来源：Enhancement of thermostability and expression level of Rasamsonia emersonii lipase in Pichia pastoris and its application in biodiesel production in a continuous flow reactor（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
酸性脂肪酶LIPR因强甲醇耐受性在生物柴油合成中潜力巨大，但其热稳定性差、在毕赤酵母中表达水平低，制约了工业应用。本研究通过二硫键工程与ΔΔG计算理性设计，获得热稳定性显著提升的突变体；再经信号肽优化、分子伴侣共表达、基因敲除与过表达的组合策略，将酶活推至13,620 U/mL。连续流反应器将生物柴油产率在3小时内提升至73.6%，展示了工程脂肪酶的工业化前景。
研究背景
脂肪酶（EC 3.1.1.3）属于α/β水解酶家族，催化脂质底物水解为脂肪酸、甘油及甘油单酯和二酯。凭借显著的催化效率和环境友好性，脂肪酶在食品、医药、造纸、皮革和能源等领域应用广泛。然而，脂肪酶自身缺陷常限制其工业适用性，热稳定性不足是公认短板。脂肪酶催化速率随温度呈指数增长直至蛋白变性，因此高热稳定性是决定酶法工业过程效能的关键因素。除挖掘天然高稳定性新酶外，理性设计提升酶热稳定性始终是研究者核心目标之一。二硫键作为蛋白质关键结构稳定因子，通过在目标蛋白中合理引入新二硫键可显著增强酶热稳定性。近年来，二硫键预测工具发展迅速，其中Disulfide by Design 2.0（DbD2）是常用的网络软件。
研究方法
2.1 载体、菌株与试剂
编码野生型脂肪酶LIPR（XM_013468123.1）的基因经合成后插入pPIC9K，构建表达质粒pPIC9K/LIPR，方法同前所述。质粒pPICZA用于分子伴侣表达。大肠杆菌Top 10用于基因克隆，毕赤酵母GS115作为LIPR表达宿主。LA Taq DNA聚合酶、限制性内切酶及In-Fusion PCR克隆试剂盒购自TaKaRa（大连）。所有化学试剂购自Aladdin（上海）、Sangon Biotech（上海）及Sigma（圣路易斯）。所有生化试剂均为分析纯或更高等级。
【数据】菌株：E. coli Top 10、P. pastoris GS115；试剂来源：TaKaRa、Aladdin、Sangon Biotech、Sigma；试剂等级：分析纯及以上
2.2 二硫键设计与菌株构建
利用DbD2软件模拟LIPR结构（PDB ID: 6UNV），将所有氨基酸位点突变为半胱氨酸，并计算每对残基的χ3扭矩角差及Cα-Cβ-Sλ差值。初步预测出30个潜在二硫键突变体。随后用YASARA软件分析LIPR结构，排除催化中心8 Å范围内及lid结构上的潜在二硫键，并剔除结构中明显不合理的突变体。最终筛选出14个潜在二硫键突变体。所有二硫键突变体构建方法一致：以我们前期研究优化了Mss信号肽的质粒pPIC9K/Mss-LIPR为模板，根据二硫键突变位点设计引物扩增目标基因；随后用BamHI和NotI双酶切质粒pPIC9K，利用In-Fusion PCR克隆试剂盒与目标基因进行同源重组，生成二硫键突变质粒；通过电转化将突变质粒转入毕赤酵母GS115，获得携带二硫键突变的重组菌株。构建二硫键突变体所用引物列于表S1。
【数据】预测突变体数：30个；筛选后突变体数：14个；排除范围：催化中心8 Å内及lid结构；限制酶：BamHI、NotI；转化方式：电转化
2.3 基于ΔΔG的氨基酸位点突变设计与菌株构建
将LIPR结构数据（PDB ID: 6UNV）输入PoPMuSiC在线软件，预测LIPR中任意氨基酸残基突变引起的ΔΔG变化。剔除结构不合理的突变体后，筛选出35个潜在突变体。以二硫键突变质粒pPIC9K/Mss-LIPR/A126C-P238C为模板，根据氨基酸突变位点设计引物扩增目标基因。质粒pPIC9K经EcoRI和NotI双酶切，利用In-Fusion PCR克隆试剂盒与目标基因同源重组，生成氨基酸位点突变质粒。突变质粒经电转化导入毕赤酵母GS115，获得氨基酸位点突变重组菌株。其他氨基酸位点突变菌株构建程序相同，引物详见表S1。
【数据】预测突变体数：35个；模板质粒：pPIC9K/Mss-LIPR/A126C-P238C；限制酶：EcoRI、NotI；转化方式：电转化
2.4 重组优化菌株的构建
根据我们前期研究结果，采用组合优化策略进一步提升重组酵母菌株的表达水平。以引物PDI-F和PDI-R从毕赤酵母GS115基因组中扩增分子伴侣PDI（CAC33588.1）片段。质粒pPICZA经BamHI和NotI双酶切，将分子伴侣PDI片段连接至pPICZA，构建重组质粒pPICZA-PDI。最后通过电转化获得共表达PDI的重组菌株。构建CRISPR/Cas9表达质粒时，利用网络软件设计20 bp的sgRNA片段用于基因组靶向。构建质粒pGAPZA/Cas9-sgRNA VPS10-01用于敲除VPS10-01（CP014716.1）基因。在VPS10-01基因敲除基础上，将DAS2（FJ752552.1）基因与供体DNA片段DNA Vps10-01融合，构建过表达DAS2的重组菌株。
【数据】PDI基因编号：CAC33588.1；VPS10-01基因编号：CP014716.1；DAS2基因编号：FJ752552.1；sgRNA长度：20 bp；限制酶：BamHI、NotI；转化方式：电转化
2.5 LIPR表达与纯化
LIPR表达在摇瓶培养中按系列步骤进行。首先，将重组菌株接种至YPD培养基，30°C培养12 h。随后，取2 mL细胞悬浮液转接至50 mL BMGY培养基。待OD600达到20时收集细胞，用无菌水洗涤两次，转入50 mL BMMY培养基，每24 h添加1%（v/v）甲醇在28°C下诱导表达。通过SDS-PAGE分析上清液评估LIPR表达情况，并相应测定酶活。高密度发酵在5 L生物反应器中进行，使用富集限定培养基（RDM）。发酵条件及溶氧（DO）控制方法与前期研究一致。发酵期间每24 h取样，分析总蛋白含量、细胞干重（DCW）和LIPR酶活。高密度发酵结束后，使用截留分子量10 kDa的超滤管浓缩上清液。随后用截留分子量14 kDa的透析袋透析粗酶样品，再用冷冻干燥机冻干，于−20°C保存。
【数据】YPD培养温度：30°C；时间：12 h；接种量：2 mL/50 mL；BMGY培养基；诱导OD600：20；BMMY培养基；甲醇浓度：1%（v/v）；诱导温度：28°C；诱导间隔：24 h；发酵罐：5 L；培养基：RDM；超滤截留：10 kDa；透析截留：14 kDa；保存温度：−20°C
2.6 检测方法
野生型（WT）及突变体LIPR酶活采用pH-Stat法测定，以橄榄油为底物，40°C、pH 4.0条件下进行。一个酶活单位（U）定义为每分钟释放1 μmol脂肪酸所需的酶量。总蛋白浓度采用Bradford法测定。LIPR半衰期按前期方法测定。
【数据】测定方法：pH-Stat法；底物：橄榄油；温度：40°C；pH：4.0；酶活单位定义：1 μmol脂肪酸/min；蛋白定量：Bradford法
2.7 热稳定性测定
野生型及突变体LIPR的热稳定性通过将酶在柠檬酸-磷酸缓冲液（50 mM，pH 4.0）中、不同温度（35°C–55°C）下预孵育3 h进行评估。随后在40°C、pH 4.0条件下以橄榄油为底物测定LIPR残余酶活。初始酶活设为100%，残余酶活以相对于初始酶活的百分比表示。
【数据】缓冲液：柠檬酸-磷酸缓冲液（50 mM，pH 4.0）；温度范围：35°C–55°C；预孵育时间：3 h；测定条件：40°C、pH 4.0；底物：橄榄油
2.8 动力学参数测定
野生型及突变体LIPR的催化转换数（kcat）、米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）以4-硝基苯基棕榈酸酯为底物、浓度范围0.1–0.60 mM测定，采用Zhang等所述的光度测定法。动力学参数（kcat、Km、kcat/Km、Vmax）由Lineweaver-Burk双倒数图计算得出。
【数据】底物：4-硝基苯基棕榈酸酯；浓度范围：0.1–0.60 mM；计算方法：Lineweaver-Burk图
2.9 酶固定化
LIPR固定化采用LXTE-1000树脂（Sunresin，西安），按制造商方案操作。树脂以0.2 M磷酸盐缓冲液洗涤，随后按40 mg酶与1 g树脂的比例混合，在反应器中20°C、80 rpm孵育18 h。反应结束后，固定化酶以0.5 M NaCl缓冲液洗涤，用抽滤装置去除多余水分。固定化酶活采用pH-Stat法测定。
【数据】树脂：LXTE-1000；洗涤缓冲液：0.2 M磷酸盐缓冲液；酶与树脂比：40 mg/g；温度：20°C；转速：80 rpm；时间：18 h；洗涤：0.5 M NaCl缓冲液
2.10 连续流系统中生物柴油生产
在我们设计的连续流反应器中，固定化酶填充于夹套色谱柱（10 × 200 mm，瑞达恒辉，北京）的内腔，外腔通过水浴循环恒温水。反应底物橄榄油和甲醇溶于己烷中，引入反应系统。
【数据】反应器：夹套色谱柱（10 × 200 mm）；固定化酶填充：内腔；控温：水浴循环；底物：橄榄油、甲醇；溶剂：己烷
研究结果
3.1 二硫键突变提升LIPR热稳定性
前期研究表明，LIPR具有强甲醇耐受性但热稳定性差，制约了其工业应用，尤其在生物柴油合成领域。二硫键工程在提升脂肪酶热稳定性方面显示出潜力。本研究通过DbD2软件计算，鉴定出30个潜在二硫键突变位点。排除催化三联体、lid区域及氧阴离子洞等关键区域8 Å范围内的潜在二硫键，并经突变体结构分析剔除明显不合理的结构后，仅保留14个可行二硫键突变体（表S2）。随后，以优化了Mss信号肽的亲本菌株GS02（GS115/Mss-LIPR）为出发菌株，构建了14个二硫键突变菌株。酶活测定显示，4个突变体（A51C-S110C、A126C-P238C、A131C-A140C和S255C-V261C）的酶活优于野生型菌株（GS02），如图1A所示。为整合有益突变，进一步测定这4个突变体LIPR的热稳定性（图1B）。其中，突变体A126C-P238C热稳定性最高，55°C孵育3 h后保留45%的原始酶活，显著优于野生型酶（28%酶活保留率）。野生型酶在55°C下半衰期仅101 min，而突变体A126C-P238C酶半衰期为166 min（图S1）。此外，突变体A126C-P238C酶活达810 U/mL，超过野生型菌株（GS02）。虽然通常认为有益的二硫键突变不一定增强酶活，但已有报道表明适当的二硫键突变可同时提升酶活和热稳定性。鉴于菌株GS08（即菌株GS115/Mss-LIPR/A126C-P238C）展现出最佳的酶活-热稳定性平衡，选择其作为氨基酸位点突变的出发菌株。
二硫键在降低熵、增加酶分子刚性方面发挥关键作用，是酶结构稳定的重要因素。向酶分子引入二硫键可显著增强稳定性，而二硫键的丢失则导致蛋白稳定性下降。然而，并非所有引入的二硫键都有助于酶稳定性。研究表明，天然存在的二硫键主要位于酶内部近外表面区域，该区域形成有益二硫键的概率最高。我们的发现支持这一论断——三维结构分析（图2）显示，LIPR中天然二硫键（C53-C300、C67-C72和C135-C138）和引入的有益二硫键突变（C126-C238）均位于酶表面附近。此外，LIPR三维结构分析表明，引入二硫键突变（A126C-P238C）未破坏主要键，而是增加了氢键数量，从而增强LIPR稳定性。
【数据】预测二硫键位点：30个；筛选后突变体：14个；高酶活突变体：4个（A51C-S110C、A126C-P238C、A131C-A140C、S255C-V261C）；A126C-P238C 55°C 3 h残余酶活：45%；WT残余酶活：28%；WT半衰期：101 min（55°C）；A126C-P238C半衰期：166 min（55°C）；A126C-P238C酶活：810 U/mL
3.2 氨基酸位点突变提升LIPR热稳定性
预测热稳定性的计算算法中，蛋白去折叠吉布斯自由能变化（ΔΔG）是主流方法。基于蛋白分子结构，分析全面氨基酸位点突变引起的ΔΔG变化。当ΔΔG为负值时，分子结构趋于稳定，热稳定性增加。本研究利用PoPMuSiC软件预测LIPR氨基酸位点突变引起的ΔΔG变化，筛选出539个潜在突变体。排除位于催化中心和lid结构等关键区域的突变，同时剔除结构明显不合理的突变体，最终选出35个氨基酸位点突变体（表S3）。随后，以二硫键突变菌株GS08为出发菌株构建35个氨基酸位点突变菌株。评估氨基酸位点突变菌株的酶活（图3A），发现3个突变体（E58G、N196V和D214L）酶活优于二硫键突变体（A126C-P238C）。进一步测定35个突变菌株的热稳定性，其中4个突变体（E139L、D198L、D214L和E250L）的热稳定性优于A126C-P238C（图3B）。突变体E250L热稳定性最高，但其酶活732 U/mL仍低于A126C-P238C。相比之下，突变体D214L酶活达885 U/mL，55°C预孵育3 h后保留58%的原始酶活。此外，突变体D214L酶在55°C下半衰期为215 min，远高于A126C-P238C（图S1，GS08-LIPR）。值得注意的是，与A126C-P238C相比，突变体D214L的酶活和热稳定性均显著提升（图3）。尝试组合多个有益氨基酸位点突变反而导致酶活和热稳定性下降而非增强（数据未显示）。鉴于工业应用需要酶活与热稳定性的平衡表现，选择携带D214L氨基酸位点突变的菌株GS46（菌株GS115/Mss-LIPR/A126C-P238C/D214L）进行后续研究。
以LIPR晶体结构（PDB ID: 6UNV）为模板，利用PyMOL软件进行分子结构观察与分析。如图4A所示，展示了LIPR催化中心和lid结构的位置，以及4个有益氨基酸位点突变（E139L、D198L、D214L和E250L）的分布。由于这4个氨基酸位点突变远离重要催化位点，推测这些突变对酶活影响极小，突变体酶活测定结果证实了这一推断（图3A）。疏水堆积构成疏水残基间的非共价相互作用，主要通过调节蛋白构象驱动蛋白折叠，对蛋白稳定性有重要贡献。本研究中，D214L突变增强LIPR热稳定性可通过疏水相互作用来解释。如图4B所示，D214L突变将亲水性天冬氨酸（D）替换为疏水性亮氨酸（L），促进与周围疏水残基侧链（包括A211/L212/A213/F215/I216）形成疏水接触。因此，D214L突变使疏水区域堆积更紧密，放大疏水相互作用效应并增加氢键数量，从而增强LIPR热稳定性。
【数据】PoPMuSiC预测突变体：539个；筛选后突变体：35个；高酶活突变体：3个（E58G、N196V、D214L）；高稳定性突变体：4个（E139L、D198L、D214L、E250L）；E250L酶活：732 U/mL；D214L酶活：885 U/mL；D214L 55°C 3 h残余酶活：58%；D214L半衰期：215 min（55°C）
3.3 组合优化策略提升LIPR表达
虽然已有多种策略探索提升毕赤酵母GS115的表达水平，但多数方法聚焦于单因素或双因素优化，对重组菌株表达水平的提升有限。在我们前期研究中，通过采用Mss信号肽、共表达分子伴侣PDI和敲除VPS10-01基因，获得了组合优化菌株GS115/Mss-PDI-LIP（原文此处截断，后续内容未提供）。
【数据】优化策略：Mss信号肽、PDI共表达、VPS10-01敲除（原文此处截断，后续数据未详述）
讨论与解读
本研究通过理性设计成功鉴定出二硫键突变菌株GS08，获得热稳定性和脂肪酶活性双重提升。随后通过计算折叠自由能变化（ΔΔG），经氨基酸位点向疏水性氨基酸突变，获得热稳定性和酶活显著提升的突变菌株GS46。为实现LIPR在毕赤酵母GS115中的高效表达，实施了一系列优化措施，包括采用Mss信号肽、共表达分子伴侣PDI、敲除VPS10-01基因及过表达DAS2基因。最终，组合优化突变菌株GS54在5 L生物反应器中高密度发酵，酶活达到13,620 U/mL。后续结果证明了LIPR在生物柴油合成中的适用性，突变体GS54-LIPR展现出增强的产率。虽然GS54-LIPR的生物柴油产率较优化前提升4.3倍，但与已报道脂肪酶相比仍存在差距，可能归因于其对中长碳链底物的亲和力不足。此外，采用连续流系统介导的反应进一步将GS54-LIPR的产率提升至73.6%。本研究不仅为酶优化提供了新见解，也为连续流生物柴油生产提供了高效可重复使用的生物催化剂。
【编译者解读】该研究展示了理性设计在脂肪酶工程中的系统化应用——从二硫键定位到ΔΔG筛选，再到分泌途径的多靶点组合优化，逻辑链条清晰完整。值得注意的是，D214L突变通过疏水堆积增强稳定性的机制阐释，为同类酶的稳定性改造提供了可迁移的设计思路。连续流反应器将产率从摇瓶的52.2%提升至73.6%，体现了过程工程与蛋白工程协同的价值。局限在于，突变组合的叠加效应并非线性累加，部分组合反而削弱性能，提示未来可借助机器学习优化多突变协同策略。
参考来源
Wang B. Enhancement of thermostability and expression level of Rasamsonia emersonii lipase in Pichia pastoris and its application in biodiesel production in a continuous flow reactor. International Journal of Biological Macromolecules, 2024. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.134481
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.134481