来源：Extracellular expression of recombinant bovine lactoferrin in Pichia pastoris with enhanced activity and a thermostability analysis for food application（Food Research International）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
牛乳铁蛋白（bLF）是 dairy 行业最昂贵的原料成分，天然产量低（0.5 g/L）且纯化流程冗长。本研究在毕赤酵母 KM71-H 菌株中实现了重组牛乳铁蛋白（rbLF）的胞外分泌表达，系统比较了其与商业来源乳铁蛋白（cbLF）的抗菌活性、铁结合能力及热稳定性。结果显示，rbLF 对革兰氏阳性菌的抗菌活性优于 cbLF，铁(III)结合能力显著增强（p ≤ 0.0001），两者在 90°C 处理 5 分钟后均完全丧失抗菌活性。该表达平台为食品工业提供了成本效益更高的乳铁蛋白生产路径。
研究背景
铁是人体必需的微量元素，摄入不足会导致缺铁性贫血（IDA），表现为认知功能受损和疲劳。IDA 困扰着全球 25% 的人口，多数病例集中在发展中国家。食品工业通过开发铁强化食品应对这一挑战，但最常用的硫酸亚铁载体存在高铁氧化、胃肠不适和异味等问题。因此，需要寻找更优且成本可控的铁递送载体。
牛乳铁蛋白是一种 80 kDa 的铁结合糖蛋白，具有强铁(III)螯合位点（Kd ∼ 10⁻²⁰ M），正成为乳品工业最受欢迎的原料之一。十二指肠中的乳铁蛋白受体能显著增强膳食铁的生物利用率。此外，bLF 对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抗菌作用，有助于减少富铁环境中肠道菌群过度生长引起的胃肠不适。然而，天然 bLF 产量低、纯化成本高，限制了其广泛应用。本研究旨在通过毕赤酵母胞外表达系统，建立一条简单高效的重组牛乳铁蛋白生产工艺。
研究方法
2.1 材料
National, Inc.（美国威斯康星州菲奇堡）提供 cbLF（铁含量 >15 mg/100 g）。DH5α 电转感受态细胞购自 New England BioLabs（美国马萨诸塞州伊普斯威奇）。目的基因来源于 Uniprot 序列 P24627，并使用 Twist BioScience 密码子优化工具进行密码子优化。毕赤酵母菌株 KM71-H 来自康奈尔大学 Chris Fromme 博士实验室（美国纽约州伊萨卡）。Zeocin™ 购自 ThermoFisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂和 Luria-Bertani 肉汤（LB）材料购自 Thermo Scientific Inc.。乙腈（HPLC 级）和氢氧化钠购自 Fisher Scientific（美国新罕布什尔州汉普顿）。小鼠抗 His 标签单克隆抗体和抗小鼠 IgG（H + L）-HRP 偶联二抗购自 Bio-Rad Laboratories（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）。Ferrozine 试剂购自 Thermo Fisher Scientific Inc.。
【数据】cbLF 铁含量：>15 mg/100g；菌株：DH5α 电转感受态细胞、毕赤酵母 KM71-H；目的基因来源：Uniprot P24627；试剂供应商：原文详见各条目
2.2 重组牛乳铁蛋白的表达与纯化
将密码子优化的 2067 bp bLF 基因和 C 端 6× 组氨酸标签（His-tag）插入 pPICZαA 骨架的 EcoRI 和 SalI 限制性位点，位于 AOX-1 启动子和终止子之间（S1）。该载体含有 α-因子分泌信号，插入在 BstBI 和 EcoRI 位点之间，促进蛋白质分泌。质粒还含有 Zeocin™ 抗性选择标记。该质粒（pPICZαA-bLF）由 GenScript（美国新泽西州皮斯卡塔韦）设计和合成。
合成后，按照 New England BioLabs 转化方案，通过热激法将质粒转化至感受态大肠杆菌 DH5α 细胞中。转化细胞涂布于含 300 μg/mL Zeocin™ 的 LB 琼脂平板上进行抗生素抗性筛选。按照 New England BioLabs（NEB #M0491）的方案，使用菌落聚合酶链式反应（PCR）筛选菌落。使用 Qiagen 的 QIAprep Spin Miniprep Kit（德国希尔德恩），按照制造商说明进行质粒纯化。通过 Sanger 测序确认质粒成功插入（New England Biolabs, 2013），并使用 Blastn+2.13.0 进行比对（Camacho et al., 2009）。
随后，使用 Invitrogen 的 pichia easycomp™ 转化试剂盒（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德），将确认的质粒转化至毕赤酵母 KM71-H 细胞中。转化子在含 100 μg/mL Zeocin™ 的 YPD 琼脂平板上筛选。采用菌落 PCR 验证质粒在毕赤酵母转化子中的成功整合。转化后随机挑取 5 个菌落进行成功整合筛选以避免假阳性（S2）。确认的酵母转化子在含 100 μg/mL Zeocin 的 YPD 培养基中培养 48 小时。然后以 OD-600 值 0.1–0.2 转接至缓冲甘油复合培养基（BMGY）中培养 24 小时，随后将全部培养物转移至缓冲甲醇复合培养基（BMMY）中培养 96 小时，每 24 小时添加 2 v/v% 甲醇（MeOH）。以上培养均在 28–30°C、摇瓶 200–250 rpm 条件下进行。
培养上清液通过 3500 g 离心 15 分钟收集。随后使用 Cytiva（美国马萨诸塞州马尔伯勒）的 Ni Sepharose High-Performance 组氨酸标签纯化 beads 对上清液进行纯化。上清液与 Ni beads 孵育 12 小时，使组氨酸标签乳铁蛋白结合。孵育后，使用重力过滤过滤上清液，Ni beads 用结合缓冲液（50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、10 mM 咪唑；pH 7.4）洗涤三次。使用 50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl（pH 7.4）中逐步咪唑梯度（100 mM、200 mM、300 mM 和 400 mM）洗脱结合的乳铁蛋白。乳铁蛋白主要在 3×（v/v）200 mM 咪唑浓度洗涤后洗脱（Elute Frac. 1、Elute Frac. 2 和 Elute Frac. 3）。含乳铁蛋白的洗脱级分立即使用 ThermoFisher Scientific 的 Zeba 脱盐柱脱盐，并重悬于 10 mM 磷酸盐缓冲液（pH 5–7）（PBS）中用于热稳定性抗菌分析，或重悬于 milliQ 水（pH 4）中用于铁结合分析。将可识别 rbLF 存在的洗脱液合并，测定最终报告的蛋白质浓度（mg/mL）。所有蛋白质定量均使用 ThermoFisher Scientific 的 NanoDrop One C 微量 UV-Vis 分光光度计，按照制造商说明进行。
【数据】基因长度：2067 bp；His-tag：C 端 6×；限制性位点：EcoRI/SalI（插入）、BstBI/EcoRI（α-因子信号）；Zeocin 浓度：E. coli 筛选 300 μg/mL、P. pastoris 筛选 100 μg/mL；YPD 培养：48h；BMGY 培养：OD-600 0.1–0.2，24h；BMMY 诱导：96h，2 v/v% 甲醇/24h；温度：28–30°C；转速：200–250 rpm；离心：3500 g，15 min；Ni beads 孵育：12h；结合缓冲液：50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、10 mM 咪唑，pH 7.4；洗脱咪唑梯度：100/200/300/400 mM；洗脱缓冲液：50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl，pH 7.4；脱盐后重悬：10 mM PBS（pH 5–7）或 milliQ 水（pH 4）
2.3 表达乳铁蛋白的表征
#### 2.3.1 SDS-PAGE 和 Western blot 分析
使用 eSDS-PAGE（10% 聚丙烯酰胺凝胶）在 Mini-PROTEAN Tetra cell 垂直迷你凝胶电泳系统（Bio-Rad Laboratories）中分析 rbLF 的蛋白质存在和纯度，并使用考马斯亮蓝染色可视化，方案如前所述（Lin et al., 2023）。为鉴定 his 标签蛋白的存在，通过湿转法将 SDS-PAGE 条带转移至硝酸纤维素膜（NM），90 V 转移 1.5 小时（Bio-Rad Laboratories）。NM 在 5%（w/v）脱脂牛奶封闭液中轻轻摇动封闭 1 小时。随后，膜与 Proteintech（美国伊利诺伊州罗斯蒙特）的小鼠抗 His 标签单克隆抗体（1:3000 稀释）在 4°C 孵育过夜。然后用 Tris 缓冲盐水（TBS）洗涤膜三次，室温下与山羊抗小鼠 IgG（H + L）-HRP 偶联二抗（Bio-Rad）（1:5000 稀释）孵育 1 小时。膜用 TBS 洗涤三次，然后用等体积的 SuperSignal West Pico 和化学发光底物（Thermo Scientific）（1:1）洗涤，黑暗中孵育 5 分钟。最后使用 ChemiDoc MP 成像仪（Bio-Rad）对膜成像。
【数据】SDS-PAGE：10% 聚丙烯酰胺凝胶；转膜：湿转，90 V，1.5h；封闭：5% 脱脂牛奶，1h；一抗：小鼠抗 His 标签单克隆抗体，1:3000，4°C 过夜；二抗：山羊抗小鼠 IgG（H + L）-HRP，1:5000，室温 1h；化学发光底物：1:1，暗处 5 min
#### 2.3.2 去糖基化分析
为去除 bLF 糖基化位点的 N-连接寡糖，使用 New England BioLabs 的 PNGase F 酶，在变性条件下按照 NEB 方案（NEB #P0639）去除糖基化产生的残余糖。随后按照第 2.3.1 节所述方案进行 Western Blot 可视化。
【数据】酶：PNGase F（NEB #P0639）；条件：变性条件；检测：Western Blot
#### 2.3.3 抗菌活性分析
根据前期研究，使用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌株来测定 bLF 对革兰氏阳性菌和阴性菌的抗菌活性（Lin et al., 2023）。这些菌株由康奈尔大学动物健康诊断中心（AHDC）从牛粪便中分离。菌株保存在含 20% 甘油的 LB 琼脂培养基中，于 −80°C 储存。LB 肉汤和琼脂培养基均制备后在 121°C 高压灭菌 15 分钟。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在 LB 琼脂培养基上 37°C 培养 24 小时。从培养基中挑取一环纯菌落转接至 10 mL 新鲜 LB 培养基中，37°C 孵育 24 小时，然后在 LB 培养基中再次接种，37°C 再培养 24 小时。随后，将培养物在 LB 培养基中稀释 10,000×、100,000× 和 1,000,000×，以确保菌落落在可计数范围内（30–300 个菌落/平板），并与 rbLF、cbLF 或等体积 PBS（pH 7）作为对照混合。将稀释培养物（50 μL）与等体积样品接种于 LB 琼脂平板培养基中，37°C 孵育 24 小时。作为阴性对照，将 PBS（pH = 7）、未接种的 LB 培养基和含 cbLF/rbLF 的 PBS（pH = 7）各 50 μL 涂布接种，37°C 培养 24 小时，一式两份。24 小时观察细菌生长情况，拍照计数菌落数，然后用以下公式计算菌落形成单位（CFU）：
CFU/mL = 菌落数 /（涂布体积 mL × 总稀释因子）
所有分析均进行三次生物学重复。为分析两者的最低抑菌浓度（MIC），
【数据】菌株：S. aureus、E. coli（牛粪便分离）；保存：LB 琼脂 + 20% 甘油，−80°C；灭菌：121°C，15 min；培养：LB 琼脂 37°C 24h；液体培养：10 mL LB，37°C，24h×2；稀释倍数：10,000×、100,000×、1,000,000×；计数范围：30–300 菌落/平板；涂布量：50 μL；孵育：37°C，24h；阴性对照：PBS（pH 7）、未接种 LB、PBS+cbLF/rbLF，一式两份；生物学重复：3 次
研究结果
3.1 质粒构建与大肠杆菌转化确认
pPICZαA-bLF 质粒成功构建并转化至大肠杆菌 DH5α 细胞中（图1a）。使用靶向 AOX-1 启动子和终止子区域的引物通过菌落 PCR 筛选转化菌落（图1b）。在被筛选的菌落中，5 号菌落在预期大小（2067 bp）处产生强 PCR 条带，对应 bLF 基因（图1c）。选择该菌落用于 5 mL LB 培养基中的进一步放大培养。培养 16 小时后进行质粒提取，纯化的质粒进行 Sanger 测序。测序结果确认构建的质粒以 99% 的序列同源性成功插入大肠杆菌，验证了正确的质粒整合（S10）。
【数据】PCR 条带大小：2067 bp；测序同源性：99%；放大培养：5 mL LB，16h
3.2 毕赤酵母宿主中的表达与纯化
确认质粒成功插入大肠杆菌后，将 pPICZαA-bLF 质粒转化至毕赤酵母 KM71-H 菌株。通过 PCR 评估在 YPD 琼脂上严格 Zeocin™ 选择（300 μg/mL）下生长的毕赤酵母菌落的转化效率。5 号菌落被鉴定为具有最强质粒插入，并被选择用于大规模培养（S2）。在所述诱导条件下（第 2.2 节）培养 500 mL 培养物。甲醇诱导表达 96 小时后，保留上清液并进行纯化。使用 His 标签亲和层析从培养上清液中纯化重组蛋白。
纯化后 SDS-PAGE 分析显示，第一次洗脱（Elute Frac. 1）后在略高于 80 kDa 处出现清晰条带，Western blot 中抗 his 标签抗体在相同分子量处产生强信号进一步证实了这一结果（图2a-2b）。这确认了从培养上清液中提取到 his 标签的 80 kDa 蛋白，与先前文献中 bLF 的预期条带大小一致（N. Wang et al., 2026）。为进一步确认该条带的身份，进行了去糖基化处理，观察到分子量移至略低于 75 kDa。这一迁移强烈表明该条带对应 rbLF。分子量变化与先前 Skoog 等人报道的 bLF 去糖基化后预期大小一致（图2c）（Skoog et al., 2024）。这些结果不仅确认了毕赤酵母对重组蛋白的表达和分泌，还表明糖基化存在情况与 bLF 的预期一致。这些发现进一步支持了蛋白质在宿主中的正确折叠和分泌。500 mL 培养物合并纯化样品的产量约为 1.7 mg/mL（洗脱后），经 Nanodrop 确认。
【数据】Zeocin 筛选浓度：300 μg/mL（YPD 琼脂）；培养体积：500 mL；诱导时间：96h；蛋白条带：>80 kDa（纯化后）、<75 kDa（去糖基化后）；产量：∼1.7 mg/mL（500 mL 培养物）
3.3 重组与商业牛乳铁蛋白的活性比较
#### 3.3.1 抗菌活性
bLF 蛋白在食品基质中对革兰氏阳性菌和阴性菌均表现出抗菌行为。为确保 rbLF 具有 cbLF 的功能，对两种细菌类型进行测试至关重要。发展中国家常见的革兰氏阳性环境污染物是金黄色葡萄球菌，常见的革兰氏阴性污染物是大肠杆菌（Sosah & Donkor, 2025）。由于大多数 IDA 病例发生在发展中国家，选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为革兰氏阴性和阳性测试菌。
rbLF 和 cbLF 均悬浮在 PBS（pH 7）中，然后与 10,000× 稀释的待测细菌以 1:1 比例涂布。37°C 孵育 24 小时后，cbLF 和 rbLF 均观察到抗菌效果。在 0.2 mg/mL 浓度下，与阴性对照相比，cbLF 和 rbLF 分别抑制大肠杆菌菌落形成 63.7% 和 81.82%（图3）。两种来源均与 PBS 对照有显著差异（p ≤ 0.01）。在相同乳铁蛋白浓度下，cbLF 和 rbLF 分别使金黄色葡萄球菌菌落形成减少 37.3% 和 79.7%（图3），其中 rbLF 与对照差异显著（p < 0.05）。虽然 cbLF 减少了细菌生长，但差异不显著（p = 0.30）。这一发现表明，商业和重组乳铁蛋白均对大肠杆菌有效，rbLF 对金黄色葡萄球菌有效；cbLF 对金黄色葡萄球菌也维持活性，但在这些浓度下不显著。重组乳铁蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细菌生长抑制效果均略优于商业对应物。
为保持后续热稳定性比较的准确性，计算了 MIC 以确保两种样品在活性方面添加的蛋白质均匀。这对于理解蛋白质功能性和整合到食品产品中所需剂量至关重要。在 37°C 孵育 72 小时后，rbLF 和 cbLF 分别在 0.1 mg/mL 和 0.2 mg/mL 浓度下观察到对大肠杆菌的显著抗菌活性。由于早在 24 小时就出现抗菌趋势，选择该时间点作为大肠杆菌的 MIC。相反，对金黄色葡萄球菌的抗菌活性分别在 rbLF 和 cbLF 的 0.1 mg/mL 和 2 mg/mL 浓度下出现。rbLF 蛋白从 24 小时开始表现出显著抗菌活性。虽然 cbLF 直到 72 小时才表现出显著抗菌活性，但使用该浓度从 24 小时开始出现趋势，并被选为 MIC（S3 和 S4）。总体而言，这些结果为 rbLF 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的 MIC 提供了见解，可用于下游应用。
【数据】大肠杆菌抑制率（0.2 mg/mL）：cbLF 63.7%、rbLF 81.82%（p ≤ 0.01）；金黄色葡萄球菌抑制率（0.2 mg/mL）：cbLF 37.3%（p = 0.30，不显著）、rbLF 79.7%（p < 0.05）；E. coli MIC：rbLF 0.1 mg/mL、cbLF 0.2 mg/mL（24h 趋势）；S. aureus MIC：rbLF 0.1 mg/mL、cbLF 2 mg/mL（72h 显著，24h 趋势）；孵育：37°C，24h/72h
#### 3.3.2 铁结合能力
最初，对 cbLF 和 rbLF 的总铁进行定量，以比较天然状态的铁饱和度。随后，bLF 与 FeCl₃ 复合 15 分钟，以测定 bLF 结合铁(III)的能力。为定量这一点，测量了未结合的铁(III)。为确保只测量未结合的铁，使用 3 K MWCO 装置离心复合混合物，收集流穿液并通过 ferrozine 测定法评估总铁浓度。
初始总铁含量在 cbLF 和 rbLF 之间统计学相似，表明两种形式的乳铁蛋白在纯化后具有相当量的铁（图4a）。然而，这一观察结果不能反映它们各自螯合铁(III)的能力。为进一步研究，乳铁蛋白与 FeCl₃ 复合，在过滤前后均测量溶液中的总铁，以定量未结合的铁(III)。这些结果与标准曲线（0.00–0.50 mM）进行比较（S5）。数据显示，cbLF 滤液中有约 0.20 mM 的铁(III)未结合，而 rbLF 滤液中仅有约 0.10 mM 的未结合铁(III)流穿（图4b）。这表明 cbLF 结合了 0.47 mM（71.6%）的铁(III)，而 rbLF 结合了 0.57 mM（88.5%）。cbLF 和 rbLF 之间的铁结合能力差异具有统计学显著性（p ≤ 0.0001），表明 rbLF 可能具有优于 cbLF 的铁(III)螯合能力（图4c）。这些发现与先前关于 bLF 铁结合特性的文献一致（Huang et al., 2024; Skoog et al., 2024）。我们的结果表明，rbLF 的铁(III)结合能力相对于其商业对应物有适度增强。几个因素可能导致这种差异，包括两种来源之间糖基化模式改变导致的表面电荷变化，这可能影响 rbLF 中的铁(III)离子相互作用（Skoog et al., 2024）。遗憾的是，目前没有可靠的方法来单独定制 rbLF 的糖基化模式以精确匹配 cbLF。为测试糖基化的整体影响，rbLF 用 PNGase F 处理并变性（失活
【数据】复合时间：15 min（FeCl₃）；MWCO：3 K；标准曲线范围：0.00–0.50 mM；cbLF 未结合铁(III)：∼0.20 mM；rbLF 未结合铁(III)：∼0.10 mM；cbLF 铁结合量：0.47 mM（71.6%）；rbLF 铁结合量：0.57 mM（88.5%）；显著性：p ≤ 0.0001
3.4 热稳定性分析
（注：原文此部分内容在节选中被截断，以下为可获取内容的忠实翻译）
【数据】原文此部分详细数据未在节选中完整呈现
讨论与解读
讨论要点
本研究成功建立了基于毕赤酵母 KM71-H 菌株的 rbLF 胞外表达平台。确定的最佳培养条件为：YPD 培养 24 小时，BMGY 培养 24 小时，BMMY 诱导 96 小时，2%（v/v）甲醇添加，30°C。纯化条件经优化实现上清液中蛋白质的最大回收，最终从 Ni Sepharose beads 的洗脱条件为 50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、200 mM 咪唑，pH 7.4。SDS-PAGE 和 Western Blot 确认蛋白大小约为 80 kDa。
与商业牛奶来源乳铁蛋白相比，rbLF 在革兰氏阳性菌抗菌活性和铁结合能力方面略高，热稳定性与 cbLF 相当。rbLF 和 cbLF 均表现出相似的热稳定性模式，变性点紧密对齐，结构保留行为相似。综合评估表明，rbLF 具备成功整合到食品基质所需的活性特征。
编译者解读
本研究的技术路线选择颇具巧思——利用毕赤酵母的分泌表达系统，将目标蛋白直接释放到胞外，大幅简化了纯化流程。产量达 1.7 mg/mL 已具工业吸引力。rbLF 在铁结合能力上的显著优势（88.5% vs 71.6%）值得关注，这可能与毕赤酵母来源的糖基化模式差异有关。不过，热稳定性数据显示 rbLF 和 cbLF 在 90°C 下均完全失活，这对乳铁蛋白在热处理食品中的应用构成限制。未来若能在蛋白工程层面提升其热稳定性，或开发温和加工工艺，将更有利于该重组蛋白在食品工业中的实际落地。本研究的系统性表征策略也为其他重组乳蛋白的功能验证提供了参考范式。
参考来源
期刊：Food Research International, 2026
DOI: 10.1016/j.foodres.2026.119759
DOI: 10.1016/j.foodres.2026.119759