来源：Recombinant human myeloperoxidase from Pichia pastoris: Functional analyses and potential for surface applications（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
人髓过氧化物酶（hMPO）是先天免疫系统中的关键酶，催化过氧化氢与氯离子生成次氯酸。本研究在毕赤酵母中实现了重组hMPO（rhMPO）的功能性表达，并通过融合葡萄糖氧化酶构建双功能嵌合酶，实现从葡萄糖直接生成次氯酸。两种生产方案（BMMY/G与MMH）在产量与酶质量间呈现权衡：MMH方案产量超过17 mg/L，但需体外血红素重构恢复活性。酶经重构后活性仅比天然酶低约3倍，且对H₂O₂耐受性显著优于天然酶。研究还探索了酶在硅酮模型表面的吸附固定化，为抗菌表面开发提供了新路径。
研究背景
血红素过氧化物酶分为过氧化物酶-过氧化氢酶和过氧化物酶-环氧合酶两个超家族。后者包含七个子家族，其中脊索动物过氧化物酶包括髓过氧化物酶（MPO）、嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）、乳过氧化物酶（LPO）和甲状腺过氧化物酶（TPO）。这四种金属蛋白以过氧化氢（H₂O₂）为底物催化单电子和双电子氧化反应。MPO的独特之处在于能在生理pH下将氯离子（Cl⁻）氧化为次氯酸（HOCl），反应式为：H₂O₂ + Cl⁻ + H₃O⁺ → 2H₂O + HOCl。HOCl是强效抗菌剂，在宿主抗感染防御中发挥关键作用。hMPO大量存在于中性粒细胞的嗜天青颗粒中，在吞噬杀菌过程中，NADPH氧化酶激活产生超氧阴离子，后者自发歧化为H₂O₂。然而，部分H₂O₂会扩散至周围宿主组织（扩散速率1×10⁻³至3×10⁻³ cm·s⁻¹），可能造成组织损伤。目前商业MPO通常从人血液中纯化或在哺乳动物细胞及大肠杆菌中重组生产，成本高昂且规模化受限。本研究旨在利用毕赤酵母开发低成本、可规模化的活性重组hMPO生产平台，并通过基因融合构建双功能酶以消除外源添加H₂O₂的需求。
研究方法
2.1 化学试剂
实验所用化学品来源如下：Merck™（氨基苯甲酸酰肼（ABAH）、底物、磷酸钠缓冲液、培养基）、Biorad™（丙烯酰胺凝胶、分子量标准品）、DIFCO™（培养基）、Invitrogen（TRIS缓冲液）。溶液均使用去离子水配制，经Millipore™ AQ 10 Milli-Q®系统纯化。来自人白细胞的天然hMPO购自Merck（货号M6908）。
【数据】试剂来源：Merck™、Biorad™、DIFCO™、Invitrogen；天然hMPO：Merck M6908
2.2 培养基
BMGY（缓冲甘油复合物）和BMMY（缓冲甲醇复合物）培养基基于Invitrogen™毕赤酵母表达试剂盒方案配制。培养基成分为：1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mM磷酸钾（pH 6）、1.34%酵母氮碱（YNB）、4×10⁻⁵%生物素，以及1%甘油或0.5%甲醇。
LB（Luria-Bertani）低盐培养基：胰蛋白胨（10 g/L）、酵母提取物（5 g/L）、NaCl（5 g/L）。配制1 L培养物需将20 g LB溶解于去离子水中。
YPD培养基（酵母提取物蛋白胨葡萄糖）：细菌蛋白胨（20 g/L）、酵母提取物（10 g/L）、葡萄糖（10 g/L）。配制1 L培养物需将40 g YPD溶解于去离子水中。
添加组氨酸的极限甲醇（MMH）培养基：YNB（1.34%）、生物素（4×10⁻⁵%）、甲醇（0.5%）、组氨酸（4×10⁻³%）、甘油（5 g/L）。
【数据】BMGY/BMMY：1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mM磷酸钾pH 6、1.34% YNB、4×10⁻⁵%生物素、1%甘油或0.5%甲醇；LB：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 5 g/L；YPD：蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L、葡萄糖10 g/L；MMH：YNB 1.34%、生物素4×10⁻⁵%、甲醇0.5%、组氨酸4×10⁻³%、甘油5 g/L
2.3 菌株与质粒
大肠杆菌NEB5α（基因型：fhuA2::IS2 Δ(mmuP-mhpD)169 ΔphoA8 glnX44 ϕ80d[ΔlacZ58(M15)] rfbD1 gyrA96 luxS11 recA1 endA1 rphWT thiE1 hsdR17）购自New England Biolabs® Inc.。毕赤酵母GS115 his4购自Invitrogen。编码hMPO开放阅读框（ORF）的pPICZαAhMPO质粒由Genescript合成。编码GOx ORF的pPICZαAGOx质粒见Courjean和Mano的报道[24]。
【数据】大肠杆菌菌株：NEB5α；毕赤酵母菌株：GS115 his4；质粒：pPICZαAhMPO（Genescript合成）、pPICZαAGOx [24]
2.4 限制性内切酶
限制性内切酶（EcoRI、XbaI、SacI、XhoI、SalI和PsiI）购自New England Biolabs® Inc.。
【数据】限制酶：EcoRI、XbaI、SacI、XhoI、SalI、PsiI
2.5 嵌合构建
用于表达rhMPO或双功能酶（嵌合体）的基因构建体部分通过商业合成获得，部分在本研究中通过基因工程方法生成。嵌合体被设计为具有双重酶活性，结合GOx和MPO功能。构建体通过融合编码rhMPO和GOx的开放阅读框生成，rhMPO位于N端以防止MPO成熟过程中两种酶的分离。为确保结构和功能完整性，在两个开放阅读框之间插入了一段编码由LEKREAEA残基组成的肽接头的24核苷酸序列。嵌合构建体按照Scheme S1（补充信息）所述方法生成，该方法改编自Vasl等[25]。详细方案见补充信息。用于嵌合体生产和测序的寡核苷酸由Sigma-Aldrich订购，序列见补充信息。
【数据】接头序列：LEKREAEA（24核苷酸编码）；嵌合体结构：rhMPO-N端-接头-GOx
2.6 BMMY培养基中的生产
编码hMPO ORF的序列已针对毕赤酵母表达进行密码子优化，由GenScript®（美国皮斯卡塔韦）合成并克隆至pPICZα载体。编码GOx的ORF经扩增后克隆至pPICZαA载体[24]。毕赤酵母GS115细胞按照Multiporator/Eppendorf Eporator®方案制备感受态并转化。酵母用5或10 µg经SacI线性化的pPICZαAhMPO、GOx或嵌合rhMPO-（±接头=LEKREAEA）-GOx质粒进行转化。最具抗性的克隆在含递增浓度zeocin（100 mg/mL、300 mg/mL和600 mg/mL）的YPDS（含山梨醇的YPD）琼脂培养基上筛选。根据Invitrogen™方案（毕赤酵母表达试剂盒），从YPDS zeocin 600 mg/mL培养基中挑取选定的重组克隆（单菌落）进行培养。将25 mL BMGY培养基（250 mL摇瓶）接种单菌落，于28°C、230 rpm培养至A₆₀₀ₙₘ = 2–6。细胞在室温下3000g离心5分钟收集。含GS115的沉淀重悬于2个5 L摇瓶，每瓶含500 mL BMMY培养基，A₆₀₀ₙₘ调至20。培养物放回摇床继续生长并诱导目的蛋白表达。每24小时添加纯甲醇至终浓度0.5% v/v，维持诱导72小时。
【数据】转化质粒量：5或10 µg；zeocin筛选浓度：100、300、600 mg/mL；BMGY预培养：25 mL、28°C、230 rpm、A₆₀₀ₙₘ=2–6；离心：3000g、5 min、室温；BMMY诱导：500 mL×2、A₆₀₀ₙₘ=20、甲醇0.5% v/v每24 h、72 h
2.7 MMH培养基中的生产
将含有pPICZα-hMPO或pPICZα-hMPO-LEKREAEA-GOx的GS115细胞单菌落接种至含Zeocin（250 μg/mL）的25 mL YPD预培养液中，于30°C、190 rpm振荡培养两晚。随后将预培养液接种至5 L摇瓶中的2 L MMH培养基，补充2.5 g/L甘油作为碳源，于30°C、190 rpm培养2.5天，最终A₆₀₀ₙₘ为20。每24小时添加甲醇至终浓度0.25% v/v进行诱导，维持诱导72小时，同时将培养温度降至25°C。该方案改编自文献[26]。
【数据】预培养：25 mL YPD、Zeocin 250 μg/mL、30°C、190 rpm、2晚；MMH培养：2 L、甘油2.5 g/L、30°C、190 rpm、2.5天、A₆₀₀ₙₘ=20；甲醇诱导：0.25% v/v每24 h、72 h、25°C
2.8 纯化
对于rhMPO和嵌合酶，培养上清（BMMG或MMH）在4°C下6000g离心10分钟澄清，然后经0.22 µm过滤。分泌的酶用截留分子量10 kDa的Sartocon® Hydrosart® Cassette浓缩至约50 mL。溶液用50 mM TRIS结合缓冲液（pH 7.5）稀释两次，然后上样至Cytiva AKTA® Purifier系统。酶（rhMPO或嵌合酶）在Resource™ S（Cytiva 1 mL）阳离子交换柱上纯化，柱子预先用结合缓冲液平衡。目的酶用0至1 M的线性NaCl梯度洗脱。rhMPO在Buffer B的20%至70%之间洗脱，即200 mM至700 mM NaCl。全酶在约400 mM NaCl处洗脱。流速为1 mL/min，馏分大小为0.5 mL。
由于嵌合体的高等电点（pI 7.99）以及MMH方案获得的大量酶，嵌合酶也可使用Hiload® 26/600 200 pg Superdex®（S200）尺寸排阻色谱柱（Cytiva）纯化。蛋白样品上样量小于13 mL，用50 mM TRIS缓冲液（pH 7.5）等度洗脱，流速1 mL/min。洗脱液分别在280 nm和410 nm连续监测以检测蛋白和血红素。收集目的馏分，用超滤管（Amicon Ultra 15，10 kDa截留）浓缩至储存缓冲液50 mM TRIS（pH 7.5）。根据是否存在Soret带，酶在4°C下于含50 µM血红素和0.75 mM氧化型谷胱甘肽的50 mM TRIS缓冲液（pH 7.5）中重构过夜。
酶纯度通过梯度SDS-PAGE凝胶（4–15% Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Gel）电泳检查。BMMY/BMMG中生产的rhMPO上样2.7 µg，凝胶用ProteoSilver™ Silver Stain Kit显色。MMH中生产的嵌合体上样68 µg，凝胶用考马斯亮蓝G250染色。rhMPO-LEKREAEA-GOx无任何翻译后修饰的理论分子量为143812.79 Da。两块凝胶均上样5 µL Precision Plus Protein™ Standards（Bio-Rad）作为分子量标准。上样前，样品在含β-巯基乙醇和SDS的上样缓冲液中于95°C变性3分钟。
【数据】离心：6000g、10 min、4°C；过滤：0.22 µm；浓缩截留：10 kDa；阳离子交换柱：Resource™ S 1 mL；NaCl梯度：0–1 M；rhMPO洗脱：200–700 mM NaCl；全酶洗脱：~400 mM NaCl；流速：1 mL/min；馏分：0.5 mL；SEC柱：Hiload® 26/600 Superdex® 200；上样量：<13 mL；洗脱：50 mM TRIS pH 7.5等度、1 mL/min；监测波长：280/410 nm；重构条件：50 µM血红素、0.75 mM氧化型谷胱甘肽、4°C过夜；SDS-PAGE上样量：rhMPO 2.7 µg（银染）、嵌合体68 µg（考马斯亮蓝G250）；变性：95°C、3 min
2.9 蛋白浓度测定
纯化后获取UV-可见光谱。活性位点酶浓度根据280 nm吸光度计算，使用分子消光系数：rhMPO、rhMPO-GOx、rhMPO-LEKREAEA-GOx、GOx（GOx的生产和纯化见补充信息）分别为88.81、183.12、183.12和94.43 mM⁻¹·cm⁻¹。Rz值（ Rheinheitzahl系数）通过Soret带吸光度（400–430 nm）除以280 nm吸光度计算。
【数据】消光系数：rhMPO 88.81、rhMPO-GOx 183.12、rhMPO-LEKREAEA-GOx 183.12、GOx 94.43 mM⁻¹·cm⁻¹；Rz = A₄₀₀₋₄₃₀/A₂₈₀
2.10 色氨酸荧光淬灭
荧光实验在JASCO FP−8300光谱仪上进行。
【数据】仪器：JASCO FP−8300
研究结果
3.1 生产、纯化与生化表征
选择毕赤酵母作为表达宿主，因其作为低等真核生物具有优势，包括能将目的酶分泌至培养基中，以及与简便生产方案的兼容性。两种酶均使用两种不同方案在毕赤酵母中表达：一种基于BMMG/Y培养基（略作修改的Invitrogen™指南），另一种使用MMH培养基。鉴于rhMPO的理论等电点（pI），采用阳离子交换色谱实现酶的一步纯化。嵌合体（无论是否含接头）的理论pI为7.99。虽然可以使用Source™ 30S或Resource™ S柱纯化，但为获得更高产量，优先选择尺寸排阻色谱。作为参照，还分析了从人中性粒细胞纯化的商业天然hMPO（其UV-可见光谱见Figure S2）。rhMPO阳离子交换色谱和嵌合体尺寸排阻色谱的代表性色谱图分别如图2A和Figure S3所示。
监测280、260和410 nm吸光度以评估蛋白及其血红素辅基的存在。使用BMMG/Y方案生产的酶表现出部分重构，批次中10 ± 1%为全酶形式。在阳离子交换色谱过程中，由于rhMPO的高pI，只有rhMPO结合到柱上并被选择性洗脱。图2A中，绿色和红色馏分分别收集。图2B所示的UV-可见光谱表明，绿色馏分中的蛋白成功与血红素重构，确认为全酶形式。相比之下，缺乏410 nm吸收的蛋白红色馏分被指定为脱辅基形式。
一个主要限制是低生产产量，每升仅约8 µg全酶（表1）。使用MMH培养基时，酶主要以脱辅基形式产生。血红素重构后评估活性，获得170 µg rhMPO（表1，第3列）。虽然产量高于BMMG/Y培养基，但仍相对较低。
通过连续添加递增浓度的游离血红素研究脱辅基形式的色氨酸荧光淬灭（图2C）。血红素添加诱导了约35%初始信号的荧光淬灭，直至1.5 µM血红素，从而确定解离常数（KD）为16.5 ± 7.8 nM（图2D）。有趣的是，血红素结合还诱导最大发射波长从332 nm红移至341 nm，提示色氨酸环境更亲水。
脱辅基形式（rhMPO或嵌合体）纯化后在过夜进行重构方案。图1E和1F显示，虽然酶溶液中存在血红素，但rhMPO的Rz值（表1）不适用（无可观察到的Soret带），嵌合体的Rz值也低于在毕赤酵母中直接以全酶形式生产和纯化的酶。表1总结了不同批次酶获得的Rz值，这些酶或在宿主中直接以全酶形式产生，或在纯化后体外重构。结果表明，特征性的卟啉体系Soret带（约400–430 nm）根据血红素插入方式的不同而调节——是在宿主内翻译后成熟过程中插入，还是在体外重构后插入。这提示酶-血红素相互作用以及血红素周围的正确折叠在这两种过程之间可能存在差异。
纯化蛋白的电泳图谱通过变性SDS-PAGE显示（图2G）。诱导72小时后，SDS-PAGE显示rhMPO在约75、35和14 kDa处有三个明显条带（图2G，左）。75和14 kDa条带分别对应hMPO的大亚基和小亚基。35 kDa条带可能是大亚基的降解产物，由酶在SDS存在下热诱导变性（95°C）所致。此前已有报道称，从人血液纯化的MPO[35]以及在毕赤酵母中生产的重组人嗜酸性粒细胞过氧化物酶（rhEPO）[36]均表现出该行为。对于嵌合体，约140 kDa处观察到的条带可能对应前酶，rhMPO大亚基和小亚基之间没有切割。
ABAH被确认为rhMPO活性的抑制剂，无论是对游离酶还是嵌合体中的酶。对于rhMPO，确定了IC₅₀值为2.69 ± 1.17 µM（图2H和表1）。
【数据】BMMG/Y方案全酶比例：10 ± 1%；BMMG/Y产量：~8 µg全酶/L；MMH方案产量：170 µg rhMPO；荧光淬灭：~35%（至1.5 µM血红素）；KD：16.5 ± 7.8 nM；发射波长红移：332→341 nm；SDS-PAGE条带：rhMPO 75/35/14 kDa、嵌合体~140 kDa；IC₅₀（ABAH）：2.69 ± 1.17 µM
3.2 酶学表征
随后进行活性测定以确定不同批次酶的稳态动力学参数。使用APF评估游离rhMPO或嵌合体中rhMPO的HOCl产生。游离rhMPO以H₂O₂为底物，而嵌合体的GOx结构域以葡萄糖为底物。GOx活性通过使用Megazyme®试剂盒监测葡糖酸内酯的产生来评估。首先分析氯离子依赖性活性。饱和曲线见Figure S4，动力学参数汇总于表1。与偶联酶系统的动力学轨迹比较见Figure S5。
使用APF方法，天然酶（表1，第1列）对H₂O₂的KM约为3.8 ± 2.0 µM，受H₂O₂强烈抑制，比活性为0.022 ± 0.015 U/mg。这些值作为评估毕赤酵母中产生的重组酶质量的参考。全酶rhMPO（表1，第2列）对H₂O₂的KM为5.13 ± 2.39 mM，不受H₂O₂抑制。kcat为0.033 ± 0.008 s⁻¹，比活性为0.025 ± 0.006 U/mg。这些结果表明天然和重组rhMPO的比活性相当，而rhMPO对H₂O₂的更高耐受性有利于应用。
天然和重组全酶rhMPO的NaCl饱和曲线相当，比活性无显著差异。此外，尽管经过重构，酶对H₂O₂和NaCl的比活性比BMMG/Y培养基中产生的天然或全酶rhMPO低100倍。
对于嵌合体，BMMG/Y培养基中的生产导致低产量（表1，第4列），但全酶形式表现出清晰的Soret带和相当的rhMPO比活性（0.088 ± 0.066 vs 0.022 ± 0.001 U/mg）。H₂O₂的KM与BMMG/Y培养基中产生的rhMPO相似，表明GOx结构域的掺入未损害rhMPO活性。当使用葡萄糖作为底物时，未检测到rhMPO活性。然而，使用Megazyme®试剂盒观察到葡糖酸内酯产生（0.256 ± 0.025 h⁻¹），证实GOx结构域具有活性，尽管其产生的H₂O₂可能不足以维持rhMPO活性。
最后，嵌合体使用MMH培养基生产。无论是否存在接头（表1，第5–7列），均观察到Soret带，且血红素重构步骤后Rz值增加（表1，第7列）。使用MMH培养基，嵌合体活性可通过葡萄糖和NaCl作为底物检测到，可能反映了增强的GOx活性。重构前生产产量超过17 mg/L。虽然重构前活性较低，但血红素重构将活性恢复到仅比天然酶或BMMG/Y培养基中产生的rhMPO低约3倍的水平。体外实验表明，嵌合体中的rhMPO在H₂O₂浓度至少高达100 mM时不受抑制（Figure S4J）。根据嵌合体中GOx和rhMPO的动力学参数（表1），计算得出GOx每小时产生79 mM H₂O₂，而rhMPO每小时消耗342 mM H₂O₂。
【数据】天然酶KM（H₂O₂）：3.8 ± 2.0 µM；天然酶比活性：0.022 ± 0.015 U/mg；rhMPO KM（H₂O₂）：5.13 ± 2.39 mM；kcat：0.033 ± 0.008 s⁻¹；比活性：0.025 ± 0.006 U/mg；重构酶比活性降低：100倍；嵌合体（BMMG/Y）比活性：0.088 ± 0.066 U/mg；葡糖酸内酯产生：0.256 ± 0.025 h⁻¹；MMH产量：>17 mg/L（重构前）；重构后活性恢复：比天然酶低~3倍；H₂O₂耐受：≥100 mM；GOx产H₂O₂速率：79 mM/h；rhMPO消耗H₂O₂速率：342 mM/h
讨论与解读
本研究使用两种方案在毕赤酵母中生产单独或与GOx融合的rhMPO。两种方案的主要区别在于所用培养基。BMMY/G培养基为供应商推荐，而MMH培养基操作更简便，无需离心即可从酵母生长相切换至甲醇诱导蛋白表达。BMMY/G方案条件为：500 mL培养体积、72小时诱导、不添加血红素或钙、培养温度28°C。MMH方案产量更高，嵌合体每升培养可获得超过15 mg酶。
评估酶质量的关键指标包括Rz值、比活性、血红素辅基存在与否、SDS-PAGE检测大小亚基以及ABAH敏感性。两种生产方案的主要结论是酶数量与质量之间存在权衡：更高的酶产量伴随不完全的翻译后成熟，包括血红素辅基缺失和大小亚基切割不完全。体外重构可部分恢复活性，但重构酶的比活性比直接以全酶形式产生的酶低约100倍。嵌合体的设计成功实现了GOx与rhMPO的融合表达，但BMMG/Y方案中GOx产生的H₂O₂不足以驱动rhMPO活性；MMH方案中活性可被检测到，且重构后活性恢复至仅比天然酶低约3倍。基于动力学参数计算，GOx产H₂O₂速率（79 mM/h）低于rhMPO消耗速率（342 mM/h），表明H₂O₂供给是嵌合体活性的限制因素。
编译者解读
本研究展示了毕赤酵母作为MPO生产平台的可行性，核心价值在于"酵母生产+双功能融合"的组合策略——既规避了从人血纯化的伦理与成本限制，又通过GOx融合实现自产H₂O₂，为自驱动抗菌体系奠定基础。方法上，MMH方案的高产量（>17 mg/L）与体外重构策略形成互补，但重构酶活性损失100倍这一代价提示翻译后成熟机制仍需深入解析。从合成生物学应用角度看，若能在酵母内实现高效的血红素掺入（如共表达血红素合成途径或优化折叠辅助因子），将显著提升该平台的经济性。此外，酶在硅酮表面的吸附固定化研究为抗菌涂层开发提供了直接路径，但固定化条件下的酶活保留率与稳定性数据原文未详述，值得后续研究补充。
参考来源
期刊：Enzyme and Microbial Technology, 2026
DOI：10.1016/j.enzmictec.2026.110923
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110923