来源：Development and application of a highly specific whole-cell biosensor for supersulfide detection in environmental samples（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
过硫化物是一类零价或单价负价态硫化合物，在生物系统、环境硫循环和锂硫电池中发挥关键作用，但其活性强、结构复杂，精准定量长期是分析化学的难题。本研究首次报道了基于农杆菌BigR抑制子（AtBigR）的全细胞生物传感器（AtBigR-WCB），该系统对过硫化物具有极佳选择性，对H₂S、硫代硫酸盐和谷胱甘肽几乎无响应。经系统优化后，传感器背景泄漏极低、灵敏度达微摩尔级，并成功应用于海洋沉积物和锂硫电池电解液中过硫化物的定量检测。
研究背景
过硫化物包括含有链状硫原子的化合物，涵盖无机多硫化物（HSSₙH，n≥2）、有机多硫化物（RSSₙH，n≥2）以及通常以环八硫（S₈）形式存在的元素硫。在环境系统中，过硫化物是硫循环的关键中间体，在海洋沉积物和低氧区域尤为丰富，由微生物和化学硫转化过程产生，其中细菌是沉积物中过硫化物生成的主要贡献者。这些化合物根据氧的可利用性，被硫氧化细菌氧化或被硫还原细菌还原。S₈是环境系统中占主导地位且热力学最稳定的过硫化物形式，具有多种生物活性，传统上在农业中用作杀虫剂和土壤pH调节剂。然而，由于过硫化物反应活性高且结构复杂，其准确定量仍是分析化学领域的挑战。本研究旨在开发一种基于过硫化物感应抑制子的全细胞生物传感器，实现对环境样本中过硫化物的特异性检测。
研究方法
2.1 菌株、质粒和化学试剂
菌株和质粒列于表S3。大肠杆菌BW3KD用于质粒构建。大肠杆菌BL21（DE3）、MG1655、Nissle 1917和BW25113作为mKate表达的宿主菌。大肠杆菌菌株在LB培养基中培养，需要时添加卡那霉素（50 μg/mL）。硫氢化钠（NaHS）、硫粉、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、半胱氨酸、硫代硫酸盐（Na₂S₂O₃）、亚硫酸盐（Na₂SO₃）、二酰胺、DTT、mBBr（单溴二胺）和阿拉伯糖购自Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特）。其余化学品购自Sangon Biotech（中国上海）。
【数据】培养基：LB；抗生素：卡那霉素 50 μg/mL；试剂来源：Sigma-Aldrich、Sangon Biotech
2.2 DNA操作
用于扩增DNA片段的引物见表S4，附模板和用途。质粒构建采用TEDA方法。使用改良的KCM转化方法制备的感受态细胞用于转化完整质粒或DNA克隆混合物。铜绿假单胞菌的mexR（PamexR）、大肠杆菌的marR（EcmarR）、地衣芽孢杆菌的yrkD（BlyrkD）、天蓝色链霉菌的csoR（SccsoR）和金黄色葡萄球菌的mgrA（SamgrA）从其基因组DNA扩增获得。荚膜红杆菌的sqrR（RcsqrR）、鲍曼不动杆菌的bigR（AbbigR）、农杆菌的bigR（AtbigR）和金黄色葡萄球菌的cstR（SacstR）经密码子优化后由北京基因组研究所（BGI，北京）合成。这九个抑制子基因（命名为R）克隆到pBBR1MCS-2中，受组成型PlacUV5启动子控制，mkate基因置于其同源启动子（PR）控制下，构建pMCS2-PlacUV5-R-PR-mkate质粒。此外，mkate基因单独整合到pBBR1MCS-2中，受九个同源启动子控制，构建pMCS2-PR-mkate质粒。采用RBS工程和启动子工程优化控制AtbigR表达的RBS强度和启动子强度。使用RBS Calculator工具设计具有确定强度的RBS序列。具有确定强度的启动子取自先前报道。用选定的启动子序列和RBS序列通过TEDA克隆替换pMCS2-PlacUV5-AtbigR-P_AtBigR-mKate中AtBigR基因对应的序列。在相同质粒骨架上选择不同调控系统控制mkate基因表达，包括阿拉伯糖诱导启动子、Lac启动子或受LacI调控的Trc启动子。ParaC-araC-PBAD操纵子片段从pKD46质粒扩增，克隆到pMCS2-PlacUV5-AtbigR-P_AtBigR-mkate中替换PlacUV5-AtbigR-P_AtBigR区域，获得pMCS2-ParaC-araC-PBAD-mkate。PlacI-lacI-Plac操纵子和PlacI-lacI-Ptrc分别从MG1655基因组和pTrc99a扩增，以类似方式克隆生成pMCS2-PlacI-lacI-Plac-mkate和pMCS2-PlacI-lacI-Ptrc-mkate。
【数据】宿主菌：E. coli BW3KD、BL21(DE3)、MG1655、Nissle 1917、BW25113；质粒骨架：pBBR1MCS-2；基因来源：9种抑制子基因；构建方法：TEDA克隆
2.3 不同过硫化物的制备
将过量S₈溶解于纯丙酮或乙醇中，37°C静置2天，获得饱和丙酮溶解S₈或乙醇溶解S₈。制备H₂Sₙ时，将20 mL MilliQ水用氩气吹扫20分钟以排尽空气。然后快速加入0.0256 g升华硫粉、0.0448 g NaHS和0.032 g NaOH至厌氧水中，立即密封瓶子。溶液混合器在37°C放置2天，直至溶液变为亮黄色。在手套箱中，将20 mL厌氧处理的10 mM KPi缓冲液（磷酸钾缓冲液，pH 7.0，含200 mM NaCl和1 mM EDTA）与0.245 g氧化型谷胱甘肽和0.112 g NaSH混合。含混合物的瓶子立即密封，置于30°C 30分钟，直至溶液变为浅黄色GSnH溶液。采用经典热氰醇解测定法定量这些溶液中的过硫化物含量。
【数据】S₈溶解：丙酮或乙醇，37°C，2天；H₂Sₙ制备：0.0256 g硫粉+0.0448 g NaHS+0.032 g NaOH，厌氧水20 mL，37°C，2天；GSnH制备：0.245 g GSSG+0.112 g NaSH，10 mM KPi缓冲液（pH 7.0，200 mM NaCl，1 mM EDTA），30°C，30 min
2.4 Li₂S₆正极电解液的制备
Li₂S₆正极电解液通过将Li₂S和硫粉以1:5的摩尔比加入二乙二醇二甲醚（DME）和1,3-二氧戊环（DOL）（v:v = 1:1）中制备，随后在50°C下剧烈磁力搅拌约24小时。Li₂S₆正极电解液的浓度为0.2 M [S]。
【数据】Li₂S:S摩尔比=1:5；溶剂：DME:DOL=1:1；温度：50°C；时间：24h；浓度：0.2 M [S]
2.5 过硫化物感应生物传感器的荧光分析
携带过硫化物感应调控因子的菌株在LB培养基中37°C振荡培养至OD₆₀₀为0.6–0.8。如无特别说明，将不同浓度的诱导剂直接加入培养物中。诱导剂包括H₂Sₙ、GSnH、S₈、GSSG、NaHS、半胱氨酸、硫代硫酸盐、二酰胺和H₂O₂。在37°C孵育2小时诱导mKate表达后，将0.1 mL培养物直接转移或经PBS洗涤重悬后转移至96孔板，使用酶标仪（Synergy H1，Biotek，美国）测量细胞密度和红色荧光。荧光强度测量时，激发波长（Ex）设为588 nm，发射波长（Em）设为633 nm。荧光数据归一化至OD₆₀₀为1。
【数据】培养温度：37°C；OD₆₀₀：0.6–0.8；诱导时间：2h；检测体积：0.1 mL；Ex/Em：588/633 nm
2.6 海洋沉积物过硫化物提取和溶解的优化
过硫化物在海洋沉积物中以多种形式存在，但这些沉积物在水性环境中通常溶解度较低。考虑到过硫化物可溶于乙醇溶液，研究尝试将海洋沉积物与乙醇混合以促进过硫化物溶解。将1 g湿重海洋沉积物与不同体积的乙醇混合，孵育过夜。随后测定乙醇和孔隙水混合溶液中的过硫化物含量，以优化乙醇用量。
【数据】沉积物用量：1 g湿重；提取溶剂：乙醇；孵育时间：过夜
2.7 海洋沉积物中过硫化物的检测方法
采用两种已知方法检测过硫化物，作为全细胞生物传感器测定的参考。第一种方法利用热氰醇解测定法定量系统中的过硫化物含量。第二种方法依赖新开发的SO₃²⁻依赖性单溴二胺（mBBr）衍生化方法，测量系统中过硫化物的形成。对于S₈分析，将三氟甲磺酸甲酯（v/v = 1:30）加入用乙醇从海洋沉积物中提取的样品中。三氟甲磺酸甲酯用于将H₂Sₙ转化为二甲基多硫化物，并使S₈溶解在乙醇溶解的海洋沉积物中。二甲基多硫化物和S₈均可通过带紫外检测的HPLC检测。
【数据】衍生化试剂：mBBr；甲基化试剂：三氟甲磺酸甲酯（v/v=1:30）；检测方法：HPLC-UV
2.8 生物信息学分析
系统发育分析中，PaMexR（Gene ID: 877857）、EcMarR（Gene ID: 945825）、BlYrkD（Gene ID: 937650）、ScCsoR（UniProt ID: Q9RD62）、SaMgrA（Gene ID: 66838978）、RcSqrR（UniProt ID: D5AT91）、AbBigR（UniProt ID: V5VFD0）、AtBigR（UniProt ID: Q8UAA8）、XfBigR（UniProt ID: Q9PFB1）和SacstR（UniProt ID: Q2FVV2）的蛋白序列从UniProt数据库收集。使用MUSCLE算法对这些候选序列进行多序列比对，系统发育树分析使用MEGA X程序的最大似然法构建，运行配对删除、p-距离分布和1000次重复的自举分析。RcSqrR、AbSqrR、XfBigR和AtBigR的多序列比对通过EMBL-EBI网站上的Clustal Omega程序分析。ESPript 3.0用于序列比对的可视化。
【数据】系统发育分析：MEGA X，最大似然法，1000次自举；多序列比对：MUSCLE、Clustal Omega
研究结果
3.1 用于生物传感器构建的过硫化物感应转录因子的筛选
从不同蛋白家族中选择了九个可能感应过硫化物的抑制子基因（记为R），构建到中等拷贝质粒pBBR1MCS-2中（图1）。这些基因分别置于组成型lacUV5启动子（PlacUV5-R）控制下，而其同源启动子（PR）以相反转录方向克隆在PlacUV5旁边（图2A）。具有相同核糖体结合位点的mkate基因（PR-mkate）置于PR控制下。该簇命名为"PlacUV5-R-PR-mkate"。作为对照，从PlacUV5-R-PR-mkate中去除PlacUV5-R获得"PR-mkate"，允许mKate组成型表达。携带PlacUV5-R-PR-mkate或PR-mkate的质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中生成WCB。WCB-PlacUV5-R-PR-mkate在抑制状态下观察到的荧光强度（FI）为R的基础泄漏，而WCB-PR-mkate组成型表达下检测到的FI为最大表达水平。这两个值的比值为最大诱导系数。金黄色葡萄球菌CstR（SaCstR）、农杆菌BigR（AtBigR）和大肠杆菌MarR（EcMarR）的最大诱导系数大于20倍，排名前三（图2B）。因此，对它们进行进一步测试。当携带AtBigR、SaCstR和EcMarR的WCB细胞制备成PBS（磷酸盐缓冲液）中的静息细胞时，它们对不同浓度（100、200、400和600 μM）的丙酮溶解S₈的诱导没有响应（图S1）。然而，在LB培养基中直接诱导时，它们对诱导有响应。携带AtBigR的WCB在S₈浓度高于400 μM时被诱导，FI值在2小时内达到峰值（图2C）。400 μM S₈时的诱导系数约为12.7倍（图2C），远低于其最大值584.0倍（图2B）。结果表明，AtBigR抑制的启动子仅被部分诱导。携带SaCstR的生物传感器在限定条件下未被诱导（图2C）。受EcMarR控制的mKate表达泄漏随孵育时间增加（图2C），表明该传感器是自诱导的，且与细胞生长相关。总之，AtBigR有潜力开发为WCB，但需要优化。
【数据】最大诱导系数排名：SaCstR、AtBigR、EcMarR >20倍；AtBigR最大诱导系数：584.0倍；400 μM S₈诱导系数：12.7倍；S₈浓度阈值：>400 μM；诱导峰值时间：2h
3.2 AtBigR生物传感器的优化
通过系统减弱bigR基因上游lacI来源的核糖体结合位点（RBS）来降低AtBigR表达。RBS Calculator预测原始序列的强度为1600人工单位（au），据此设计了一系列计算强度为10至1000 au（10、30、50、70、90、100和1000 au）的合成RBS变体。RBS强度≤30 au导致AtBigR产量不足，无法有效抑制PR-mkate表达，导致基础mKate水平升高。虽然这些构建体在诱导后显示荧光增加（图2D），但高背景接近组成型表达的PbigR启动子（图2B）。因此，诱导系数为3.4倍或更低（图2D）。另一方面，RBS强度50至1000 au足以产生足够的抑制子来抑制mKate的泄漏表达并被S₈诱导。其中，RBS强度100 au给出最佳诱导系数147。研究还尝试用转录效率较低的启动子替换PlacUV5。强度降低的启动子导致更高的泄漏表达，而PlacUV5在更高诱导系数方面仍表现最佳（图2E）。在后续研究中，使用AtBigR基因前含RBS强度100 au的AtBigR-WCB。
【数据】原始RBS强度：1600 au；设计RBS强度范围：10–1000 au；RBS≤30 au诱导系数：≤3.4倍；最佳RBS强度：100 au，诱导系数147
3.3 操作参数的优化
经过测试获得优化程序。AtBigR-WCB细胞在LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.6–0.8。将1 mL对数期细胞分装到5 mL管中，用过硫化物诱导2小时。取100 μL诱导细胞，用PBS洗涤一次，使用酶标仪测量荧光强度（FI）和OD₆₀₀。当诱导FI值最高且诱导系数最佳为382.4时，酶标仪的增益值为150（图2F）。FI测量前用PBS洗涤和重悬有效降低了检测期间的背景FI（图2G）。过硫化物检测期间增加WCB体积与容器体积的比例降低了mKate的泄漏表达（图2H）。诱导后2小时观察到最大荧光响应（图2I）。所有后续实验均在优化条件下进行，包括2小时诱导期，以确保结果的一致性和可比性。测试WCB细胞的OD₆₀₀高于0.8显著损害过硫化物检测（图S2A）。储存方面，含15%甘油的LB培养基中的AtBigR-WCB细胞在−80°C保存6个月，其FI响应水平与新鲜细胞相比维持在约70%（图S2B）。此外，与初始测试相同（图S1），AtBigR-WCB在新鲜LB培养基中重悬时工作良好，在PBS缓冲液中重悬时不工作，在含1%葡萄糖的PBS中重悬时仅部分工作（图S2C）。因此，AtBigR-WCB需要充足的营养物质来产生mKate。
【数据】最佳增益值：150；最佳诱导系数：382.4；最佳诱导时间：2h；OD₆₀₀上限：0.8；储存条件：15%甘油，−80°C，6个月，响应维持~70%
3.4 优化后AtBigR-WCB的特异性和灵敏度
AtBigR-WCB对H₂S、SO₃²⁻、S₂O₃²⁻、S₄O₆²⁻、Cys、氧化型谷胱甘肽（GSSG）和H₂O₂无响应（图3A），但对三种过硫化物种类有响应：H₂Sₙ、GSnH和丙酮溶解S₈。这里，在选择性测定中特意使用0.4 mM的较高浓度，以放大任何潜在的弱或非特异性响应，并允许不同硫种类之间进行清晰的定性比较。这并不影响生物传感器的定量灵敏度和特异性，其严格在验证的线性响应范围内评估（图3B–D）。AtBigR-WCB对S₈的剂量响应在两个不同范围内呈线性：5–20 μM和20–600 μM（图3B）。对H₂Sₙ的响应更灵敏，也跨越两个区间：1–10 μM和10–100 μM（图3C）。对GSnH的响应与S₈和H₂Sₙ不同，仅在200至600 μM之间形成线性范围，灵敏度降低（图3D）。AtBigR-WCB细胞对H₂Sₙ的检测限在低微摩尔范围（1–5 μM），与过硫化物检测的精密分析方法相比具有竞争力（表S1）。虽然一些荧光探针和色谱方法提供更高的灵敏度，但AtBigR-WCB在特异性、简单性、成本效益和环境样本兼容性方面具有明显优势。为阐明AtBigR对过硫化物特异性响应的机制，对已知过硫化物感应调控因子进行了系统发育分析（图S3A）。AtBigR与RcSqrR聚集在一个独特的分支中。此外，序列比对表明两种蛋白都具有对过硫化物感应至关重要的保守半胱氨酸残基（图S3B）。RcSqrR二聚体的晶体结构显示，暴露于过硫化物诱导两个半胱氨酸残基之间形成四硫键，这种修饰降低了RcSqrR对其靶启动子的亲和力。使用AlphaFold 2.0的结构预测显示，AtBigR二聚体采用与RcSqrR相似的构象（图S3C）。这些结构相似性表明AtBigR可能作为特异性过硫化物传感器，类似于RcSqrR。
【数据】非响应物质：H₂S、SO₃²⁻、S₂O₃²⁻、S₄O₆²⁻、Cys、GSSG、H₂O₂；S₈线性范围：5–20 μM和20–600 μM；H₂Sₙ线性范围：1–10 μM和10–100 μM；GSnH线性范围：200–600 μM；H₂Sₙ检测限：1–5 μM
3.5 AtBigR系统可作为大肠杆菌中的新型诱导系统
AtBigR在大肠杆菌BL21（DE3）中的调控特性与…
【数据】原文未详述
3.6 海洋沉积物中过硫化物的检测
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究成功构建了AtBigR-WCB用于过硫化物的特异性检测。在评估的九个已知抑制子中，AtBigR在S₈孵育后表现出最高的诱导系数，成为最合适的候选者。通过系统优化RBS强度和启动子架构，实现了背景泄漏可忽略、诱导系数超过三个数量级的生物传感器，能够检测低微摩尔水平的过硫化物，与已有分析方法相当。AtBigR-WCB的特异性代表了过硫化物检测的重要进展——该生物传感器选择性响应多种过硫化物形式（S₈、H₂Sₙ和GSnH），而对H₂S、SO₃²⁻、S₂O₃²⁻、S₄O₆²⁻、半胱氨酸、GSSG和H₂O₂无响应。此外，在LB培养基中直接检测免去了大量样品预处理的需要，这对现场监测和快速检测场景是有价值的优势。AtBigR-WCB的高特异性可能源于其与RcSqrR的结构相似性——RcSqrR中过硫化物感应通过保守半胱氨酸残基之间形成四硫键实现，AtBigR与RcSqrR的结构相似性提示了类似的感应机制。
编译者解读
本文的亮点在于将细菌天然的过硫化物感应调控因子转化为可编程的全细胞生物传感器，并完成了从元件表征、参数优化到实际环境样本验证的完整闭环。选择AtBigR而非其他抑制子，体现了基于系统发育和结构信息进行元件筛选的策略价值。RBS理性设计与启动子工程联用，将诱导系数从12.7倍提升至382.4倍，这一优化路径对同类生物传感器的开发具有直接借鉴意义。值得注意的是，该传感器对GSnH的灵敏度明显低于S₈和H₂Sₙ，未来若需检测有机多硫化物，仍需进一步蛋白工程改造。将AtBigR调控系统本身视为一种低泄漏的新型基因调控模块，也为合成生物学提供了新的可诱导表达工具。
参考来源
期刊：Biosensors and Bioelectronics, 2025
DOI: 10.1016/j.bios.2025.117731
DOI: 10.1016/j.bios.2025.117731