来源：Biosensor-driven evolution of oxidoreductive pathway for efficient tagatose production by Saccharomyces cerevisiae（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
D-塔格糖是一种低热量稀有糖，具有多种促进健康的生理功能。本研究以酿酒酵母为底盘宿主，建立基于内源GAL调控系统的荧光高通量筛选平台，对氧化还原途径关键酶木糖还原酶SsXR进行定向进化，获得F128M-Q219K双突变体。结合基因筛选、启动子工程与辅因子工程等代谢工程策略，最终工程菌株在5 L生物反应器中D-塔格糖产量达44.61 g/L，为目前该途径报道的最高产量。
研究背景
D-塔格糖甜度约为蔗糖的92%，热量仅1.5 kcal/g，是食品工业极具前景的替代甜味剂。安全性方面，D-塔格糖已获美国FDA的GRAS认证，并于2014年被中国国家卫生计生委批准为新食品原料。生理功能研究表明，D-塔格糖通过抑制致龋菌生长和减少热量摄入发挥防龋和减肥功效，同时还能调节餐后血糖水平、改善肠道菌群组成。作为一种自然界中稀有的功能性单糖，塔格糖的工业化生产主要依赖人工合成。早期化学合成法涉及半乳糖在碱性条件下的异构化，但因副产物多、分离困难及环境污染等问题，已基本被更环保的生物合成路线取代。基于异构酶的转化途径受热力学平衡限制，而新兴的氧化还原途径可克服这一瓶颈。然而，现有氧化还原途径生物合成系统普遍存在关键途径酶活性不足、缺乏高通量筛选方法等问题，难以满足工业生产需求。
研究方法
2.1 菌株、培养基与试剂
大肠杆菌DH5α用于基因克隆和质粒扩增。酿酒酵母BY4741作为D-塔格糖生产的宿主菌。含50 μg/mL卡那霉素（Kana）或100 μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）用于培养携带重组pCEV-G1-Km、pCEV-G1-Ph和pUMRI质粒的大肠杆菌。YPD培养基（20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖）、YPDG培养基（20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、60 g/L葡萄糖、5 g/L半乳糖）添加200 μg/mL Geneticin（G418）和/或60 μg/mL Phleomycin（Ble）用于工程酵母的筛选和培养。SD-FOA培养基（1.7 g/L无氨基酸酵母氮源、5 g/L无水硫酸铵、100 mL/L 10× dropout溶液、2 g/L葡萄糖、0.1% w/v 5-氟乳清酸）用于筛选KanMX-URA-PRB322ori标记已切除的酵母菌株。培养基成分、抗生素及其他试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。PrimeSTAR DNA聚合酶和DpnI消化酶购自TaKaRa（大连），同源重组酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
【数据】LB培养基：10 g/L胰蛋白胨+5 g/L酵母提取物+10 g/L NaCl；Kana：50 μg/mL；Amp：100 μg/mL；YPD：20 g/L胰蛋白胨+10 g/L酵母提取物+20 g/L葡萄糖；YPDG：20 g/L胰蛋白胨+10 g/L酵母提取物+60 g/L葡萄糖+5 g/L半乳糖；G418：200 μg/mL；Ble：60 μg/mL；SD-FOA：1.7 g/L YNB+5 g/L硫酸铵+100 mL/L 10×dropout+2 g/L葡萄糖+0.1% w/v 5-FOA
2.2 基因、质粒及质粒构建
所有基因序列经密码子优化后由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。共获得5个候选木糖还原酶（XR）和5个候选半乳糖醇脱氢酶（GDH）酶源，分别为SsXR（UniProt ID: P31867）、SgXR（UniProt ID: A0A173DUJ9）、ScXR（UniProt ID: P38715）、AnXR（UniProt ID: Q9P8R5）、AoXR（UniProt ID: Q2UKD0）、RlGDH（UniProt ID: Q1MLL4）、RoGDH（UniProt ID: A0A7L5BLH5）、AfGDH（UniProt ID: A9CES4）、RrGDH（UniProt ID: A0A546XM76）和AsGDH（UniProt ID: A0A9X3ZA10）。NOX（UniProt ID: A2RIB7）来源于乳酸乳球菌，AOX（UniProt ID: A0A8H7Z1U6）来源于荚膜组织胞浆菌。其余基因通过PCR从酿酒酵母基因组扩增获得。质粒构建使用One-Step Cloning Kit（Vazyme）。本研究所用质粒和引物分别列于表S1和表S2。编码XR和GDH的基因片段依次克隆到pCEV-G1-Km载体中，生成pCKm-XR-GDH质粒。以pCKm-SsXR opt-RrGDH opt质粒为载体，从BY4741基因组扩增HXT7、ACT1、TEF2、TDH1和TDH3启动子DNA片段，通过一步克隆法替换载体中的原始启动子，构建启动子替换质粒。通过将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入pCEV-G1-Ph载体中P GAL启动子下游，构建pCPh-P GAL-GFP质粒。将NOX和AOX基因分别插入pUMRI-A-ΔDPP1载体P TEF1启动子下游，得到pUMRI-A-ΔDPP1-P TEF1-NOX和pUMRI-A-ΔDPP1-P TEF1-AOX质粒。同样，将POS5和ZWF1基因分别插入pUMRI-A-ΔLPP1载体P TEF1启动子下游，得到pUMRI-A-ΔLPP1-P TEF1-POS5和pUMRI-A-ΔLPP1-P TEF1-ZWF1质粒。
【数据】XR候选酶源：5个；GDH候选酶源：5个；NOX来源：乳酸乳球菌；AOX来源：荚膜组织胞浆菌；启动子：HXT7、ACT1、TEF2、TDH1、TDH3
2.3 工程酿酒酵母菌株的构建
酵母转化采用改良电穿孔法。通过同源重组在BY4741中敲除GAL1基因，获得工程菌株YXCY-001。YXCY-030由YXCY-001通过原位互补LEU、URA和MET基因构建。将pUMRI-A-ΔDPP1-P TEF1-NOX、pUMRI-A-ΔDPP1-P TEF1-AOX、pUMRI-A-ΔLPP1-P TEF1-POS5和pUMRI-A-ΔLPP1-P TEF1-ZWF1质粒用SfiI线性化后，通过电穿孔整合到YXCY-030基因组中，分别获得重组菌株YXCY-034、YXCY-035、YXCY-036和YXCY-037。其余pCKm和pCPh质粒通过电穿孔法导入工程菌株。本研究使用的主要酵母菌株详细信息见表S3。
【数据】敲除基因：GAL1；线性化酶：SfiI；转化方法：电穿孔；菌株：YXCY-001、YXCY-030、YXCY-034、YXCY-035、YXCY-036、YXCY-037
2.4 分子对接分析
以SsXR晶体结构（PDB ID: 5Z6T）为受体，半乳糖（从PubChem数据库获取）为配体，使用AutoDock 4.2软件进行分子对接。具体流程如下：将受体和配体导入AutoDock 4.2，去除受体中的结晶水分子，添加极性氢原子，处理后结构导出为PDBQT文件；构建对接盒子，确保包络催化活性位点的氨基酸残基；运行软件，单次运行获得10个对接构象，根据氢键、结合能和空间匹配度选择最优构象；使用PyMOL软件可视化最优结果并分析配体与受体活性位点之间的相互作用。
【数据】受体：SsXR（PDB ID: 5Z6T）；配体：半乳糖；软件：AutoDock 4.2；对接构象数：10个/次
2.5 序列比对与底物通道分析
氨基酸序列比对使用Clustal X软件，比对结果用在线工具ESPript 3.0可视化。底物通道分析使用CAVER Analyst 2.0.1软件完成。以半乳糖与SsXR的对接中心为起点，选择通道周围5 Å范围内的氨基酸残基。排除保守残基后，这些残基作为后续突变位点筛选的候选区域。
【数据】通道分析范围：5 Å；软件：CAVER Analyst 2.0.1、Clustal X、ESPript 3.0
2.6 NNK突变文库构建
使用NNK简并密码子在选定残基处进行饱和突变，以pCKm-SsXR opt-P HXT7-RrGDH opt质粒为模板进行PCR。PCR产物与限制性内切酶DpnI孵育以消化甲基化模板。纯化的PCR产物随后转化至YXCY-016。野生型和突变体的核苷酸序列见补充材料表S4。
【数据】突变方式：NNK饱和突变；模板：pCKm-SsXR opt-P HXT7-RrGDH opt；宿主菌：YXCY-016；DpnI消化甲基化模板
2.7 摇瓶、48孔板和5 L生物反应器培养
摇瓶发酵：酵母菌株在5 mL YPD培养基中预培养16-18小时。随后以2%（v/v）接种量转接至含20 g/L半乳糖的20 mL YPD培养基中。30°C、220 rpm振荡培养至120小时。在指定时间间隔取样测定D-塔格糖产量。
48孔板培养：酵母种子液以5%（v/v）接种比接种至1 mL YPDG培养基中，30°C、220 rpm振荡培养48小时。
5 L生物反应器发酵：挑取单菌落接种至含200 μg/mL G418的5 mL YPD培养基中过夜培养。然后以2%（v/v）接种量转接至100 mL YPD培养基（200 μg/mL G418）中培养10-12小时至OD600达到8-10。所得种子培养液接种至含2 L YPD培养基（20 g/L半乳糖）的5 L生物反应器中。根据发酵状态间歇补充半乳糖。发酵条件为30°C、通气量1-4 vvm、搅拌速度100-900 rpm、pH控制在5.5。
【数据】摇瓶预培养：5 mL YPD、16-18 h；接种量：2%（v/v）；培养基：20 mL YPD+20 g/L半乳糖；温度：30°C；转速：220 rpm；时间：120 h；48孔板接种比：5%（v/v）；培养基：1 mL YPDG；时间：48 h；5 L反应器：2 L YPD+20 g/L半乳糖；通气量：1-4 vvm；搅拌：100-900 rpm；pH：5.5；OD600：8-10
2.8 D-塔格糖的HPLC定量
取1 mL发酵液在10,000×g离心10分钟，收集上清液进行高效液相色谱（HPLC）分析。上清液用三氯乙酸（TCA）脱蛋白后，经0.22 μm亲水膜过滤。使用配备VG-50色谱柱和Refractive Index检测器的Waters e2695 HPLC系统定量D-塔格糖。
【数据】离心：10,000×g、10 min；滤膜：0.22 μm；HPLC系统：Waters e2695；色谱柱：VG-50；检测器：示差折光检测器
研究结果
3.1 新型氧化还原酶的挖掘与筛选
塔格糖两步法生物合成的现有研究依赖的氧化还原酶库有限，严重制约了生产效率的进一步提高和工业化规模的扩大。为筛选催化性能更优的氧化还原酶并突破现有酶源对塔格糖生物合成系统优化的限制，本研究基于已报道的相关氧化还原酶编码基因序列开展了系统筛选。利用UniProt数据库中的同源蛋白序列，鉴定出5个候选木糖还原酶和5个候选半乳糖醇脱氢酶：SsXR、SgXR、ScXR、AnXR、AoXR、RlGDH、RoGDH、AfGDH、RrGDH和AsGDH。上述基因两两组合并整合至pCEV-G1-Km质粒中。
酿酒酵母中的GAL1基因编码半乳糖激酶，催化酵母中半乳糖同化Leloir途径的第一步。本研究以D-半乳糖为发酵底物。由于酿酒酵母天然具有吸收和代谢D-半乳糖的能力，通过同源重组技术敲除了半乳糖竞争性代谢途径的关键基因GAL1，使更多半乳糖流向目标产物D-塔格糖（图2A）。验证结果显示，GAL1缺失菌株YXCY-001在葡萄糖培养基中表现出良好的生长特性，但在半乳糖培养基中无法正常生长，表明竞争性半乳糖代谢途径已被有效阻断。该敲除策略有效减少了竞争性代谢流，确保底物优先分流至目标生物合成途径。
将上述构建的10个质粒转化至工程菌株YXCY-001进行异源表达，以20 g/L半乳糖为底物进行48小时发酵验证。在测试菌株中，菌株YXCY-003已被报道为塔格糖氧化还原途径中摇瓶产量最高的菌株。然而，本实验中菌株YXCY-002未能重现先前文献报道的高塔格糖产量。如图2B所示，SsXR-RrGDH氧化还原酶组合获得了最高塔格糖产量，其异源表达的两个关键酶基因来自不同微生物：木糖还原酶基因SsXR来源于树干毕赤酵母，半乳糖醇脱氢酶基因RrGDH来源于放射根瘤菌。值得注意的是，RrGDH作为新来源的半乳糖醇脱氢酶，首次在酿酒酵母介导的D-塔格糖生物合成系统中应用。该菌株在发酵48小时后最大D-塔格糖产量达3.02 g/L。这一结果证实了RrGDH在D-塔格糖合成中的应用潜力，为后续工艺优化奠定了基础。
【数据】候选XR：5个（SsXR、SgXR、ScXR、AnXR、AoXR）；候选GDH：5个（RlGDH、RoGDH、AfGDH、RrGDH、AsGDH）；底物：20 g/L半乳糖；发酵时间：48 h；最高产量：3.02 g/L（SsXR-RrGDH组合）；SsXR来源：树干毕赤酵母；RrGDH来源：放射根瘤菌
3.2 启动子工程
如图2B所示，YXCY-003菌株在48小时发酵后积累了大量的中间产物半乳糖醇。这一发现表明下游半乳糖醇脱氢酶基因的表达受限，进而限制了其催化功能。本研究中，半乳糖醇脱氢酶基因RrGDH的表达受P PGK1启动子调控。据此推测，P PGK1启动子的表达能力有限是限制D-塔格糖产量进一步提高的关键瓶颈。
为克服这一限制，选取5个不同来源的强启动子（P HXT7、P ACT1、P TEF2、P TDH1、P TDH3）替换原始P PGK1启动子。发酵结果如图3所示。携带不同启动子的菌株之间塔格糖产量差异显著。其中，以P HXT7启动子构建的重组菌株YXCY-011表现最优。该菌株在48小时发酵后D-塔格糖产量达3.88 g/L，比初始菌株YXCY-003提高了28.48%。这一结果证实，在酵母中高表达的强启动子能为D-塔格糖的高效合成提供稳定的转录支持，有效减少中间产物的积累。此外，菌株YXCY-011的48小时发酵液中中间产物半乳糖醇积累量为0.85 g/L，比菌株YXCY-003显著降低了37.65%。在该发酵条件下，上游底物半乳糖维持较高浓度，下游产物塔格糖达到较高产量，中间产物半乳糖醇处于显著低浓度。基于这些结果，木糖还原酶SsXR被确定为塔格糖两步氧化还原生物合成途径的限速酶。因此，该酶被选为蛋白质工程的核心靶标，随后通过半理性设计策略提高其催化效率。
【数据】候选启动子：5个（P HXT7、P ACT1、P TEF2、P TDH1、P TDH3）；YXCY-011产量：3.88 g/L（48 h）；提升幅度：28.48%；半乳糖醇积累：0.85 g/L；半乳糖醇降低：37.65%；限速酶：SsXR
3.3 荧光高通量筛选系统的建立
高通量筛选技术能够快速识别优良酶突变体，为酶的定向改造提供支持。本研究建立了稳定高效的木糖还原酶SsXR定向进化高通量筛选方法，以进一步提高塔格糖产量。
酿酒酵母中存在天然的GAL调控系统。当葡萄糖和半乳糖共存且葡萄糖浓度较高时，SNF1激酶失活，MIG1蛋白抑制P GAL启动子的转录活性。当葡萄糖接近耗尽时，半乳糖可特异性诱导P GAL启动子的激活并驱动下游基因的表达。基于酿酒酵母中P GAL对半乳糖的特异性响应，本研究建立了间接测定D-塔格糖产量的荧光高通量筛选方法（图4A）。筛选原理如下：绿色荧光信号的强度与底物D-半乳糖的剩余量正相关，间接反映产物D-塔格糖的产量。生长早期，酿酒酵母优先利用葡萄糖作为碳源支持生长、发育和繁殖。此阶段P GAL启动子保持抑制状态，菌株不产生荧光。作为塔格糖生物合成底物的半乳糖在此期间同时被酵母细胞消耗，用于体内塔格糖合成。生长中期，当葡萄糖浓度降至低水平时，半乳糖可特异性激活P GAL启动子，进而驱动绿色荧光蛋白（GFP）基因的高效表达，使菌株产生明显荧光。生长后期，不同氧化还原酶对半乳糖催化消耗速率的差异导致菌株FLU/OD600值出现显著差异。具体而言，氧化还原酶活性越高，半乳糖消耗越多，塔格糖积累越多，荧光强度越弱。反之，氧化还原酶活性越低，半乳糖消耗越少，塔格糖积累越少，荧光强度越强。
将P GAL启动子与GFP报告基因串联整合至pCEV-G1-Ph表达质粒中，转化至宿主菌BY4741，成功构建筛选菌株YXCY-016。首先评估了不同半乳糖结构类似物对筛选菌株的干扰。
【数据】筛选原理：荧光强度与半乳糖剩余量正相关；宿主菌：BY4741；筛选菌株：YXCY-016；报告基因：GFP；启动子：P GAL
3.4 SsXR的分子工程
（注：此部分原文在节选材料中未完整呈现，以下根据可获取的原文内容翻译）
通过半理性设计策略对SsXR进行分子改造。分子对接分析显示，SsXR与半乳糖的结合涉及催化四联体残基His-Tyr-Lys-Asp，NADPH作为辅因子参与氢负离子转移。基于序列比对和底物通道分析，在通道周围5 Å范围内筛选非保守残基作为突变候选位点。通过NNK饱和突变构建突变文库，利用建立的荧光高通量筛选系统对突变文库进行筛选，获得F128M-Q219K双突变体。该突变体在筛选菌株中塔格糖产量比野生型提高了93.08%。
【数据】突变体：F128M-Q219K；产量提升：93.08%；催化四联体：His-Tyr-Lys-Asp；辅因子：NADPH
3.5 工程菌株的塔格糖生产
通过氨基酸补充和辅因子工程策略进一步优化工程菌株。YXCY-033为氨基酸补充菌株，YXCY-038、YXCY-039、YXCY-040和YXCY-041分别为染色体整合NOX、AOX、POS5和ZWF1基因构建的辅因子工程菌株。经48小时发酵评估各菌株D-塔格糖产量。最终工程菌株在5 L生物反应器中D-塔格糖产量达44.61 g/L。
【数据】菌株：YXCY-033（氨基酸补充）、YXCY-038（NOX）、YXCY-039（AOX）、YXCY-040（POS5）、YXCY-041（ZWF1）；发酵时间：48 h；最终产量：44.61 g/L（5 L生物反应器）
讨论与解读
本研究通过将蛋白质工程与代谢工程相结合，在酿酒酵母中成功构建了高效的D-塔格糖氧化还原生物合成途径。关键突破在于建立了基于酵母内源GAL调控系统的高通量筛选方法，实现了木糖还原酶SsXR的定向进化。此外，引入并功能表达了新型半乳糖醇脱氢酶RrGDH，并通过启动子工程和氨基酸补充策略优化了途径通量。最终工程菌株在5 L生物反应器中D-塔格糖产量达44.61 g/L，为目前氧化还原途径生产塔格糖的最高报道产量。F128M-Q219K突变体赋予的塔格糖产量提升已得到实验验证，其分子基础有待进一步研究。这项工作不仅为基于氧化还原的塔格糖合成提供了可扩展的酶工程和筛选策略，也为利用传感器引导方法进行生物系统优化提供了范式。未来工业化生产可进一步优化发酵参数如溶氧和补料策略，底盘菌株也可改造以利用乳糖等低成本底物，增强该生物合成路线的经济竞争力和稳健性。
编译者解读
本研究最值得称道之处在于将生物传感器理念嵌入酶定向进化流程——利用酵母内源GAL调控系统构建荧光筛选平台，绕过了塔格糖缺乏直接检测手段的瓶颈，使突变文库筛选从"海选"变为"精筛"。F128M-Q219K双突变体93.08%的产量提升幅度也印证了这一策略的有效性。从应用角度看，44.61 g/L的产量虽为当前氧化还原途径最高水平，但与异构酶路线相比仍有差距，且5 L反应器的放大数据尚需在更大规模验证。RrGDH作为新酶源的引入提示我们，扩展酶工具箱仍是提升途径性能的可行路径。后续若能在辅因子再生与底物谱拓宽方面持续优化，该路线有望进一步逼近工业化门槛。
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109132