来源：Low-carbon and overproduction of cordycepin from methanol using engineered Pichia pastoris cell factory（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
虫草素是一种核苷类似物，在医药和保健品领域应用广泛，但传统蛹虫草生产面临产率低、碳排放高等问题。本研究通过启动子组合、Kozak序列优化、酶融合策略及过氧化物酶体工程等多重改造，构建了高产虫草素的毕赤酵母工程菌株Pp29。摇瓶发酵产量达1551.44 mg/L，10 L发酵罐补料分批发酵产量达8.11 g/L，为迄今报道的最高水平，且碳排放较蛹虫草及其他酵母系统降低1.9–17.3倍。
研究背景
虫草素（3′-脱氧腺苷）是一种由腺嘌呤和呋喃核糖通过β-N9-糖苷键连接而成的核苷类似物，天然可由蛹虫草、蝉花、构巢曲霉及产黄头孢霉等生物合成。虫草素具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、杀虫及除草等多种生物功能，在医药、功能性食品、农业及畜牧业中应用广泛。蛹虫草子实体经30–60天漫长生产周期后，虫草素含量仅2–3 mg/kg，即便通过菌丝液体发酵也只能提升至6.5–8.6 g/L。日益加速的气候危机对化学品的低碳环保生产提出了更高要求，而蛹虫草生产虫草素面临发酵周期过长、菌株遗传性状不稳定及温室气体排放率高等难以解决的问题，阻碍了虫草素低碳高效生产的实现。
研究方法
2.1 质粒与菌株构建
本研究涉及的所有质粒、菌株及引物均列于补充材料中。大肠杆菌DH5α用于所有质粒的构建与扩增。毕赤酵母GS115（ATCC 20864）作为本研究中所有虫草素工程菌株的起始菌株。
虫草素生物合成基因——氧化还原酶/脱氢酶（cns1，CCM_04436）、金属依赖性磷酸水解酶（cns2，CCM_04437）及核苷/核苷酸激酶（cns3/NK，CCM_04438）——克隆自蛹虫草CP1（CCTCC M2019671），并根据毕赤酵母密码子偏好性合成至Ppcns1、Ppcns2、Ppcns3/NK载体中（擎科，北京）。同样，来自大肠杆菌的2′,3′-环核苷酸2′-磷酸二酯酶基因（cpdB，b4213）和来自变形链球菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（gapN，F5989_RS03240）经优化后合成至PpcpdB和PpgapN载体中（擎科，北京）。
醇氧化酶1（aox1，PAS_chr4_0821）、过氧化氢酶（cat，PAS_chr2-2_0131）、磷酸二羟丙酮合酶（das1，PAS_chr3_0832）、磷酸甘油酸激酶（pgk，PAS_chr1-4_0292）、丙酮酸激酶（pyk，PAS_chr2-1_0769）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（g6pdh，PAS_chr2-1_0308）、核糖磷酸焦磷酸激酶（prps，PAS_chr1-1_0006）、磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶（purF，PAS_chr1-1_0430）、腺苷酸琥珀酸合酶（adss，PAS_chr4_0613）及腺苷酸琥珀酸裂解酶（adls，PAS_chr2-2_0329）等基因均从毕赤酵母GS115的cDNA中扩增获得。
所有质粒均使用同源重组酶（C115，Vazyme，南京）构建。本研究涉及的所有外源基因的核苷酸序列列于补充材料。重组质粒转化采用浓缩电穿孔方案，使用GenePulser Xcell电穿孔仪（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）完成。
为增强毕赤酵母中目标基因的启动子强度，将egfp基因与不同Kozak序列组合构建了八个质粒于pAO815中，所得质粒命名为pAO815-Kx-EGFP（x为0至8）。上述质粒经Sal Ⅰ（Takara，北京）酶切后电穿孔转入毕赤酵母GS115，获得菌株PpK0、PpK1、PpK2、PpK3、PpK4、PpK5、PpK6、PpK7和PpK8。在所有目标基因的起始密码子前添加K7序列“CGGACC”。
Ppcns1、Ppcns2和Ppcns3/NK的组合涉及不同连接肽的使用，包括柔性肽GGGGS、刚性肽EAAAK以及2A自切割肽P2A和T2A。由此产生四个质粒：pAO815-21G4S、pAO815-21EA3K、pAO815-212A和pAO815-3212A。随后，利用甲醇诱导型启动子PAOX1和PFLD1构建了pAO815-1K2K和pAO815-1K32K。为将这六个含虫草素基因表达盒的质粒整合到毕赤酵母GS115（His-）基因组中，使用组氨酸缺陷型MD（最低葡萄糖）平板进行筛选，获得Pp01、Pp02、Pp03、Pp04、Pp05和Pp06。
为增加Ppcns1和Ppcns2的基因拷贝数，使用F/R-rDNA-TYB引物从毕赤酵母GS115基因组中扩增rDNA片段，并将其整合到pPICZA-rDNA-212A质粒中。pPICZA-rDNA-212A质粒经Spe Ⅰ（Takara，北京）酶切后通过电穿孔导入Pp06，在含100 mg/L博来霉素（Zeo）的YPD平板上筛选获得Pp07。
为增强虫草素工程菌株的甲醇利用能力，利用natMX6（诺尔丝菌素基因表达盒）构建了pGAPNTC质粒，实现cat、aox1和das1的过表达。pGAPNTC系列质粒经Bln Ⅰ（Takara，北京）酶切。根据过氧化物酶体定位信号肽per2（GGGSAAVKLSQAKSKL）与蛋白质C末端的融合情况（Zhou等，2016），AOX1、CAT和DAS1在Pp07的细胞质和过氧化物酶体中表现出差异化表达。随后，通过100 mg/L诺尔丝菌素（NTC）筛选获得Pp08、Pp09、Pp10、Pp11、Pp12、Pp13、Pp14、Pp15、Pp16、Pp17和Pp18。
为提高ATP、NADPH和腺苷前体的供应，扩增HygMX（潮霉素基因表达盒）并插入pFLD1构建pFLDHyg。随后将pgk、pyk、g6pdh、prps、purF和PpgapN连接到pFLDHyg，生成质粒pFLDHyg-PGK、pFLDHyg-PYK、pFLDHyg-G6PDH、pFLDHyg-PRPS、pFLDHyg-PurF、pFLDHyg-PpGapN和pFLDHyg-PGK-P2A-PurF-T2A-PpGapN。pFLDHyg系列质粒经Nsi Ⅰ（New England Biolabs，Hitchin，UK）酶切，整合到Pp15中并以200 mg/L潮霉素（Hyg）筛选，获得Pp19、Pp20、Pp21、Pp22、Pp23、Pp24和Pp25。
此外，来自毕赤酵母的腺苷合成基因（adss、adls）和来自大肠杆菌的3′-AMP合成基因（cpdB）与P2A和T2A连接至pPICKan，生成pPICKan-AdSS、pPICKan-AdLS、pPICKan-PpCpdB、pPICKan-AdSS-P2A-PpCpdB、pPICKan-AdLS-P2A-PpCpdB和pPICKan-AdSS-P2A-PpCpdB-T2A-AdLS。pPICKan系列质粒经Pme Ⅰ（New England Biolabs，Hitchin，UK）酶切。随后，这六个质粒整合到Pp25基因组中，使用500 mg/L遗传霉素（G418）筛选，获得Pp26、Pp27、Pp28、Pp29、Pp30和Pp31。
2.2 培养基与培养条件
LB培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）和低盐LB培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L NaCl）用于大肠杆菌的培养，条件为37°C、150 rpm。重组毕赤酵母在BMGY（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、13.4 g/L无氨基酸酵母氮源（YNB）、100 mM磷酸钾、4×10⁻⁴ g/L D-生物素、10 g/L甘油）和BMMY（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、13.4 g/L YNB、100 mM磷酸钾、4×10⁻⁴ g/L D-生物素、1%（v/v）甲醇）中于30°C、200 rpm培养进行虫草素合成。
基础盐培养基（BSM）由0.93 g/L CaSO₄、18.2 g/L K₂SO₄、14.9 g/L MgSO₄·7H₂O、4.13 g/L KOH、40.0 g/L甘油和26.7 mL/L H₃PO₄（85%）组成。PTM1微量元素溶液包含6.0 g/L CuSO₄·5H₂O、0.08 g/L NaI、3.0 g/L MnSO₄·H₂O、0.2 g/L MoNa₂O₄·2H₂O、0.02 g/L H₃BO₃、0.5 g/L CoCl₂、20.0 g/L ZnCl₂、65.0 g/L FeSO₄·7H₂O、0.2 g/L D-生物素和5.0 mL/L H₂SO₄。
毕赤酵母菌株的补料分批培养在10 L发酵罐（BN18031，BXBIO，上海）中进行，含4 L BSM并添加4.4 mL/L PTM1。毕赤酵母种子液使用YPD培养基（20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物）制备，随后按8%（v/v）接种量将种子液接入发酵罐进行高密度发酵。高密度发酵过程包括三个阶段：批次阶段（阶段I）在BSM中启动，用于初始细胞生物量积累，持续20小时。通过添加25%（v/v）氨水将发酵液pH维持在5.0–5.5，温度稳定在30°C，通过调节转速（200–800 rpm）和通气量（2–8 vvm）将溶解氧（DO）浓度维持在30–50%。当DO回升至80–90%时启动补料批次阶段（阶段II）以实现进一步细胞生长，以20 mL/L/h的恒定速率补入含1.2%（v/v）PTM1的50%（m/v）甘油。当OD₆₀₀达到250–300时，停止甘油供应并对酵母进行1小时饥饿处理，随后进入甲醇诱导阶段（阶段III），以5 mL/L/h的恒定速率补入含1.2%（v/v）PTM1的100%甲醇。DO维持在……
【数据】大肠杆菌培养：LB/低盐LB培养基，37°C，150 rpm；毕赤酵母培养：BMGY/BMMY培养基，30°C，200 rpm；BSM组分：0.93 g/L CaSO₄、18.2 g/L K₂SO₄、14.9 g/L MgSO₄·7H₂O、4.13 g/L KOH、40.0 g/L甘油、26.7 mL/L H₃PO₄(85%)；PTM1组分：6.0 g/L CuSO₄·5H₂O、0.08 g/L NaI、3.0 g/L MnSO₄·H₂O、0.2 g/L MoNa₂O₄·2H₂O、0.02 g/L H₃BO₃、0.5 g/L CoCl₂、20.0 g/L ZnCl₂、65.0 g/L FeSO₄·7H₂O、0.2 g/L D-生物素、5.0 mL/L H₂SO₄；发酵罐：10 L，4 L BSM，4.4 mL/L PTM1，8%接种量；阶段I：20 h，pH 5.0–5.5，30°C，DO 30–50%，转速200–800 rpm，通气2–8 vvm；阶段II：50%甘油+1.2% PTM1，20 mL/L/h；OD₆₀₀ 250–300时停止甘油，饥饿1 h；阶段III：100%甲醇+1.2% PTM1，5 mL/L/h
研究结果
3.1 毕赤酵母中虫草素生物合成途径的构建与优化
虫草素工程菌株通过将来源于蛹虫草CP1的密码子优化基因Ppcns1、Ppcns2和Ppcns3/NK整合到毕赤酵母基因组中构建而成（图1A）。游离质粒在毕赤酵母中不稳定，在无选择压力下传代10次后质粒丢失率达50–70%。然而，一旦基因表达盒整合到毕赤酵母基因组中，菌株可在超过100代中维持稳定的目标性状。具有相同复制起点的质粒在酵母中不相容，这限制了多途径改造。
在蛹虫草CP1（本研究，CCTCC M2019671）与蛹虫草CM01（NCBI分类号983644）的Cns1（p.F12C、p.P30S、p.E425D、p.N440G、p.S599A、p.A611V、p.S635P、p.D770E）、Cns2（p.K130E、p.P314Q）和Cns3/NK（p.N154S）蛋白之间观察到氨基酸序列差异（见补充材料）。
毕赤酵母GS115作为虫草素生产工程菌株的适用性取决于其耐受高浓度虫草素的能力——考虑到虫草素具有抗真菌活性。当YPD培养基中虫草素浓度超过1 g/L时，毕赤酵母GS115的生长受到显著抑制，且抑制程度与虫草素浓度呈正相关（图1B）。结果表明毕赤酵母GS115对虫草素表现出较强的耐受性。
5′-非翻译区，特别是Kozak序列，在调控下游基因的转录水平中起关键作用。在八个Kozak序列中，与K7序列（CGGACC）融合的EGFP检测到最高的相对荧光强度（图1C-D）。因此，选择K7序列置于所有目标基因起始密码子上游。
通过使用GGGGS、EAAAK和T2A连接肽融合PpCns1和PpCns2构建了菌株Pp01、Pp02和Pp03，虫草素产量分别为288.5 mg/L、345.5 mg/L和564.7 mg/L（图1E）。与柔性肽连接的酶相比，刚性肽连接的酶表现出更高的虫草素合成效率（图1E）。这可能归因于刚性肽能够保持目标酶之间的适当间距，防止酶功能域之间的相互作用，并增强融合酶的结构稳定性。
在T2A序列翻译过程中，核糖体经历一种称为“跳跃”的过程，绕过C端“NPGP”基序中甘氨酸和脯氨酸之间的肽键。这导致产生独立的PpCns1和PpCns2，从而允许在真核表达系统中利用多顺反子表达盒。值得注意的是，在相同的PAOX1启动子调控下，独立形式的PpCns1和PpCns2表现出优于融合状态的虫草素合成能力（图1E）。这种活性差异可能归因于融合酶序列过长导致翻译效率降低。
发酵过程中生物量和虫草素的同步积累不利于虫草素的过量生产，这一现象在产软骨素硫酸盐和肝素的毕赤酵母工程菌株中也观察到。一种有效的提高虫草素产量的策略是使用补料分批培养和甲醇诱导型启动子，将工程菌株中的早期生物量积累阶段与虫草素合成阶段分离。使用柔性肽、刚性肽和2A自切割肽的酶融合策略能有效增强底物通道效应并减少中间产物损失。该策略已成功应用于工程酵母中广藿香醇和3-羟基丙酸的加速合成。
使用P2A将PpCns3/NK整合到毕赤酵母基因组中产生了Pp04菌株，虫草素产量显著增加至617.0 mg/L，较Pp03提高了9.3%（图1E）。PpCns3/NK有效磷酸化腺苷生成3′-AMP，从而为虫草素合成提供充足前体。这些发现表明毕赤酵母中3′-AMP的有限可用性是虫草素合成的瓶颈。
在高产虫草素的蛹虫草菌株中，cns1的转录水平是cns2和cns3的2–5倍。同样，在解脂耶氏酵母的虫草素工程菌株中，尽管cns1受弱启动子PFBA调控，其表达水平仍约为受强启动子PTEF控制的cns2的三倍。在涉及各种目标基因的研究中，甲醇诱导后PFLD1的表达水平约为PAOX1的30–50%。因此，采用PAOX1调控Ppcns1以及PFLD1调控Ppcns2和Ppcns3/NK被证明是提高虫草素产量的可行策略（图1E）。正如预期，Pp05和Pp06的虫草素产量分别增加至724.1 mg/L和819.7 mg/L（图1E）。
核糖体DNA（rDNA）序列由5S、5.8S、25S和18S的转录区及非转录间隔区组成。毕赤酵母基因组含有数百甚至数千个重复序列，使rDNA序列成为实现目标基因多拷贝整合的有利整合位点。通过整合多个拷贝的Ppcns1和Ppcns2，Pp07的虫草素产量达到1079.1 mg/L，较Pp06提高了31.6%（图1E）。标准品中虫草素的保留时间为9.68分钟，回收率为98.6–101.2%（图1F）。腺苷和虫草素的标准分子量分别为267.24和251.24，HPLC-MS检测到的质荷比分别为268.10和252.11，从而确认了Pp07合成了腺苷和虫草素（图1F）。虫草素和腺苷标准品用于HPLC-MS检测的质量控制（见补充材料）。
【数据】质粒丢失率：50–70%（10代无选择压力）；100代以上稳定遗传；虫草素耐受：>1 g/L时生长受抑；Kozak筛选：K7序列（CGGACC）荧光最强；Pp01：288.5 mg/L（GGGGS）；Pp02：345.5 mg/L（EAAAK）；Pp03：564.7 mg/L（T2A）；Pp04：617.0 mg/L（+9.3%）；Pp05：724.1 mg/L；Pp06：819.7 mg/L；Pp07：1079.1 mg/L（+31.6%）；cns1转录水平为cns2和cns3的2–5倍；PFLD1表达水平为PAOX1的30–50%；虫草素保留时间9.68 min，回收率98.6–101.2%；腺苷m/z 268.10，虫草素m/z 252.11
3.2 增强甲醇同化以增加碳代谢供应
甲醇在虫草素积累期间既作为诱导剂又作为唯一碳源，显著影响毕赤酵母的生长和虫草素的过量生产。甲醇转化为3′-磷酸甘油醛（G3P）及其在EMP和PPP中的利用涉及醇氧化、过氧化氢（H₂O₂）还原和醛缩合反应（图2A）。已有假设认为过表达AOX1、CAT和DAS1酶可增强甲醇同化效率，从而确保有足够的碳代谢通量用于虫草素合成。
然而，在Pp07细胞质中过表达CAT、AOX1、DAS1及其组合导致菌株Pp08、Pp09、Pp10和Pp11的虫草素产量较Pp07下降了0.3–15.8%（图2A）。过氧化物酶体是负责甲醇同化和异化的功能性亚细胞细胞器，为甲基营养型酵母提供碳代谢通量。因此，我们致力于将甲醇同化途径定向至过氧化物酶体……
【数据】Pp08–Pp11较Pp07产量变化：−0.3%至−15.8%；甲醇为唯一碳源和诱导剂；过氧化物酶体为甲醇同化场所
讨论与解读
本研究通过系统性代谢工程策略，将毕赤酵母打造为以甲醇为唯一碳源的虫草素高效合成细胞工厂。最终工程菌株Pp29的虫草素产量达到8.11 g/L，为迄今报道的虫草素异源生产的最高水平，且碳排放低于所有已报道的虫草素生物合成系统。通过虫草素生物合成途径优化、甲醇同化能力增强、ATP和NADPH合成调控以及前体供应改善，虫草素产量分别提高了31.6%、12.7%、15.8%和11.1%。这些结果表明碳代谢、辅因子水平和前体供应是虫草素合成的关键因素。
编译者解读
该研究展示了甲醇利用型酵母作为核苷类似物合成平台的独特优势——以廉价甲醇为碳源兼诱导剂，将生长相与生产相分离，同时通过过氧化物酶体区室化策略规避了细胞质过表达甲醇同化酶带来的代谢负担。值得注意的是，细胞质中过表达AOX1、CAT、DAS1反而导致产量下降0.3–15.8%，这一反直觉结果凸显了区室化工程在代谢途径优化中的价值。从合成生物学应用角度看，该策略为其他核苷类化合物的低碳生物制造提供了可借鉴的范式——但8.11 g/L的产量距离工业化仍有距离，且发酵罐规模仅10 L，放大效应与甲醇的毒性积累问题有待进一步验证。此外，多轮抗性标记插入的遗传稳定性也值得长期考察。
参考来源
Zhao B. Low-carbon and overproduction of cordycepin from methanol using engineered Pichia pastoris cell factory. Bioresource Technology, 2024. DOI: 10.1016/j.biortech.2024.131446
DOI: 10.1016/j.biortech.2024.131446