μM芹菜素的生物转化体系中评估催化性能。
72小时后，观察到氧化偶联效率的显著差异。AtCPR2产生0.74 mg/L穗花杉双黄酮，BmCPR产生0.60 mg/L。相比之下，GbCPR和SrCPR分别将产物形成显著提升至2.19 mg/L和4.06 mg/L。值得注意的是，SrCPR较AtCPR2提升5.51倍，被确定为L382F最兼容的氧化还原伴侣。这些结果证明了氧化还原伴侣匹配在工程化P450系统中最大化电子传递效率的关键作用。
为进一步提升L382F变体之外的催化性能，我们接下来尝试通过突变增强酶的内在活性。使用SCANEER进行序列共进化分析——该计算工具基于残基共进化模式预测功能相关突变，并分配SCANEER置信指数（SCI）评分以估计活性改善的可能性。基于SCI排名，选择前五个突变（E177Q、A125S、V390L、A426P和M140L）进行实验验证（图S1）。残基A125、M140、E177和V390位于远离血红素活性中心的位置，而A426位于血红素轴向配体C425的邻近位置。此外，纳入DDGun预测的ΔΔG值以评估这些突变对蛋白稳定性的影响。结果表明E177Q、V390L、A426P和M140L可能发挥稳定作用，而A125S被预测为去稳定化。值得注意的是，A125S观察到的活性降低与其预测的去稳定效应一致，提示局部结构完整性破坏对催化功能产生负面影响。然而，预测稳定性与活性之间并非严格线性关系，因为稳定突变并不普遍导致催化增强。例如，尽管多个突变被预测增加稳定性，但只有A426P和M140L导致活性提升（分别为4.67倍和1.70倍）。这一观察提示，除整体稳定性外，局部构象动力学和结构定位在决定催化效率方面也起关键作用。特别地，A426位于血红素轴向配体C425邻近。脯氨酸替换可能改变血红素中心的局部结构环境，从而增强活性，正如A426P所观察到的。
为评估潜在协同效应，还构建了组合L382F和A426P的双突变体（命名为M1）。然而，该变体仅显示1.96倍提升，显著低于A426P单变体。这种降低可能源于突变间的上位效应。基于这些结果，选择A426P与SrCPR一起作为后续实验的核心催化单元。
除氧化还原伴侣选择和酶突变外，P450与CPR蛋白之间的物理距离和取向已知会强烈影响电子传递效率。因此，过度的空间分离或不利取向会降低偶联效率。我们假设在A426P与SrCPR之间强制邻近或定义取向可进一步增强催化输出。评估了两种互补策略：通过自组装肽对共定位和通过肽连接子直接基因融合（图2A）。自组装系统包括SH3/SH3lig、SpyTag/SpyCatcher和SnoopTag/SnoopCatcher模块，融合至各伴侣的N端。同时，构建了由不同物理化学性质肽连接子连接的P450-CPR融合蛋白，分为柔性、半柔性和刚性三类（表S4）。对每种连接子，均生成两种融合方向以确定蛋白顺序对催化性能的影响。
在补充50 μM芹菜素的生物转化体系中，自组装肽支架显示极小改善，多种组合甚至降低穗花杉双黄酮产量。例如，SpyTag_trGbCYP90J6^A426P与SpyCatcher_SrCPR配对、SnoopCatcher_trGbCYP90J6^A426P与SnoopTag_SrCPR配对均导致产物滴度降低，而SH3lig_trGbCYP90J6^A426P与SH3_SrCPR配对完全丧失活性。这些结果表明不合适的强制组装可能引入空间位阻，限制底物进入或损害电子传递。
相比之下，连接子介导的融合构建体显著改善催化性能。A426P位于N端的融合构建体普遍优于SrCPR位于N端的构建体，表明结构域取向关键影响结构域间电子传递，模拟微生物P450的组织方式。在此框架内，连接子优化进一步增强了催化效率，其中柔性Link5变体被确定为最有效配置，产生13.88 mg/L穗花杉双黄酮。这相对于未进行空间距离优化的系统提升5.51倍。这些发现证明，通过基因融合合理控制结构域间距离和取向可有效增强电子传递效率和催化输出。相比之下，自组装支架产生较不可预测的空间排列，当所得几何结构与高效氧化还原偶联不相容时可能损害活性。
【数据】L382F活性：WT的2.1倍；转化率：约2.5%；AtCPR2产量：0.74 mg/L；BmCPR产量：0.60 mg/L；GbCPR产量：2.19 mg/L；SrCPR产量：4.06 mg/L（AtCPR2的5.51倍）；A426P活性提升：4.67倍；M140L活性提升：1.70倍；M1（L382F_A426P）活性提升：1.96倍；Link5融合产量：13.88 mg/L（较未优化提升5.51倍）；底物浓度：50 μM芹菜素；转化时间：72 h
3.2 N端融合标签工程增强P450表达与体内催化活性
（原文此节内容在节选处截断，以下按原文已提供内容继续）
3.3 EVOLVEpro蛋白语言模型引导的GbCYP90J6定向进化
（原文此节内容在节选处截断，以下按原文已提供内容继续）
3.4 GbCYP90J6变体的结构比较与MD模拟分析
（原文此节内容在节选处截断，以下按原文已提供内容继续）
3.5 多层级工程策略协同增强穗花杉双黄酮从头生产
（原文此节内容在节选处截断，以下按原文已提供内容继续）
3.6 5-L生物反应器补料分批发酵
（原文此节内容在节选处截断，以下按原文已提供内容继续）
讨论与解读
本研究通过系统性的多层级工程策略，成功在大肠杆菌中实现了穗花杉双黄酮的从头生物合成。核心创新在于将P450酶工程从单一维度拓展至氧化还原伴侣匹配、空间组织优化、N端表达调控和蛋白语言模型引导定向进化的多维度协同。SrCPR的筛选将产物产量提升5.51倍，Link5柔性连接子融合进一步实现5.51倍提升，而EVOLVEpro引导的五轮迭代进化则系统性地优化了酶的内在催化活性。最终组合策略使摇瓶产量达6.59 mg/L，5-L生物反应器补料分批发酵达22.01 mg/L。
值得注意的是，A426P单变体（4.67倍）与L382F组合后活性反而降至1.96倍，这种上位效应提示P450酶工程中突变组合并非简单叠加。此外，自组装支架策略的失败与连接子融合策略的成功形成鲜明对比，说明空间组织的精确控制比简单共定位更为关键。
编译者解读：本研究展示了合成生物学中"酶工程-途径工程-发酵工程"三位一体的系统思维。蛋白语言模型引导的定向进化为P450这类难以通过理性设计改造的酶提供了高效路径，其迭代"设计-测试-学习"循环具有通用性。然而，5-L发酵中观察到的细胞耐受性瓶颈提示，产物毒性或代谢负担可能成为规模化生产的限制因素。未来工作需在宿主耐受性改造与产物原位移除方面寻求突破。该研究为其他P450依赖的分子间C-C偶联反应（如双黄酮类、生物碱类化合物）的微生物合成提供了可借鉴的工程框架。
参考来源
Dai X. Multilevel cytochrome P450 engineering integrating protein language model-guided evolution enables de novo biosynthesis of amentoflavone in Escherichia coli. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134897
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134897