来源：De novo biosynthesis of lavandulol and lavandulyl acetate in Escherichia coli（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
薰衣草醇及其乙酸酯——乙酸薰衣草酯，是薰衣草精油中独特的"不规则"单萜成分，在食品和化妆品行业应用广泛。受限于植物提取的低产量与高成本，构建微生物细胞工厂成为可持续替代方案。本研究首次在大肠杆菌中实现了薰衣草醇与乙酸薰衣草酯的从头生物合成，通过异源甲羟戊酸（MVA）途径与薰衣草基二磷酸合酶（LPPS）偶联，结合内源磷酸酶筛选与醇酰基转移酶整合，最终获得89.43 mg/L的乙酸薰衣草酯产量，为不规则单萜的高效微生物生产提供了原核平台。
研究背景
薰衣草精油在治疗和化妆品领域已应用数百年，是香水、药品、食品调味剂和防腐剂的关键成分。然而，从植物来源常规提取薰衣草精油日益受到低产量、气候多变和土地资源限制的制约，无法满足全球不断增长的需求。因此，亟需开发可持续的生物技术平台，利用工程微生物和可再生原料生产高价值薰衣草组分。
在萜烯组分中，薰衣草醇及其乙酸酯——乙酸薰衣草酯，是定义薰衣草特征香气谱的独特"不规则"单萜。生物合成上，单萜由特定合酶催化10碳焦磷酸前体的重排衍生而来。在经典途径中，香叶基二磷酸合酶（GPPS）或橙花基二磷酸合酶（NPPS）催化二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）和异戊烯基二磷酸（IPP）的"头到尾"缩合，分别形成香叶基二磷酸（GPP）或橙花基二磷酸（NPP）。相比之下，薰衣草醇的生物合成通过独特的"非头到尾"机制进行，由薰衣草基二磷酸合酶（LPPS）催化。
研究方法
2.1 化学试剂
薰衣草醇和乙酸薰衣草酯购自源叶生物（上海源叶生物科技有限公司，中国上海）。柠檬烯、异戊烯醇、异戊醇、乙酸异戊烯酯、乙酸异戊酯、橙花醇、香叶醇、香叶醛、乙酸香叶酯、法尼醇、法尼醛购自阿拉丁（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国上海）。同源重组试剂盒购自诺唯赞生物（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国南京）。除非另有特别说明，其他化学品和试剂盒均购自生工（上海生工生物工程股份有限公司，中国上海）。
【数据】试剂来源：源叶生物（薰衣草醇、乙酸薰衣草酯）、阿拉丁（柠檬烯、异戊烯醇、异戊醇、乙酸异戊烯酯、乙酸异戊酯、橙花醇、香叶醇、香叶醛、乙酸香叶酯、法尼醇、法尼醛）；试剂盒：诺唯赞同源重组试剂盒、生工其他试剂
2.2 菌株与质粒
本研究所用全部菌株、质粒和引物列于表1和表S1。大肠杆菌DH5α用于分子克隆和质粒维持。大肠杆菌BL21（DE3）用于全细胞催化以比较不同醇酰基转移酶（AAT）对薰衣草醇的酯化能力。来自杂薰衣草（Lavandula intermedia）的LPPS基因序列（GenBank: JX985358），以及来自草莓属（Fragaria species）的SAAT（GenBank: AX025475）和VAAT（GenBank: AX025504）基因序列，均经密码子优化以适配大肠杆菌表达，并由生工（中国上海）商业合成。大肠杆菌内源焦磷酸酶（Ppase）基因（包括NudJ、Cdh、PhoA、Ppa、RdgB、LpxH、MutT、NudC、YccX、Ais、BacA、Dut和NudF）通过聚合酶链式反应（PCR）从大肠杆菌MG1655 ΔendA ΔrecA（DE3）基因组DNA扩增获得。候选AAT基因（ATF1、ATF2、EHT1和EEB1）来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4741基因组。CAT基因从pACYCDuet-1质粒扩增获得。所有基因序列见表S2。质粒构建采用标准化同源重组方法，按制造商方案执行。寡核苷酸合成和DNA测序服务由生工（中国上海）完成。
【数据】菌株：E. coli DH5α（克隆）、E. coli BL21(DE3)（全细胞催化）、E. coli MG1655 ΔendA ΔrecA (DE3)（基因组模板）；基因来源：LPPS (JX985358)、SAAT (AX025475)、VAAT (AX025504)；Ppase候选基因数：13个；AAT候选基因：ATF1、ATF2、EHT1、EEB1（酿酒酵母BY4741）
研究结果
5.1 大肠杆菌中薰衣草醇生物合成途径的重建
为在大肠杆菌中重建该生物合成途径，本研究实施了由两个功能模块组成的模块化策略。上游模块为外源MVA途径，来源于pJBEI-6409质粒（Addgene #47048），该质粒此前已被验证可高效生产柠檬烯。具体而言，通过删除pJBEI-6409中的香叶基二磷酸合酶（GPPS）和柠檬烯合酶（LS）基因，构建了新型上游质粒pMVA345。该修饰旨在将代谢流从GPP重新导向DMAPP——LPPS的关键前体。为确保稳定的前体供应，构建了下游验证质粒pGEX-trGPPS-LS，将GPPS-LS基因模块置于pGEX骨架中tac启动子控制之下。
基于前期报道表明大肠杆菌DH5α与修饰后的pJBEI-6409质粒具有优异兼容性，且相较于大肠杆菌BL21和MG1655等常见菌株具有更高的香叶醇和β-胡萝卜素生产能力，本研究选择大肠杆菌DH5α作为初始宿主菌株。将pMVA345和pGEX-trGPPS-LS共转化至大肠杆菌DH5α，获得演示菌株Ls_1。甘油被优先选作碳底物，因为大肠杆菌中甘油的代谢每碳原子可产生更高比例的还原当量[NAD(P)H]，这对单萜生物合成极为有利。此外，甘油代谢不触发强烈的碳分解代谢物阻遏（CCR），从而最小化对异源途径表达的全局调控干扰。
使用10 g/L甘油，Ls_1菌株在无IPTG条件下48小时内产生308.75 mg/L柠檬烯（图S1）。该产量与前期使用原始pJBEI-6409质粒报道的约400 mg/L相当，证实了当前质粒架构的代谢效率。
LPPS催化两分子DMAPP的非头尾缩合，形成不规则前体LPP，随后由Ppases去磷酸化生成薰衣草醇。鉴于已知大肠杆菌内源Ppases可将GPP和NPP分别水解为香叶醇和橙花醇，研究者假设它们可能对LPP去磷酸化也具有混杂活性。为验证这一点，通过将GPPS-LS替换为LPPS构建了下游质粒pGEX-LPPS。将pGEX-LPPS和pMVA345共转化至大肠杆菌DH5α，生成Lav_1菌株。
GC-MS分析确认Lav_1在IPTG浓度为0、0.01和0.1 mM时均产生薰衣草醇，验证了天然Ppases对LPP的去磷酸化作用（图1b）。值得注意的是，还检测到痕量乙酸薰衣草酯。鉴于氯霉素乙酰转移酶（CAT）已知对短链醇以乙酰-CoA为供体具有催化混杂性，研究者确认薰衣草醇被上游质粒抗生素抗性标记所表达的CAT乙酰化。通过优化诱导参数，确定0.01 mM IPTG为理想浓度，在此条件下获得36.41 mg/L薰衣草醇和9.35 mg/L乙酸薰衣草酯（图S2）。时间进程分析显示，产量在48小时达到峰值，随后在72小时略有下降，推测是由于产物挥发性或代谢降解所致（图S3）。
为尝试将LPPS表达与MVA途径解偶联，研究者随后在Lav_2菌株中采用araBAD启动子系统（pBAD-LPPS）。使用甘油防止CCR，进行了广泛的诱导方案优化，涵盖同步诱导（OD600 0.6–1.0时0–0.1 mM IPTG和10–50 mM阿拉伯糖）以及IPTG后12小时添加阿拉伯糖的序贯诱导。然而，薰衣草醇产量始终可忽略不计（数据未显示）。研究者推测该结果源于关键的通量失衡——araBAD启动子的严格调控未能产生足够的转录输出，而强大且渗漏的tac启动子则能实现早期酶建立，从而最小化前体积累与萜烯合酶活性之间的时间错配。
【数据】菌株：E. coli DH5α（Ls_1、Lav_1、Lav_2）；质粒：pMVA345（上游）、pGEX-trGPPS-LS（验证）、pGEX-LPPS（下游）；碳源：10 g/L甘油；时间：48h；柠檬烯产量：308.75 mg/L；IPTG浓度：0、0.01、0.1 mM；薰衣草醇产量：36.41 mg/L（0.01 mM IPTG）；乙酸薰衣草酯产量：9.35 mg/L；峰值时间：48h
5.2 过表达内源Ppases以增强薰衣草醇生产
过表达Ppases是缓解多种萜烯醇生物合成瓶颈的有效策略。通过加速二磷酸中间体向相应醇形式的转化，这种"拉动"策略已在多个微生物细胞工厂中实现创纪录产量。例如，在酿酒酵母中，鉴定和工程化冰片基二磷酸（BPP）的去磷酸化使产量提高33.8倍，达到753 mg/L。类似地，在大肠杆菌中，过表达Nudix水解酶NudJ促进了规则单萜前体的去磷酸化，实现了橙花醇（966.55 mg/L）和龙脑（87.20 mg/L）的创纪录产量。
鉴于LPP的去磷酸化是由未知的大肠杆菌内源Ppases介导的关键步骤，研究者通过系统过表达潜在的磷酸酶候选基因来增强薰衣草醇产量。共13个内源Ppases基因，包括磷酸酶（NudJ）、CDP-二酰甘油焦磷酸酶（Cdh）、碱性磷酸酶（PhoA）、无机焦磷酸酶（Ppa）、dITP/XTP焦磷酸酶（RdgB）、UDP-2,3-二酰葡糖胺水解酶（LpxH）、8-氧代-dGTP二磷酸酶（MutT）、NAD加帽RNA水解酶（NudC）、酰基磷酸酶（YccX）、推定脂多糖核心庚糖(II)-磷酸磷酸酶（Ais）、十一异戊烯基焦磷酸磷酸酶（BacA）、dUTP二磷酸酶（Dut）和ADP-核糖焦磷酸酶（NudF）（图2a），从大肠杆菌MG1655(DE3)中扩增获得。这些候选基因被整合到LPPS基因下游，在pGEX-LPPS-Ppase质粒中构建合成操纵子。
在0.01 mM IPTG诱导、1%甘油为碳底物的条件下，13个工程菌株中有11个成功产生薰衣草醇，过表达LpxH和NudF的菌株除外。值得注意的是，菌株Lav_4（NudJ）和Lav_9（RdgB）表现出显著提升的产量，分别为35.95 mg/L和42.87 mg/L，较对照菌株Lav_1提高122%和145%。相反，其他候选基因要么未能提高产量，要么导致不同程度的产量下降。所有菌株中乙酸薰衣草酯持续低积累（数据未显示），表明后续乙酰化步骤存在瓶颈。
此外，观察到广泛的副产物谱，包括C5（异戊烯醇、异戊醇）、C10（香叶醇、橙花醇、香叶醛、乙酸香叶酯）和C15（法尼醇、法尼醛）化合物（图S4和S5）。这些副产物可能来源于内源Ppases对IPP/DMAPP、GPP和FPP的非特异性去磷酸化，随后由醇脱氢酶或氯霉素乙酰转移酶（CAT）进行内源氧化或乙酰化。橙花醇的存在尤为值得关注；它可能通过橙花醛的还原形成，橙花醛是香叶醇脱氢衍生而来的香叶醛的异构体。对副产物分布的详细调查显示，所有菌株中总副产物浓度较高（38–98 mg/L）。
【数据】Ppase候选基因：13个（NudJ、Cdh、PhoA、Ppa、RdgB、LpxH、MutT、NudC、YccX、Ais、BacA、Dut、NudF）；IPTG浓度：0.01 mM；碳源：1%甘油；Lav_4（NudJ）产量：35.95 mg/L；Lav_9（RdgB）产量：42.87 mg/L；产量提升：122%（Lav_4）、145%（Lav_9）；副产物浓度：38–98 mg/L；成功产薰衣草醇菌株数：11/13
讨论与解读
本研究通过模块化策略在大肠杆菌中首次实现了薰衣草醇和乙酸薰衣草酯的从头生物合成。上游MVA途径与LPPS的偶联成功建立了从甘油到目标产物的合成路线，而内源Ppases的系统筛选揭示了RdgB在LPP去磷酸化中的关键作用，使薰衣草醇产量提升至42.87 mg/L。后续通过整合酿酒酵母来源的ATF1醇酰基转移酶并优化宿主菌株与发酵工艺，最终将乙酸薰衣草酯产量推至89.43 mg/L。该研究还揭示了副产物形成的复杂网络，为理解内源酶混杂性对异源途径的影响提供了参考。
编译者解读：从合成生物学应用角度看，本研究的亮点在于巧妙利用宿主内源酶的混杂活性完成关键去磷酸化步骤，避免了引入额外异源磷酸酶带来的负担。RdgB的发现为其他不规则萜烯醇的微生物生产提供了通用靶点。然而，89.43 mg/L的乙酸薰衣草酯产量距工业化仍有差距，副产物占比偏高提示通量分配尚需优化。未来若能通过蛋白质工程提升LPPS对DMAPP的亲和力，或采用动态调控策略平衡前体供应与产物合成，有望进一步突破产量瓶颈。
参考来源
Hu K. De novo biosynthesis of lavandulol and lavandulyl acetate in Escherichia coli. Journal of Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.01.014
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.01.014