来源：Rational metabolic reprogramming of yeast across multiple pathway nodes for de novo liquiritigenin biosynthesis from glucose（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
甘草素（Liquiritigenin, LIG）是一种具有抗氧化、抗炎等多种生物活性的天然黄酮类化合物，在食品、医药和化妆品领域应用前景广阔。本研究以酿酒酵母为底盘细胞，通过系统比较p-香豆酸合成路径、下游酶来源、芳香族氨基酸前体供给、NADPH供应及发酵条件，将LIG产量从初始菌株的0.01 mg/L提升至摇瓶发酵的4.09 mg/L和5-L补料分批发酵的8.42 mg/L。研究揭示，CHR依赖的LIG分支选择性而非前体或辅因子供应，是当前酵母系统中限制LIG合成的主要瓶颈。
研究背景
甘草素是一种具有广阔应用前景的天然黄酮类化合物。其抗氧化和抗炎特性使其成为食品行业中颇具吸引力的天然抗氧化剂。临床前研究已证明甘草素对肠道炎症、屏障功能障碍、脂质代谢和胰岛素敏感性具有改善作用，这些潜在的健康益处支持其在功能性食品、饮料和膳食补充剂中的应用。在医药领域，甘草素可能有助于开发针对癌症、神经退行性疾病和代谢综合征的药物。在化妆品领域，其抗氧化和抗炎特性使其适用于抗衰老和亮肤配方。受这些应用前景驱动，全球甘草素市场2025年估值达2580万美元，预计2030年将达到3820万美元。此外，甘草素还是合成漆黄素、大豆苷元等多种高价值黄酮醇和异黄酮的重要中间体。
然而，甘草素在微生物宿主中的从头生物合成面临多重挑战：缺乏与异源系统兼容的高效酶、前体氨基酸供应不足、辅因子可用性和电子传递效率欠佳等。本研究针对这些制约因素，在酿酒酵母中开展了系统的多模块工程改造。
研究方法
2.1 菌株、化学品与培养基
大肠杆菌DH5α用于质粒构建，酿酒酵母CEN.PK2-1C作为背景菌株。标准品包括L-酪氨酸（CAS: 60-18-4）、L-苯丙氨酸（CAS: 63-91-2）、肉桂酸（CAS: 140-10-3）、p-香豆酸（CAS: 501-98-4）、柚皮素（CAS: 480-41-1）、异甘草素（CAS: 961-29-5）和甘草素（CAS: 578-86-9），均购自阿拉丁生化科技（上海）。基础培养基组分均购自生工生物工程（上海），除非另有说明。大肠杆菌在Luria–Bertani（LB）培养基中培养。酿酒酵母在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基或缺乏尿嘧啶的合成完全培养基（SC-Ura）中培养。
【数据】菌株：E. coli DH5α、S. cerevisiae CEN.PK2-1C；培养基：LB、YPD、SC-Ura；标准品来源：阿拉丁生化科技（上海）；基础培养基来源：生工生物工程（上海）
2.2 质粒与菌株构建
用于质粒构建的引物由金唯智（苏州）合成。所有质粒均使用2×Phanta Flash Master Mix扩增带有同源区的DNA片段，随后使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V2进行同源组装。本研究所用酶和试剂盒均购自诺唯赞（南京）。所有构建的质粒均基于pY26载体，并通过金唯智测序验证。基因组编辑采用CRISPR/Cas12a系统，将体外组装的表达盒整合到目标基因组位点。crRNA使用Cas-Designer在线工具设计。以CEN.PK2-1C基因组为模板扩增内源启动子、终止子、基因及上下游同源臂。异源基因经密码子优化后由金唯智合成。基因表达盒按照重叠延伸PCR（OE-PCR）方案构建。将基因表达盒、含目标特异性crRNA的质粒以及表达Cas12a的pCSN067质粒共同导入酵母感受态细胞。转化子在添加遗传霉素的SC-Ura固体培养基上筛选。培养2–4天后，通过菌落PCR筛选转化子，并通过DNA测序进一步确认正确整合。本研究所用全部基因、引物序列和酵母菌株分别列于表S1、表S2A–D和表1。
【数据】质粒载体：pY26；组装试剂：ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V2；PCR酶：2×Phanta Flash Master Mix；基因组编辑：CRISPR/Cas12a；筛选标记：遗传霉素；筛选时间：2–4天
2.3 培养条件
质粒构建用大肠杆菌在含氨苄青霉素的LB培养基中、37°C条件下培养。酿酒酵母单菌落接种至相应培养基，30°C培养。需要时添加氨基酸作为前体，或使用5-氟乳清酸（5-FOA）回收尿嘧啶选择标记。摇瓶发酵时，单菌落接种至5 mL YPD培养基，30°C、220 rpm培养24–48 h。种子培养物随后按2%（v/v）接种量转接至含25 mL YPD的250 mL摇瓶中，发酵5天。5-L生物反应器发酵采用2-L工作体积，以二级种子培养物接种。具体流程为：单菌落先接种至5 mL YPD培养基培养24 h获得一级种子培养物；一级种子培养物按5%（v/v）接种量转接至含100 mL YPD的500 mL摇瓶中再培养24 h获得二级种子培养物；随后将二级种子培养物按5%（v/v）接种量接种至发酵培养基中。搅拌速度维持在300–800 rpm以保持溶解氧为30%。pH控制在5.5，通气速率维持2 vvm。初始碳源耗尽后（约12 h），以8 mL/h速率补加补料培养基。发酵培养基组成为2Y1T1.5P（20 g/L酵母提取物、40 g/L蛋白胨、40 g/L葡萄糖、1 g/L L-Tyr和1.5 g/L L-Phe）、8 g/L KH2PO4、5 g/L MgSO4·7H2O、0.7 g/L ZnSO4·7H2O、10 mL/L微量元素溶液和12 mL/L维生素溶液。补料培养基为750 g/L葡萄糖。微量元素和维生素溶液的详细组成见表S3和S4。
【数据】大肠杆菌培养温度：37°C；酵母培养温度：30°C；摇瓶转速：220 rpm；种子培养时间：24–48 h；接种量：2%（v/v）；发酵时间：5天；5-L发酵工作体积：2 L；接种量：5%（v/v）；搅拌速度：300–800 rpm；溶解氧：30%；pH：5.5；通气速率：2 vvm；补料速率：8 mL/h；发酵培养基：2Y1T1.5P（20 g/L酵母提取物、40 g/L蛋白胨、40 g/L葡萄糖、1 g/L L-Tyr、1.5 g/L L-Phe）；补料培养基：750 g/L葡萄糖
2.4 样品处理与分析 methods
黄酮类化合物测定：0.5 mL发酵样品与0.5 mL甲醇混合，充分混匀5 min，室温（RT，20–25°C）下13,500×g离心5 min，经0.22 μm尼龙滤膜过滤。滤液于4°C保存，1周内进行HPLC分析。氨基酸分析：发酵样品用水稀释，室温下13,500×g离心5 min，经0.22 μm PVDF滤膜过滤，4°C保存，24 h内进行HPLC分析。HPLC分析在Shimadzu Nexera LC-40系统（Shimadzu，京都，日本）上进行，配备反相C18色谱柱（5 μm，4.6 × 250 mm，Shimadzu，日本），柱温30°C。流动相由A液（0.2%磷酸）和B液（甲醇）组成。不同化合物的具体检测条件见表S5。
在对数生长期采集样品用于NADPH和NADP+提取。NADPH提取：收集培养液，4°C离心，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，将细胞沉淀转移至研钵中。液氮处理后，将细胞研磨成细粉。随后加入300 μL 0.2 M NaOH，50°C孵育10 min以提取NADPH并降解NADP+。混合物置于冰上，用600 μL 0.1 M HCl中和，4°C下13,500×g离心10 min，上清液转移至另一离心管中，−80°C保存（最多1周）后分析。NADP+的提取方法相同，区别在于使用0.2 M HCl提取、0.1 M NaOH中和。NADP+/NADPH水平使用NADP+/NADPH检测试剂盒（WST-8法；碧云天，上海）定量。具体操作：50 μL制备好的样品加入96孔板，与100 μL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶工作液混合。37°C避光孵育10 min后，每孔加入10 μL显色液，充分混匀，37°C避光孵育10–20 min。使用酶标仪在450 nm处测定吸光度。根据相应标准曲线计算NADP+和NADPH水平。
葡萄糖含量使用葡萄糖检测试剂盒（邻甲苯胺法；碧云天）测定。具体操作：适当稀释的样品与葡萄糖测定试剂混合至终体积190 μL，涡旋混匀，室温下5,000×g离心5 s收集管底液体。混合物用PCR仪在95°C加热8 min，然后冷却至4°C。随后将180 μL反应混合物转移至干净的96孔板中，反应结束后30 min内于630 nm处测定吸光度。根据相应标准曲线计算葡萄糖浓度。
【数据】黄酮提取：0.5 mL样品+0.5 mL甲醇，混匀5 min，13,500×g离心5 min（RT），0.22 μm尼龙滤膜；氨基酸提取：13,500×g离心5 min（RT），0.22 μm PVDF滤膜；HPLC柱温：30°C；流动相：0.2%磷酸/甲醇；NADPH提取：300 μL 0.2 M NaOH，50°C孵育10 min，600 μL 0.1 M HCl中和，13,500×g离心10 min（4°C）；NADP+提取：0.2 M HCl提取、0.1 M NaOH中和；检测波长：450 nm（NADPH）、630 nm（葡萄糖）
2.5 统计分析
统计分析采用Student's t检验（非配对、双尾Welch's t检验；∗p < 0.05，∗∗p < 0.01，∗∗∗p < 0.001，∗∗∗∗p < 0.0001）或单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey检验（p < 0.05）。所有数据代表至少三个生物学独立样本的平均值，误差棒表示标准差。
【数据】统计方法：Student's t检验（非配对双尾Welch's t检验）或单因素方差分析+Tukey检验；显著性水平：∗p < 0.05，∗∗p < 0.01，∗∗∗p < 0.001，∗∗∗∗p < 0.0001；生物学重复：≥3
研究结果
3.1 酵母中p-CA生物合成路径的构建与工程改造
p-CA是葡萄糖合成LIG的重要中间体，由L-Phe和L-Tyr产生（图1）。然而，ARO10（苯丙酮酸脱羧酶）和PDC5（丙酮酸脱羧酶）可通过产生芳香醇与L-Phe和L-Tyr的合成竞争葡萄糖碳流（图2A）。由于这些基因在AAAs生物合成过程中将代谢流引入竞争途径，因此选择ARO10和PDC5位点整合p-CA模块基因，在引入目标基因的同时削弱竞争途径。
如图2A所示，酵母中p-CA的合成可通过L-Tyr途径（酪氨酸解氨酶分支，TAL分支）或L-Phe途径（苯丙氨酸解氨酶分支，PAL分支）完成。TAL分支仅需酪氨酸解氨酶（TAL），而PAL分支需要苯丙氨酸解氨酶（PAL）和C4H。首先测试了TAL分支，因其路径更短且无需辅因子依赖的羟化步骤。将来自约氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae）的FjTAL导入酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组，构建菌株QP01（FjTAL），在葡萄糖上培养120 h后产生27.95 mg/L p-CA（图2B）。
随后评估PAL分支。将来自玉米（Zea mays）的ZmPAL导入CEN.PK2-1C基因组，构建菌株QP02（ZmPAL）。在葡萄糖上培养120 h后，QP02产生23.30 mg/L p-CA，与QP01的p-CA滴度相当，同时积累20.54 mg/L肉桂酸（CiA）（图2B和C）。这可以用ZmPAL的底物混杂性解释——ZmPAL对L-Phe和L-Tyr均具有催化活性（图2A）。ZmPAL能以TAL样方式将L-Tyr直接转化为p-CA，同时将L-Phe转化为CiA进入PAL分支。因此，QP02的低p-CA产量可能反映了CiA向p-CA的转化效率低下，高CiA积累量支持了这一推断。
为增强CiA向p-CA的转化，将来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的AtC4H导入QP02，构建菌株QP03（ZmPAL， AtC4H）。在葡萄糖上培养120 h后，QP03的p-CA滴度（23.57 mg/L）未显著高于QP02（图2B）。其CiA滴度（21.15 mg/L）与QP02相当（图2C），表明单独引入AtC4H的催化效率有限，上游产生的CiA仍难以转化。此外，细胞生长的差异和发酵过程的波动共同影响代谢物的积累。QP01、QP02和QP03之间的细胞生长无显著差异（p > 0.05）。这些结果表明，单独引入AtC4H对细胞生长或CiA积累影响甚微，且未能实现高于QP01的p-CA产量。
AtC4H是一种细胞色素P450酶，不能直接从NADPH接受电子，而是依赖细胞色素P450还原酶（CPRs）将电子从NADPH传递至催化中心。因此，将AtCPR1和AtCPR2（来自拟南芥的两个CPR）分别导入QP03，获得菌株QP04（ZmPAL， AtC4H， AtCPR1）和QP05（ZmPAL， AtC4H， AtCPR2）。引入每个CPR均大幅降低了CiA积累，并使p-CA产量约翻倍（图2B和C）。在葡萄糖上培养120 h后，QP04产生51.97 mg/L p-CA和2.19 mg/L CiA，而QP05产生46.85 mg/L p-CA和4.32 mg/L CiA。QP04和QP05的p-CA和CiA产量相当（p > 0.05），但QP05的生长略差于QP04。因此，选择表达AtCPR1的QP04进行后续工程改造。
细胞色素b5（CYB5）也被报道可促进P450催化反应中的电子传递。因此，在菌株QP04中过表达内源CYB5以进一步提高电子传递效率和p-CA产量，构建菌株QP06（ZmPAL， AtC4H， AtCPR1， CYB5）。在葡萄糖上培养120 h后，QP06产生83.53 mg/L p-CA（图2B），比QP04高60.73%。这些结果表明，PAL分支结合C4H相关电子传递系统的优化，比TAL分支更有效地促进了p-CA的产生。该菌株因此作为上游p-CA生产底盘，用于后续下游LIG/NAR生物合成路径的构建（图3）。
【数据】QP01（FjTAL）：27.95 mg/L p-CA（120 h）；QP02（ZmPAL）：23.30 mg/L p-CA、20.54 mg/L CiA（120 h）；QP03（ZmPAL+AtC4H）：23.57 mg/L p-CA、21.15 mg/L CiA（120 h）；QP04（+AtCPR1）：51.97 mg/L p-CA、2.19 mg/L CiA（120 h）；QP05（+AtCPR2）：46.85 mg/L p-CA、4.32 mg/L CiA（120 h）；QP06（+CYB5）：83.53 mg/L p-CA（120 h），比QP04高60.73%
3.2 酵母中LIG生物合成路径的构建与工程改造
在菌株QP06中建立从AAAs合成p-CA的路径后，引入从p-CA合成LIG的下游途径。将Pc4CL（来自欧芹的4CL）、SmCHS（来自水飞蓟的CHS）、MsCHR（来自紫花苜蓿的CHR）和MsCHI（来自紫花苜蓿的CHI）导入QP06，构建LIG生产菌株QL01。然而，在葡萄糖上培养120 h后，QL01仅产生0.01 mg/L LIG，检测到32.88 mg/L NAR，剩余2.08 mg/L p-CA（图3A和B）。这些结果表明，只有一小部分p-CA被转化为LIG，下游途径未能有效转向LIG形成，CHR可能代表一个主要的限制步骤。
因此，比较了三种在先前研究中报道具有高活性的CHR（来自紫花苜蓿的MsCHR、来自蒙古黄芪的AmCHR和来自大豆的GmCHR），以确定最适合LIG生物合成的CHR。基于QL01，将MsCHR分别替换为AmCHR和GmCHR，构建菌株QL02（AmCHR）和QL03（GmCHR）。在葡萄糖上培养120 h后，菌株QL02产生0.19 mg/L LIG和32.80 mg/L NAR，残留2.13 mg/L p-CA；QL03产生0.70 mg/L LIG和15.74 mg/L NAR，残留1.83 mg/L p-CA（图3A和B）。在测试的CHR中，含GmCHR的QL03获得了最高的LIG滴度并减少了NAR积累，而QL01–QL03之间的残留p-CA水平相似。这些结果表明，GmCHR在将产物分布转向LIG形成方面更为有效。
为进一步提高途径性能，将QL03中的原始基因（ZmPAL、Pc4CL和SmCHS）替换为AtPAL和At4CL（来自拟南芥）或PhCHS（来自矮牵牛），单独或组合替换。所得菌株命名为QL04（AtPAL）、QL05（At4CL）、QL06（PhCHS）、QL07（At4CL和PhCHS）和QL08（AtPAL和At4CL）。在葡萄糖上培养120 h后，菌株QL05的LIG产量最高，达到0.83 mg/L，比QL03高20.29%（图3C）。同时，生物量略有下降，而NAR产量和残留p-CA滴度基本不变（p > 0.05）（图3C和D）。
替换PAL和4CL来源后LIG/NAR比例的变化可以用下游途径的催化顺序和分支点关系来解释。最近的体外证据表明，柚皮素查尔酮可以直接作为CHR的底物并被转化为ISOLIG。因此，在LIG/NAR分支中，4CL首先激活p-CA生成p-CA-CoA，CHS随后将p-CA-CoA与丙二酰-CoA缩合生成柚皮素查尔酮。在该分支点，柚皮素查尔酮可以经历自发或CHI催化的环化形成NAR，或被CHR还原形成ISOLIG，后者再由CHI转化为LIG。因此，CHR作用于CHS之后，与NAR形成途径竞争。基于这一机制，PAL和4CL来源可以通过改变进入CHS反应的p-CA和p-CA-CoA供应来影响下游LIG/NAR分布。结果显示，将ZmPAL替换为AtPAL主要增加了NAR积累而未改善LIG产量，而将Pc4CL替换为At4CL在一定程度上增加了LIG产量。
【数据】QL01（MsCHR）：0.01 mg/L LIG、32.88 mg/L NAR、2.08 mg/L残留p-CA（120 h）；QL02（AmCHR）：0.19 mg/L LIG、32.80 mg/L NAR、2.13 mg/L残留p-CA（120 h）；QL03（GmCHR）：0.70 mg/L LIG、15.74 mg/L NAR、1.83 mg/L残留p-CA（120 h）；QL05（At4CL）：0.83 mg/L LIG，比QL03高20.29%
讨论与解读
本研究采用系统的多模块工程策略，在酿酒酵母中评估了LIG的从头生物合成，并阐明了LIG与NAR之间的碳流分配约束。通过优化p-CA生物合成路线、增强电子传递效率、强化AAAs供应和改善NADPH再生，LIG产量从QL01的0.01 mg/L提升至QL14的2.22 mg/L。摇瓶发酵条件优化后，QL14产生4.09 mg/L LIG和79.47 mg/L NAR；随后的5-L补料分批发酵将相应滴度分别提升至8.42和185.74 mg/L。两种发酵条件下NAR持续占优表明，增强的途径输入优先流向NAR形成分支而非CHR依赖的LIG形成分支。综合来看，所应用的工程策略成功增强了整体黄烷酮途径输出，但不足以将碳流重新导向CHR依赖的LIG分支。本工作的关键贡献在于识别出CHR依赖的分支选择性——而非单纯的前体或辅因子供应——是当前工程化系统中限制LIG生物合成的主要瓶颈。这一发现阐明了LIG与NAR之间的碳流分配约束，为未来工程改造提供了理性基础。
编译者解读：该研究最值得借鉴之处在于其"系统比较+逐步诊断"的策略——每一步改造都通过数据明确回答"瓶颈在哪里"，最终将矛头精准指向CHR分支选择性。从合成生物学应用角度看，这种逐节点排查的思维方式比单纯堆砌基因更有工程价值。研究揭示的NAR大量积累现象也提示，黄酮类化合物的微生物合成不能只关注目标产物，分支代谢流的调控同样关键。未来若能在CHR的底物特异性改造或蛋白工程方面取得突破，LIG的高效微生物合成将有望实现产业化。
参考来源
Li, J. (2026). Rational metabolic reprogramming of yeast across multiple pathway nodes for de novo liquiritigenin biosynthesis from glucose. Food Bioscience. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109513
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109513