来源：De novo biosynthesis of synephrine in engineered Escherichia coli（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
辛弗林是酸橙中含量最丰富的活性生物碱，具有抗炎、抗氧化等多种药理活性，但植物提取法受限于天然含量低、提取效率差和纯化步骤复杂。本研究首次在大肠杆菌中实现了辛弗林的从头生物合成——通过体外酶催化验证三条关键酶活性，将其导入产酪氨酸的BAK11菌株，再经β-羟化酶筛选与截短改造，最终在5-L发酵罐中达到88.1 mg/L产量。这是微生物从头合成辛弗林的首篇报道。
研究背景
辛弗林是一种来源于酸橙及其栽培变种的原生物碱，占这些植物中生物碱总量的90%以上。它存在邻位、间位和对位三种位置异构体，其中对位辛弗林（简称辛弗林）被认为是主要活性形式，研究最为广泛。辛弗林的抗炎作用已在多种炎症实验模型中得到验证：在脂多糖刺激的RAW264.7细胞中，辛弗林通过β-肾上腺素能受体下调p38丝裂原活化蛋白激酶和核因子-κB信号通路，抑制促炎细胞因子和一氧化氮的产生。电子自旋共振谱证实辛弗林能有效清除羟基和超氧阴离子自由基。以人胚肺成纤维细胞WI-38为模型的研究表明，辛弗林可通过抑制p53-p21和p16-INK4A-pRB通路，阻止H₂O₂诱导的氧化应激和线粒体功能障碍，从而预防细胞早衰。此外，辛弗林还表现出抗癌等多种药理活性。然而，从植物中提取辛弗林面临天然丰度低、提取效率差、纯化步骤复杂等瓶颈，亟需开发新的生产方式。
研究方法
2.1 菌株、质粒构建与培养条件
本研究所用质粒和菌株列于表S1。辛弗林合成通路涉及的关键酶基因——来源于克莱奥帕特拉橘（Citrus Cleopatra mandarin）的TYDC、来源于宫川早生橘（Citrus Miyagawa wase）的MwDβH、来源于黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的DmTβH、来源于蜡蚧轮枝菌（Akanthomyces lecanii）的AlDβH以及来源于人的hPNMT——均经密码子优化后由GENEWIZ Biotech（中国苏州）合成。这些酶的详细信息见表S2。pET28a和pACYC用作表达载体，所有重组质粒通过Gibson Assembly方法构建。大肠杆菌DH10B作为质粒构建和扩增的克隆宿主，大肠杆菌Rosetta（DE3）作为蛋白表达宿主，大肠杆菌BAK11作为产辛弗林的底盘菌株。所有菌株在LB培养基中、37°C、220 rpm条件下培养。用于生物催化的菌株在TB培养基（12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物和0.4%甘油）中培养。根据需要，培养基中添加50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL氯霉素。
【数据】菌株：E. coli DH10B、Rosetta（DE3）、BAK11；培养基：LB、TB（12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、0.4%甘油）；温度：37°C；转速：220 rpm；抗生素：50 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL氯霉素
2.2 蛋白表达与体外生物催化体系
当OD₆₀₀达到约0.6时，用0.1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组菌株，然后在25°C、220 rpm条件下培养16小时。细胞在5000 rpm、4°C离心10分钟收集，重悬于磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）中。使用SCIENTZ-IID超声波细胞粉碎仪（120 W，工作3秒间歇5秒，共10分钟）在冰水浴中制备粗酶液。
TYDC的体外生物催化体系包含2 mM酪氨酸（底物）、2 mM磷酸吡哆醛（PLP，辅因子）和TYDC粗酶液，终体积调至1 mL。MwDβH、DmTβH和AlDβH的催化体系包含2 mM酪胺（底物）、各2 mM的Cu²⁺、L-抗坏血酸和富马酸（辅因子）以及粗酶液，在50 mL离心管中终体积调至3 mL。特别地，MwDβH、DmTβH和AlDβH催化的反应在需氧条件下进行。hPNMT的反应体系与TYDC类似，但以章鱼胺和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）替代酪氨酸和PLP。所有反应在37°C、220 rpm振荡条件下进行。MwDβH、DmTβH、AlDβH和hPNMT的反应通过加入等体积甲醇终止，而TYDC反应通过加入半体积6 M HCl终止。
蛋白表达分析时，超声处理后收集30 μL等分作为全细胞（WC）样品。离心后，再取30 μL上清液（SN）作为上清样品。弃去剩余上清液，沉淀用PBS洗涤后重悬于970 μL PBS中，取30 μL等分作为沉淀（P）样品。蛋白表达水平通过SDS-PAGE分析。
【数据】诱导剂：0.1 mM IPTG；诱导条件：OD₆₀₀≈0.6，25°C，220 rpm，16 h；离心：5000 rpm，4°C，10 min；超声破碎：120 W，3 s/5 s间歇，10 min；TYDC体系：2 mM酪氨酸+2 mM PLP，终体积1 mL；DβH体系：2 mM酪胺+2 mM Cu²⁺+2 mM L-抗坏血酸+2 mM富马酸，终体积3 mL；hPNMT体系：2 mM章鱼胺+2 mM SAM；反应条件：37°C，220 rpm；终止：等体积甲醇或半体积6 M HCl
2.3 辛弗林发酵
菌株先在LB培养基中培养。随后，将1%（v/v）的培养物转接至新鲜LB培养基作为种子培养，生长12小时。之后，将10%（v/v）的种子培养物转接至含27 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中。发酵培养基含2.675 g/L NH₄Cl、0.3 g/L K₂HPO₄·3H₂O、0.11 g/L MgCl₂·6H₂O、0.05 g/L K₂SO₄、2.925 g/L NaCl、8.37 g/L MOPS、0.72 g/L Trisine、0.055 g/L CaCl₂、0.0028 g/L FeSO₄·3H₂O、1.0 g/L酵母提取物、30 g/L葡萄糖和1 mL TES（微量元素溶液）。TES由3.7 × 10⁻³ mg/L (NH₄)₆M₇O₂₄·4H₂O、2.5 × 10⁻² mg/L H₃BO₃、7.13 × 10⁻³ mg/L CoCl₂·6H₂O、1.0 × 10⁻² mg/L MnCl₂和1.614 × 10⁻³ mg/L ZnSO₄组成。37°C培养8小时后，用0.1 mM IPTG诱导细胞。同时向发酵液中添加0.5 mM CuSO₄·5H₂O、0.1 mM PLP、1 mM甲硫氨酸、4 mM富马酸和0.1 mM L-抗坏血酸，随后立即将温度降至30°C进行辛弗林生产。10 g/L CaCO₃用作pH缓冲剂。
补料分批发酵时，将15%的过夜培养种子培养物接种至初始葡萄糖浓度为7.5 g/L的5 L生物反应器中。第一阶段培养在37°C、350 rpm条件下进行，用5 M氢氧化钠溶液维持pH 6.5，溶氧水平保持在约40%。进入对数生长期后，向发酵液中加入0.1 M IPTG诱导细胞，同时添加0.5 mM CuSO₄·5H₂O、0.1 mM PLP、2 mM甲硫氨酸、4 mM富马酸和0.1 mM L-抗坏血酸。同时将发酵温度降至30°C进行辛弗林生产。含500 g/L葡萄糖和10 g/L酵母提取物的补料溶液被补入发酵液以维持底物供应。
【数据】摇瓶发酵：接种量1%（种子）+10%（发酵）；培养基组分：2.675 g/L NH₄Cl、0.3 g/L K₂HPO₄·3H₂O、0.11 g/L MgCl₂·6H₂O、0.05 g/L K₂SO₄、2.925 g/L NaCl、8.37 g/L MOPS、0.72 g/L Trisine、0.055 g/L CaCl₂、0.0028 g/L FeSO₄·3H₂O、1.0 g/L酵母提取物、30 g/L葡萄糖；诱导：0.1 mM IPTG，37°C培养8 h后；添加剂：0.5 mM CuSO₄·5H₂O、0.1 mM PLP、1 mM甲硫氨酸、4 mM富马酸、0.1 mM L-抗坏血酸；生产温度：30°C；pH缓冲：10 g/L CaCO₃；5-L发酵罐：接种量15%，初始葡萄糖7.5 g/L，37°C，350 rpm，pH 6.5（5 M NaOH），溶氧≈40%，诱导剂0.1 M IPTG，补料500 g/L葡萄糖+10 g/L酵母提取物
2.4 分析方法
细胞光密度（600 nm）使用紫外分光光度计（T6，普析，中国北京）测定。葡萄糖浓度通过3,5-二硝基水杨酸法测定。酪氨酸、酪胺、章鱼胺和辛弗林的浓度通过高效液相色谱（HPLC）（Shimadzu LC-16，岛津公司，日本）分析，配备LP-C18色谱柱（4.6 × 250 mm，5 μm，WELCH，中国上海），柱温30°C，紫外检测波长275 nm，进样量10 μL。流动相A为含0.1%（v/v）七氟丁酸的去离子水，流动相B为乙腈。梯度洗脱流速1 mL/min，程序如下：流动相B在0–8分钟内从8%线性升至12%，12–35分钟从12%升至27%，35–36分钟从27%升至60%，随后在60%保持3分钟。之后在1分钟内从60%线性降至8%，并在8%保持13分钟。酪胺、章鱼胺和辛弗林通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）在西南大学分析测试中心鉴定。体外生物催化获得的辛弗林通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表征其构型。MwDβH、DmTβH和AlDβH的结构域和结构使用PSIPRED Workbench（https://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和Swiss Model同源建模分析。DmTβH-酪胺和t86DmTβH-酪胺复合物结构由AlphaFold3预测，并用PyMOL可视化和分析。
【数据】HPLC条件：LP-C18柱（4.6 × 250 mm，5 μm），30°C，UV 275 nm，进样10 μL，流速1 mL/min，梯度洗脱（8%→12%→27%→60%→8%乙腈）
研究结果
3.1 酪胺、章鱼胺和辛弗林的体外生物合成
辛弗林从酪氨酸开始的生物合成涉及三个酶促步骤：酪氨酸首先被酪氨酸脱羧酶（TYDC）转化为酪胺，然后被多巴胺β-单加氧酶（DβH）转化为章鱼胺，最后被苯乙醇胺N-甲基转移酶（PNMT）转化为辛弗林（图1A）。来自克莱奥帕特拉橘的TYDC、来自宫川早生橘的MwDβH和来自人的hPNMT这三种酶在大肠杆菌Rosetta中分别表达。SDS-PAGE分析显示，三种酶都仅表现出有限的可溶性表达（见补充材料）。与麦芽糖结合蛋白（MBP）等增溶标签融合已被证明可以提高蛋白表达水平。当MBP作为TYDC、MwDβH和hPNMT的融合伴侣时，三种酶均成功获得可溶形式。
为确认功能性酶表达，分别以酪氨酸、酪胺和章鱼胺为底物进行了独立的生物催化反应。如预期所料，相应的产物——酪胺、章鱼胺和辛弗林——分别在各自的反应中通过LC-MS或LC-MS/MS检测到（见补充材料）。TYDC和hPNMT表现出高水平的蛋白表达和催化活性，底物转化高效（图1B、C及补充材料）。相比之下，MwDβH的蛋白表达水平和催化活性相对较低，章鱼胺仅能通过串联质谱检测到（见补充材料）。使用TrxA和XXA等替代融合伴侣提高溶解性的尝试效果不如MBP（数据未显示）。MwDβH的结构分析揭示了一个长的跨膜结构域（见补充材料），这可能是其溶解性差的原因。酶的可溶性直接影响催化性能。
辛弗林的构型通过FT-IR表征。814 cm⁻¹处的峰归属于苯环的对位取代，表明对位氢被羟基取代（见补充材料）。这一结果证实反应混合物中获得的辛弗林为对位辛弗林，且催化合成未改变苯环上羟基的位置。
【数据】TYDC和hPNMT：高表达、高催化活性；MwDβH：低表达、低催化活性，含长跨膜结构域；FT-IR特征峰：814 cm⁻¹（苯环对位取代）；产物确证：p-辛弗林
3.2 大肠杆菌中辛弗林从头生物合成通路的建立
迄今为止，关于辛弗林生物合成的研究仍然很少。仅有一项研究描述了利用表达酪胺β-羟化酶（TβH）和苯乙醇胺N-甲基转移酶（PNMT）的大肠杆菌粗裂解液通过体外生物催化生产辛弗林。然而，尚无辛弗林从头生物合成的报道。为填补这一空白，我们设计了大肠杆菌中的从头合成通路（图2），使用酪氨酸过量生产菌株大肠杆菌BAK11。为生产辛弗林，将编码TYDC、hPNMT和MwDβH的基因克隆到pET28a中。所得重组质粒转化至BAK11，生成工程菌株BS01。
与以酪氨酸为终产物的亲本菌株BAK11相比，BS01以葡萄糖为唯一碳源时产生了0.5 g/L酪氨酸、3.8 g/L酪胺和14.2 mg/L辛弗林（见补充材料）。BS01中辛弗林的产生通过LC-MS分析确认（见补充材料）。结果表明，来源于葡萄糖的大部分酪氨酸被TYDC转化为酪胺，而由酪胺形成的任何章鱼胺都被迅速甲基化为辛弗林。然而，仍有大量酪胺未被利用，且章鱼胺未被检测到。单质粒与双质粒系统携带三种酶的菌株之间辛弗林滴度无显著差异（见补充材料）。因此，后续实验采用双质粒系统。
鉴于MwDβH的低表达水平和低催化活性，评估了两种替代β-羟化酶——来自黑腹果蝇的DmTβH和来自蜡蚧轮枝菌的AlDβH。如图3所示，表达DmTβH的菌株产生的辛弗林量与表达MwDβH的菌株相近，而表达AlDβH的菌株产量显著更低。由β-羟化酶催化的酪氨酸向章鱼胺的转化被广泛认为是章鱼胺生物合成中的限速步骤。总体而言，这些结果证明了在微生物宿主中成功实现了辛弗林的从头生物合成。
【数据】BS01产量：0.5 g/L酪氨酸、3.8 g/L酪胺、14.2 mg/L辛弗林；碳源：葡萄糖（唯一）；单/双质粒系统：无显著差异；DmTβH菌株≈MwDβH菌株；AlDβH菌株显著更低
3.3 羟化酶截短以增强辛弗林生产
使用PSIPRED Workbench和Swiss-Model分析了MwDβH、DmTβH和AlDβH的结构域和结构（见补充材料）。结果显示三种酶均含有 intrinsically disordered regions（内在无序区域）。为解决辛弗林生物合成通路中的限速步骤从而提高产量，我们尝试截短无序结构以促进β-羟化酶的功能性表达。同源建模显示MwDβH具有一个C末端跨膜结构域，抗坏血酸结合于此（见补充材料）。已有研究表明，DβH或TβH催化酪胺向章鱼胺的转化依赖于抗坏血酸、铜离子（Cu²⁺）、分子氧和pH。抗坏血酸作为生理还原剂，定期还原酶中的铜中心。鉴于这种结构和功能上的依赖性，截短MwDβH不太可能增强辛弗林产量。
相比之下，基于PSIPRED Workbench的预测对DmTβH和AlDβH进行了截短。DmTβH在N末端A86位点被截短，产生变体t86DmTβH。AlDβH在N末端和C末端均被截短，产生t32AlDβH、t39AlDβH、t544AlDβH和t582AlDβH构建体。这些变体被分别导入已表达TYDC和hPNMT的菌株中，产生相应的菌株BS-t86DmTβH、BS-t32AlDβH、BS-t39AlDβH、BS-t544AlDβH和BS-t582AlDβH。
如图4A和B所示，BS-t86DmTβH产生了47.8 mg/L辛弗林，较BS-DmTβH提高了2.7倍。在AlDβH突变体中，t32AlDβH、t544AlDβH和t582AlDβH分别产生了14.0 mg/L、17.7 mg/L和14.7 mg/L辛弗林，较BS-AlDβH分别提高了1.1倍、1.4倍和1.2倍。然而，所有AlDβH衍生菌株的产量均低于BS-DmTβH。因此，选择BS-t86DmTβH进行后续辛弗林生产。
为深入研究BS-t86DmTβH较BS-DmTβH辛弗林产量提高的原因，我们使用AlphaFold3预测了DmTβH-酪胺和t86DmTβH-酪胺的酶-底物复合物结构。N末端86个氨基酸的截短显著提高了辛弗林滴度，提示该区域尽管远离催化中心，但可能通过构象效应调节酶活性。如图4C所示，截短前，酪胺在结合口袋中与Q459、E315和Y540形成三点氢键网络，距离分别为2.8、3.3和2.9 Å，提供强的多点锚定。相比之下，截短后仅保留了与Q残基的一个强氢键（2.5 Å），而其他相互作用显著减弱（>4 Å），表明从多点稳定模式转变为单点主导的定位模式。此外，酪胺与Cu²⁺之间的距离从7.1 Å缩短至6.1 Å。
【数据】BS-t86DmTβH：47.8 mg/L辛弗林，较BS-DmTβH提高2.7倍；t32AlDβH：14.0 mg/L（1.1倍）；t544AlDβH：17.7 mg/L（1.4倍）；t582AlDβH：14.7 mg/L（1.2倍）；氢键距离：截短前Q459 2.8 Å、E315 3.3 Å、Y540 2.9 Å；截短后Q残基2.5 Å，其余>4 Å；酪胺-Cu²⁺距离：7.1 Å→6.1 Å
讨论与解读
本研究在大肠杆菌中成功建立了辛弗林的从头生物合成通路。首先通过体外生物催化成功合成了酪胺、章鱼胺和辛弗林。随后将辛弗林合成通路导入产酪氨酸的大肠杆菌BAK11菌株，实现了以葡萄糖为底物的辛弗林从头合成，滴度为14.2 mg/L。为提高产量，对β-羟化酶进行了筛选和工程改造，获得携带截短变体β-羟化酶的菌株（BS-t86DmTβH），辛弗林滴度达47.8 mg/L，较初始菌株（BS-DmTβH）提高2.7倍。在补料分批发酵中，以葡萄糖为唯一碳源，辛弗林产量达到88.1 mg/L。总体而言，本研究提出了一个从可再生生物质原料从头生物合成辛弗林的微生物发酵平台。
【编译者解读】本研究是辛弗林微生物从头合成的首次报道，意义在于绕开了植物提取的天然丰度瓶颈，为这类苯乙醇胺类生物碱提供了可放大的生物制造路线。方法上的亮点在于系统性的酶筛选与截短策略——针对限速的β-羟化酶，不是盲目改造，而是先做结构域预测再精准截短，AlphaFold3给出的底物结合模式变化为产量提升提供了结构解释。值得注意的是，88.1 mg/L的绝对产量仍偏低，距离工业化尚有距离；且MwDβH因跨膜结构域导致的溶解性问题未能解决，仅靠替代酶绕行。后续若能在羟化酶可溶性表达和辅因子再生上突破，产量有望进一步提升。
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135438