来源：Modular pathway engineering enables gram-scale de novo biosynthesis of narirutin in yeast（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
柚皮苷是一种具有抗氧化和降脂活性的黄烷酮-7-O-二糖，传统上通过植物提取获得，但产率低且受季节限制。本研究将柚皮苷生物合成途径划分为独立功能模块，在酿酒酵母中实现了从葡萄糖到柚皮苷的从头生物合成。通过敲除内源糖苷水解酶EXG1构建稳健糖基化底盘，筛选高效糖基转移酶组装两步糖基化模块，结合UDPG供给的“推-阻”代谢工程策略，最终通过5-L补料分批发酵将产量提升至1153.3 mg/L，为目前报道的最高水平，首次实现了柚皮苷的克级规模微生物合成。
研究背景
柚皮素是一种关键黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、降脂和抗癌等多种生物活性。然而，其在水和脂质中的溶解度有限，限制了口服吸收，降低了治疗潜力。糖基化修饰可有效改善这一缺陷，增强溶解性和生物利用度。柚皮苷是柚皮素的糖基化衍生物，通过芸香糖（由葡萄糖和鼠李糖组成的二糖）形成糖苷键连接。它不仅保留了柚皮素的生理活性，还表现出多靶点抗阿尔茨海默病活性。分子动力学模拟揭示，与其他黄烷酮糖苷如柚皮苷和新橙皮苷不同，柚皮苷通过独特的“闭合构象诱导”机制抑制BACE1，同时直接抑制Aβ聚集并表现出中等抗氧化活性。这些独特优势使柚皮苷成为治疗神经退行性疾病的高潜力先导化合物。目前柚皮苷主要通过柚类芸香科水果果皮提取，该方法效率低、成本高，且受季节和地域限制。
研究方法
2.1 化学试剂与材料
本研究所用黄酮标准品购自上海源叶生物科技有限公司。分子生物学试剂包括Phanta Max Master Mix（Dye Plus）、Green Taq Mix、一步克隆试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒，均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。胰蛋白胨和酵母提取物由Oxoid（英国汉普郡）提供，氨苄青霉素购自北京索莱宝科技有限公司。所有异源基因序列和密码子优化引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，详细信息见补充材料。
【数据】试剂来源：源叶生物、诺唯赞、Oxoid、索莱宝、生工生物；氨苄青霉素浓度：未详述
2.2 质粒与菌株构建
质粒构建以大肠杆菌JM109为克隆宿主，本研究所用质粒详见补充材料。基因表达构建体使用线性化的pY26和pRS424载体生成，功能表达模块通过重叠延伸PCR技术开发。靶向特定基因组区域的引导RNA（gRNA）设计使用CHOPCHOP在线工具（https://chopchop.cbu.uib.no/），相应靶序列列于补充材料。所有质粒构建均通过ClonExpress MultiS一步克隆试剂盒进行同源重组。阳性克隆初筛采用菌落PCR，随后通过DNA测序确认。补充材料提供了本研究开发的所有酵母菌株基因型概览。
酿酒酵母C800菌株为CEN.PK2-1D衍生株（MATα; ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3Δ1; MAL2-8C; SUC2; gal80::G418），作为所有遗传修饰的基础菌株。从C800菌株提取的基因组DNA用于扩增天然启动子、终止子和基因，异源基因来源于合成的片段或已有质粒中的优化密码子序列。CRISPR-Cas9系统用于实现表达盒的过表达、删除和染色体基因整合。重组质粒、整合片段或基因破坏盒导入酿酒酵母采用醋酸锂/单链载体DNA/聚乙二醇转化法。转化子在缺少氨基酸的酵母氮源碱（YNB）平板上筛选，30°C培养3-5天。经菌落PCR验证的阳性克隆随后在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基中培养用于进一步分析。
【数据】克隆宿主：大肠杆菌JM109；载体：pY26、pRS424；转化方法：醋酸锂/ssDNA/PEG法；筛选培养基：YNB无氨基酸平板；培养温度：30°C；培养时间：3-5天
2.3 培养基与培养条件
大肠杆菌JM109在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中培养，添加100 μg/mL氨苄青霉素以维持质粒稳定性和筛选。酿酒酵母菌株常规培养和发酵使用YPD培养基（20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖）。转化子在YNB培养基（20 g/L葡萄糖、6.7 g/L酵母氮源碱）上分离，根据需要添加营养缺陷型补充物：50 mg/L亮氨酸、组氨酸、色氨酸或尿嘧啶。为消除gRNA质粒并恢复URA3标记，成功转化子在含1 g/L 5-氟乳清酸（5-FOA）的YPD平板上划线培养。
5-L生物反应器（无锡天木生物科技有限公司）大规模培养的初始培养基组成为10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖。补料培养基1含400 g/L葡萄糖。补料培养基2含200 g/L蛋白胨和100 g/L酵母提取物。补料培养基3含18 g/L KH₂PO₄、10.24 g/L MgSO₄·7H₂O、7 g/L K₂SO₄、0.56 g/L Na₂SO₃、20 mL/L微量元素A和24 mL/L微量元素B。微量元素A含5.75 g/L ZnSO₄·7H₂O、0.32 g/L MnCl₂·4H₂O、0.47 g/L CoCl₂·6H₂O、0.48 g/L NaMoO₄·2H₂O、2.9 g/L CaCl₂·2H₂O、2.8 g/L FeSO₄·7H₂O和80 mL 0.5 M EDTA，pH调至8.0。微量元素B含0.05 g/L生物素、1 g/L泛酸钙、1 g/L烟酸、25 g/L肌醇、1 g/L盐酸硫胺素、1 g/L盐酸吡哆醛和0.02 g/L对氨基苯甲酸。
摇瓶发酵过程中，挑取单菌落接种于5 mL YPD培养基，30°C、220 rpm振荡培养16 h。随后将1%（v/v）预培养物转移至含25 mL新鲜YPD培养基的250 mL摇瓶中，相同条件下培养。96 h取样，使用高效液相色谱（HPLC）分析。
5-L生物反应器发酵中，挑取单菌落接种于含5 mL YPD培养基的50 mL摇瓶中，30°C、220 rpm振荡培养24 h建立一级种子培养。随后将2%（v/v）接种量转移至含25 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，相同条件下培养20 h建立二级种子培养。这些培养物以2%（v/v）接种量转移至含2.5 L培养基的5-L生物反应器中。反应器温度维持在30°C，通气量为1.0 vvm。搅拌速度在200-600 rpm之间变化，确保溶解氧（DO）水平维持在20%-30%范围内。pH通过4 M NaOH自动调节至5.5。当初始20 g/L葡萄糖耗尽后，以1-5 mL/h速率开始连续补料培养基1。根据剩余葡萄糖水平调整补料速率，使其保持在1 g/L以下直至发酵结束。补料培养基2和3采用分步补料策略，分别在发酵启动后40、80、120、160和200 h各补充100 mL。
【数据】LB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl；氨苄青霉素：100 μg/mL；YPD培养基：20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖；YNB培养基：20 g/L葡萄糖、6.7 g/L酵母氮源碱；营养缺陷型补充物：50 mg/L；5-FOA：1 g/L；初始培养基：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖；补料1：400 g/L葡萄糖；补料2：200 g/L蛋白胨、100 g/L酵母提取物；补料3：18 g/L KH₂PO₄、10.24 g/L MgSO₄·7H₂O、7 g/L K₂SO₄、0.56 g/L Na₂SO₃；微量元素A：5.75 g/L ZnSO₄·7H₂O、0.32 g/L MnCl₂·4H₂O、0.47 g/L CoCl₂·6H₂O、0.48 g/L NaMoO₄·2H₂O、2.9 g/L CaCl₂·2H₂O、2.8 g/L FeSO₄·7H₂O、80 mL 0.5 M EDTA；微量元素B：0.05 g/L生物素、1 g/L泛酸钙、1 g/L烟酸、25 g/L肌醇、1 g/L盐酸硫胺素、1 g/L盐酸吡哆醛、0.02 g/L对氨基苯甲酸；摇瓶培养：30°C、220 rpm、16 h预培养、1%接种、96 h取样；生物反应器：30°C、1.0 vvm、200-600 rpm、DO 20%-30%、pH 5.5（4 M NaOH）、补料速率1-5 mL/h、分步补料100 mL×5次（40/80/120/160/200 h）
2.4 分析方法
采用配备二极管阵列检测器的岛津HPLC系统对黄酮及其糖苷进行定量分析。分析时，将0.5 mL培养样品与等体积无水甲醇（100%，v/v）混合，涡旋5 min，然后12,000 rpm离心2 min。所得上清液通过0.22 μm针头式过滤器过滤，-20°C保存待分析。分离使用Sustain C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm；岛津，日本京都），柱温30°C。流动相为（A）含0.1%（v/v）甲酸的水和（B）乙腈，流速1 mL/min，梯度程序：0-10 min 10-40% B，10-20 min 40-50% B，20-25 min 50-10% B，25-30 min等度保持10% B。检测波长为284 nm，进样量10 μL。
【数据】HPLC系统：岛津二极管阵列检测器；样品处理：0.5 mL样品+0.5 mL无水甲醇、涡旋5 min、12,000 rpm离心2 min、0.22 μm过滤；色谱柱：Sustain C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；柱温：30°C；流动相：0.1%甲酸水/乙腈；流速：1 mL/min；检测波长：284 nm；进样量：10 μL
2.5 实时荧光定量PCR
酿酒酵母总RNA提取、基因组DNA去除和反转录按此前报道的方法进行（Zhao et al., 2025）。RNA提取所用材料均为无RNase级别。RT-qPCR使用购自上海生工生物工程股份有限公司的试剂盒进行。内源ACT1基因作为内参对照，菌株QH44作为参考样品。RT-qPCR所用引物列于补充材料。
【数据】内参基因：ACT1；参考菌株：QH44
2.6 统计分析
每项实验设三个生物学重复。数据分析使用IBM SPSS软件（IBM公司，美国纽约），统计显著性通过双尾Student's t检验和单因素方差分析确定（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001）。
【数据】生物学重复：3次；统计方法：双尾t检验、单因素ANOVA；显著性水平：P<0.05、P<0.01、P<0.001
研究结果
3.1 通过阻断竞争性水解和筛选高效糖基转移酶构建稳健糖基化模块
为实现柚皮素向柚皮苷的高效转化，我们首先解决了两个关键挑战：酵母内源去糖基化活性和高活性UF7GT的鉴定。柚皮苷从柚皮素的生物合成经由柚皮素-7-O-葡萄糖苷这一中间产物（图2A）。然而，酿酒酵母中黄酮糖苷的积累常受内源糖苷酶活性影响。为研究这一现象，我们在C800菌株发酵液中添加200 mg/L柚皮素-7-O-葡萄糖苷，监测其96 h稳定性。底物浓度急剧下降至1.6 mg/L，同时柚皮素水平持续升高（见补充材料），证实存在能够将柚皮素-7-O-葡萄糖苷水解为柚皮素的活性糖苷酶。
为鉴定负责的酶，我们聚焦于5个此前报道参与黄酮糖苷降解的天然糖苷水解酶基因（EXG1、SPR1、EGH1、SIM1和SCW2）。利用CRISPR-Cas9在C800背景中构建单基因敲除突变体，获得菌株QH01-QH05。与200 mg/L柚皮素-7-O-葡萄糖苷孵育96 h后，EXG1缺失菌株（QH01）保留了192.6 mg/L底物，而其他敲除菌株表现出近乎完全的降解，残留水平低于10 mg/L（图2B）。这些结果确定EXG1是负责柚皮素-7-O-葡萄糖苷水解的主要酶，将其删除作为菌株工程的基础步骤。
消除竞争性水解活性后，我们聚焦于建立高效的7-O-葡萄糖基化系统。鉴于黄酮UF7GT主要来源于植物，我们选取了8个已知催化黄酮7-O-糖基化的候选酶。这些酶为ApGT（穿心莲）、AtGT（拟南芥）、BvGT（甜菜）、CsGT（茶树）、MdGT（苹果）、SlGT（黄芩）、VlGT（美洲葡萄）和SbGT（黄芩）。这些基因经密码子优化后在酿酒酵母菌株QH01中表达，获得菌株QH06-QH13（图2C）。每个重组菌株用200 mg/L柚皮素培养，评估其向柚皮素-7-O-葡萄糖苷的转化效率。发酵96 h后，8个UF7GT均确认功能性表达（见补充材料），产量范围为6.8 mg/L（ApGT）至313.1 mg/L（CsGT）。值得注意的是，AtGT和CsGT表现出优异的催化活性，分别产生311.9 mg/L和313.1 mg/L柚皮素-7-O-葡萄糖苷，显著优于其他酶（图2D）。尽管两者在标准条件下转化效率相当，但来源于不同植物物种（拟南芥和茶树），可能与下游鼠李糖基化模块表现出不同的兼容性。因此，这两个酶被选为后续途径优化的候选酶。
为评估这两个领先酶的稳健性和底物耐受性，我们在200-800 mg/L柚皮素浓度范围内评估了其转化效率（图2E、F）。两个酶均表现出柚皮素-7-O-葡萄糖苷产量的剂量依赖性增加，在500 mg/L柚皮素时达到峰值。在此峰值浓度下，QH07（AtGT）产生632.3 mg/L（79%转化率），而QH09（CsGT）达到696.3 mg/L（87%转化率）（见补充材料）。然而，进一步将柚皮素浓度提高至该阈值以上显著损害了细胞生长和酶转化效率（图2E、F，见补充材料）。这种降低可能归因于高底物浓度下的酶抑制和活性位点饱和，以及长时间孵育过程中非特异性副反应增加或底物不稳定的可能性。这些结果表明，虽然两个酶在柚皮素浓度高达500 mg/L时均表现出稳健活性，但进一步提高底物浓度会导致显著抑制。值得注意的是，上述饲喂实验仅设计为酶筛选工具，用于在标准化条件下比较AtGT和CsGT的催化性能。观察到的500 mg/L峰值代表生物转化最大耐受浓度。然而，该值不直接适用于从头生物合成。在从头合成菌株中，柚皮素由葡萄糖内源产生，其胞内稳态浓度维持在低于500 mg/L的水平。因此，正常生理条件下不太可能发生底物抑制。
【数据】底物饲喂：200 mg/L柚皮素-7-O-葡萄糖苷；96 h残留：QH01保留192.6 mg/L，其他菌株<10 mg/L；敲除基因：EXG1、SPR1、EGH1、SIM1、SCW2；UF7GT筛选：8个候选酶；200 mg/L柚皮素下产量范围：6.8 mg/L（ApGT）至313.1 mg/L（CsGT）；AtGT产量：311.9 mg/L；CsGT产量：313.1 mg/L；500 mg/L柚皮素时：QH07（AtGT）632.3 mg/L（79%转化）、QH09（CsGT）696.3 mg/L（87%转化）；底物浓度范围：200-800 mg/L
3.2 构建柚皮苷生物合成三酶模块
为构建柚皮苷生物合成途径，我们设计了一个三酶模块，实现柚皮素的两步糖基化：（1）UF7GT进行初始葡萄糖基化，（2）RHM生成糖基供体UDP-鼠李糖，（3）1,6-RhaT进行最终鼠李糖基化，生成柚皮苷（图3A）。鉴于UDP-鼠李糖供应是途径中的潜在瓶颈，我们此前通过将RHM的截短UDP-D-葡萄糖4,6-脱水酶结构域与双功能NRS/ER结构域直接融合，构建了优化的融合酶RHM-NRS/ER。该设计将脱水、差向异构化和还原步骤整合为单一高效单元。
为确定最佳酶组合，我们在QH01底盘菌株中对三类酶（RHM、UF7GT和1,6-RhaT）进行组合共表达。涉及的酶包括3个RHM融合变体：OlRHM-NRS/ER（长距天门冬）、AtRHM-NRS/ER（拟南芥）和VvRHM-NRS/ER（葡萄）；2个领先UF7GT候选酶（CsGT、AtGT）；以及4个1,6-RhaT：Ci1,6-RhaT（野菊）、Cm1,6-RhaT（柚）、Cs1,6-RhaT（甜橙）和Cc1,6-RhaT（克莱门氏小柑橘）。尽管3个RHM、2个UF7GT和4个1,6-RhaT的所有可能组合理论上会产生24个变体，但QH01菌株中所有24种组合的初步筛选显示，7种组合产生极低或检测不到的柚皮苷转化。因此，仅选择剩余17种具有可测量活性的组合（QH14-QH30）进行详细分析。
补充500 mg/L柚皮素后，整合AtGT、OlRHM-NRS/ER和Cs1,6-RhaT的菌株QH23实现了最高柚皮苷浓度265.7 mg/L（见补充材料）。值得注意的是，另外3个菌株（QH14、QH27和QH29）产生的柚皮苷水平超过200 mg/L（图3B），强调了所构建三酶模块的稳健性和普适性。工程菌株的柚皮苷产量表现出较大差异，范围为6.1 mg/L至265.7 mg/L（见补充材料）。这一显著差异强调，途径效率由特定酶组合的功能兼容性决定，而非仅仅存在完整途径。在所有构建体中，表达Cs1,6-RhaT的菌株始终比含有其他物种直系同源物（Ci1,6-RhaT、Cm1,6-RhaT和Cc1,6-RhaT）的菌株实现更高的柚皮苷产量。一致地，产量最高的4个菌株（QH14、QH23、QH27和QH29）均含有Cs1,6-RhaT（图3B）。这一观察可能通过底物偏好性解释：Cs1,6-RhaT偏好黄烷酮糖苷，而Chrysa...
【数据】三酶模块：UF7GT + RHM + 1,6-RhaT；RHM变体：OlRHM-NRS/ER、AtRHM-NRS/ER、VvRHM-NRS/ER；UF7GT：CsGT、AtGT；1,6-RhaT：Ci1,6-RhaT、Cm1,6-RhaT、Cs1,6-RhaT、Cc1,6-RhaT；理论组合：24种；有效组合：17种（QH14-QH30）；最高产量：QH23（AtGT + OlRHM-NRS/ER + Cs1,6-RhaT）265.7 mg/L（500 mg/L柚皮素）；产量范围：6.1-265.7 mg/L；>200 mg/L菌株：QH14、QH23、QH27、QH29
3.3 工程化UDPG代谢以增强柚皮苷生产
（注：此节原文未在节选中完整呈现，以下内容基于后续菌株QH32和UDPG工程策略的上下文进行忠实翻译。）
【数据】原文节选未详述此节完整数据
3.4 多拷贝整合策略优化柚皮苷从头生物合成
【数据】原文节选未详述此节完整数据
3.5 补料分批发酵生产柚皮苷
【数据】原文节选未详述此节完整数据
讨论与解读
本研究通过综合代谢工程成功开发了高效的酿酒酵母细胞工厂，实现柚皮苷的从头生物合成。首先利用CRISPR-Cas9技术敲除天然糖苷水解酶基因EXG1，构建了糖基化增强的底盘菌株。随后引入由AtGT、OlRHM-NRS/ER和Cs1,6-RhaT组成的兼容糖基化途径模块，从柚皮素实现了265.7 mg/L的柚皮苷产量。为提高糖基供体UDPG的可用性，过表达了PGM2和UGP1，同时破坏竞争基因ALG5和GLC3，将代谢流重定向至UDPG生物合成。为增强遗传稳定性，将完整生物合成途径整合至高产柚皮素菌株的基因组中。最终，5-L生物反应器中的补料分批发酵将柚皮苷产量进一步提高至1153.3 mg/L。据我们所知，这是首次在酿酒酵母中实现柚皮苷的从头克级规模生产，标志着这一高价值黄酮工业化生产的重要进展。
编译者解读
本研究展示了模块化代谢工程策略在复杂天然产物合成中的系统威力——从底盘改造、酶筛选、模块组装到发酵优化，每一步都有明确的设计逻辑和数据支撑。尤其值得关注的是，研究团队对酶组合兼容性的重视（24种组合中仅17种有效），提示了合成生物学中“酶匹配”比“酶存在”更关键的普遍规律。不足之处在于，原文对UDPG工程和多拷贝整合部分的细节未在节选中完整呈现，读者需查阅全文获取完整数据。该工作为其他黄酮糖苷类化合物的微生物合成提供了可复制的技术路线。
参考来源
Lu Q. Modular pathway engineering enables gram-scale de novo biosynthesis of narirutin in yeast. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134994
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134994