来源：Engineering Pichia pastoris for high-level biosynthesis of squalene（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
角鲨烯作为三萜类化合物的关键前体，在化妆品、食品和制药行业具有广泛用途。本研究以甲基营养型酵母——毕赤酵母（Pichia pastoris）为底盘，通过重构甲羟戊酸（MVA）途径与甲醇利用途径、筛选外排转运蛋白、结合转录组分析和5-L发酵罐补料分批发酵，最终实现20.80 g/L的角鲨烯产量——这是迄今以有机一碳化合物为碳源报道的最高产量。研究为毕赤酵母作为一碳平台生产高值化学品和生物燃料奠定了基础。
研究背景
异戊二烯类化合物是种类繁多的天然产物，具有多样的生物学功能。角鲨烯（C₃₀H₅₀）作为高价值的无环三萜类化合物，是动物、植物和真菌体内胆固醇、植物甾醇和麦角甾醇合成的中间体。这种具有抗氧化和抗癌活性的功能性脂质在化妆品、食品、营养品和制药行业具有多重价值。然而，从天然资源中提取角鲨烯的来源有限，通过微生物生产可提供可持续的供应途径。已有研究利用酿酒酵母、大肠杆菌、微藻和解脂耶氏酵母等微生物从糖类生产角鲨烯。毕赤酵母因其强诱导型启动子pAOX1、丰富的基因编辑工具、廉价碳源获取途径、高密度培养能力、快速生长和独特代谢模式而被广泛用于蛋白质生产。但与蛋白质生产不同，化学品过量生产需要大幅重构代谢网络以驱动代谢流朝向目标分子。尽管毕赤酵母已被用于番茄红素、广藿香醇、虾青素等多种化学品的生产，但利用甲醇生产萜类化合物的微生物研究仍十分有限。本研究旨在通过优化和重构甲羟戊酸与甲醇利用途径，工程化改造毕赤酵母以甲醇为碳源高产三萜类角鲨烯。
研究方法
2.1 微生物培养
宿主菌株为毕赤酵母GS115（Invitrogen），大肠杆菌Top10（Invitrogen）用于基因构建和质粒扩增。重组酵母在30°C下培养于BMMY培养基（1%甲醇、1.34% YNB、2%蛋白胨、1%酵母提取物）或BMGY培养基（1%甘油、1.34% YNB、2%蛋白胨、1%酵母提取物）。大肠杆菌在37°C下培养于低盐LBL培养基或LB培养基。含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基用于培养携带质粒pMD18T的重组大肠杆菌。含zeocin（液体25 μg/mL，固体30 μg/mL）的LBL培养基用于培养含有pPIZCA或pENO1-Cas9质粒的大肠杆菌。5-L补料分批培养使用PTM1微量金属溶液（0.05% CoCl₂·6H₂O、0.6% CuSO₄·5H₂O、6.5% FeSO₄·7H₂O、0.002% H₃BO₃、0.008% NaI、0.5% H₂SO₄、0.02% Na₂MoO₄·2H₂O、2% ZnCl₂、0.3% MnSO₄·H₂O、0.02%生物素）和基础盐培养基（BSM）（1.147% MgSO₄、1.82% K₂SO₄、0.413% KOH、2.67% H₃PO₄、0.093% CaSO₄·2H₂O、0.435% PTM1、4%甘油）。补料策略遵循"毕赤酵母发酵过程指南"（Invitrogen），包括含1.2%（v/v）PTM1的甲醇溶液和含1.2%（v/v）PTM1的50%（w/v）甘油溶液。角鲨烯标准品购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。
【数据】菌株：毕赤酵母GS115、大肠杆菌Top10；温度：30°C（酵母）/37°C（大肠杆菌）；培养基：BMMY、BMGY、LB、LBL、BSM；抗生素浓度：氨苄青霉素100 μg/mL、zeocin 25 μg/mL（液体）/30 μg/mL（固体）
2.2 质粒构建
本研究所用质粒列于表S1。使用Uniclone One Step Seamless Cloning Kit（中国Genes and Biotech有限公司）进行质粒构建。以GS115基因组为模板，按照制造商方案使用KOD-FX（TOYOBO，东京，日本）通过PCR扩增内源基因。使用pENO1-Cas9-zeo-INT和pPIC9-ARS-Cen-ptRNA5-sgRNA模板组装游离型质粒pENO1-Cas9-sgRNA-zeo。利用在线工具http://chopchop.cbu.uib.no/设计sgRNA。所有质粒和引物均通过北京擎科生物科技有限公司的Sanger测序验证。所用sgRNA列于表S2。
【数据】PCR酶：KOD-FX；质粒：pMD18T、pPIZCA、pENO1-Cas9、pENO1-Cas9-sgRNA-zeo、pPIC9-ARS-Cen-ptRNA5-sgRNA；测序：Sanger测序
2.3 酵母菌株构建
图1列出了所有使用的酵母菌株。采用CRISPR-Cas9和Cre/loxP ZeoR标记循环方法[20–22]构建重组酵母菌株[11,23]。转化子经裂解后使用KOD-FX试剂盒通过菌落PCR验证。阳性转化子在48孔板中、1 mL YPD液体培养基中、800 rpm、30°C条件下培养，随后划线于YPD和YPDZ平板以进一步验证连续CRISPR-Cas9基因编辑。获得丢失游离型质粒的阳性菌株。
图1 构建酵母菌株
【数据】培养条件：800 rpm、30°C、1 mL YPD液体培养基；验证方法：菌落PCR
2.4 工程酵母菌株的摇瓶培养
酵母种子培养物接种于含10 mL BMGY培养基的摇瓶（50 mL）中，在250 rpm、30°C下过夜培养。初始OD₆₀₀为1的主培养物转移至25 mL BMMY培养基中，在相同条件下培养48小时，每24小时添加新鲜1%（v/v）甲醇。发酵初期添加10%（v/v）十二烷以促进角鲨烯外排。
【数据】种子培养：50 mL摇瓶、10 mL BMGY、250 rpm、30°C、过夜；主培养：25 mL BMMY、初始OD₆₀₀=1、48 h、每24 h补加1%甲醇；十二烷：10%（v/v）
2.5 角鲨烯提取与定量
角鲨烯提取时，将600 μL乙酸乙酯和培养细胞各与1.5 g直径为0.5 mm的氧化锆珠（上海净信，中国）混合，使用冷冻研磨机在4°C下以55 Hz振荡30分钟[24]。混合物以14,000 rpm离心10分钟。使用配备火焰离子化检测器（FID）和HP-5色谱柱的GC（Agilent 7820 A，美国）分析上层有机相。柱温箱温度首先在100°C保持5分钟，以20°C/min升至200°C，再以5°C/min升至280°C。检测器温度维持在320°C。角鲨烯采用外标法定量。培养物以14,000 rpm离心2分钟收集上层有机相进行GC检测。
【数据】提取溶剂：乙酸乙酯600 μL；氧化锆珠：1.5 g、0.5 mm直径；研磨条件：4°C、55 Hz、30 min；离心：14,000 rpm、10 min；GC升温程序：100°C保持5 min→20°C/min至200°C→5°C/min至280°C；检测器温度：320°C
2.6 细胞干重（DCW）测定
细胞干重测定时，将2 mL细胞以7,000 rpm离心2分钟。去除培养基残留，用1 mL水洗涤2–3次，在80°C下烘干至恒重。结果以三次重复的平均值报告。
【数据】样品量：2 mL；离心：7,000 rpm、2 min；洗涤：1 mL水、2–3次；干燥：80°C至恒重；重复：3次
2.7 使用AutoDock Tools进行分子对接
氧甾醇结合同源（Osh）3的ORD结构域从UniProt数据库获取（https://www.uniprot.org/uniprotkb/F2QWG7/entry）。使用AutoDock Tools（版本1.5.6）进行分子对接。预测配体与蛋白口袋的结合，基于最低结合自由能选择最佳对接位点。使用PyMOL（版本2.2）进行分子对接可视化。
【数据】软件：AutoDock Tools 1.5.6、PyMOL 2.2；数据库：UniProt（F2QWG7）；筛选标准：最低结合自由能
2.8 转录组分析
重组菌株按上述方法培养并收获用于总RNA提取。在48小时（指数生长期）从细胞中分离总RNA样品，并在Next Seq 500系统（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）上测序。使用Bowtie2将RNA-seq读数比对至毕赤酵母GS115基因组（txid644223）。带注释的GS115基因组序列从NCBI获取（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/term=Komagataella+phaffii+GS115）。以P < 0.05和倍数变化> 1.5作为筛选差异表达基因（DEGs）的阈值，使用DESeq2进行基因表达分析。每个样品三次重复。
【数据】测序平台：Next Seq 500（Illumina）；比对工具：Bowtie2；DEGs筛选阈值：P < 0.05、倍数变化> 1.5；分析软件：DESeq2；取样时间：48 h（指数生长期）；重复：3次
2.9 补料分批发酵
1. 单菌落接种于50 mL YPD中，在30°C、250 rpm下培养30小时，然后将4%种子培养物转移至100 mL YPD培养基中，在相同条件下培养20小时。最后，将8%种子培养物转移至含BSM培养基的5-L发酵罐中，进行三阶段补料分批发酵。
2. 批次阶段（阶段I）涉及在BSM中初始细胞生长18–24小时，通过空气流量（2 L/min）和搅拌速度（1200 rpm）调节维持30%–40%溶解氧（DO），温度30°C，pH 5.5用25%氨水溶液（v/v）维持。
3. 补料分批阶段（阶段II）以限制性甘油补料开始以进一步促进细胞生长，直至OD₆₀₀达到220，之后停止甘油补料。
4. 诱导阶段（阶段III）涉及添加甲醇进行角鲨烯生物合成，DO维持在20%–30%，温度25°C，pH 6.0用25%氨水溶液（v/v）调节，搅拌速度如前所述控制。
【数据】种子培养：50 mL YPD、30°C、250 rpm、30 h；二级种子：100 mL YPD、4%接种量、20 h；发酵罐接种量：8%；阶段I：BSM、18–24 h、DO 30%–40%、空气流量2 L/min、搅拌1200 rpm、30°C、pH 5.5；阶段II：甘油限制补料至OD₆₀₀=220；阶段III：甲醇诱导、DO 20%–30%、25°C、pH 6.0
研究结果
3.1 工程化MVA途径以甲醇生产角鲨烯
毕赤酵母具有内源角鲨烯合成途径（图2A）。然而，野生型毕赤酵母GS115菌株中未检测到角鲨烯——其水平可能低于GC系统的检测限。作为MVA途径的代谢中间体，调控与MVA途径增强相关的酶编码基因对角鲨烯积累至关重要[25]。过表达影响角鲨烯生成的关键限速酶HMG-CoA还原酶的基因，可刺激3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA的转化[26,27]。因此，本研究尝试使用强诱导型启动子PAOX1过表达来自不同酵母宿主的MVA途径关键限速酶HMGR，以引导代谢流朝向角鲨烯生产。
如图2B所示，毕赤酵母GS115中内源HMGR的过表达比MVA途径中其他酶对角鲨烯合成产量的贡献更大，工程菌株SQ-1在摇瓶中48小时的角鲨烯滴度达到38.77 ± 0.95 mg/L。此外，不同来源的HMGR未影响重组菌株的生长状态（图S1）。
研究进一步优化了MVA途径以提高角鲨烯生物合成并为角鲨烯合成积累额外前体。过表达了在其他酵母中负责重要生物合成中间体的MVA途径酶基因，包括ERG20、ERG9、ERG8、ERG10、ERG12、ERG13和ERG19[28,29]。具体结果包括：过表达法尼基焦磷酸合酶基因ERG20——该基因对GPP向FPP的转化至关重要——使用强启动子pAOX1使角鲨烯产量增加至66.47 ± 1.18 mg/L（菌株SQ-2）。考虑到角鲨烯合酶基因ERG9[30]可能是角鲨烯合成的必需基因，在SQ-2中过表达ERG9基因获得菌株SQ-3，角鲨烯产量增加至84.83 ± 1.00 mg/L。进一步过表达ERG8和ERG10使角鲨烯产量提高至106.93 ± 1.18 mg/L（菌株SQ-4）。组合过表达编码MVA途径相关酶的ERG12、ERG13和ERG19基因，进一步将角鲨烯产量提高至127.35 ± 3.10 mg/L（菌株SQ-5），如图2C所示。
图2 在毕赤酵母中重构MVA途径。（A）毕赤酵母中MVA途径重构示意图。（B）不同来源HMG-CoA还原酶对毕赤酵母角鲨烯产量的影响。（C）MVA途径重构对角鲨烯产量的影响。
【数据】SQ-1角鲨烯滴度：38.77 ± 0.95 mg/L（48 h摇瓶）；SQ-2：66.47 ± 1.18 mg/L；SQ-3：84.83 ± 1.00 mg/L；SQ-4：106.93 ± 1.18 mg/L；SQ-5：127.35 ± 3.10 mg/L
3.2 限速酶基因的调控提高角鲨烯产量
与过表达MVA途径前体基因相比，HMGR在其他底盘细胞中促进了角鲨烯积累[31]。HMG-CoA还原酶在角鲨烯生产中的作用已有报道[32]。因此，研究通过CRISPR-Cas9[33]整合一个或两个拷贝的HMGR基因进一步增强MVA途径。获得以下工程菌株：菌株SQ-6（Int12位点整合1拷贝HMGR至菌株SQ-5）、菌株SQ-7（Int12位点整合2拷贝HMGR至菌株SQ-5）、菌株SQ-8（PNSII4位点整合1拷贝HMGR至菌株SQ-7）和菌株SQ-9（PNSII4位点整合2拷贝HMGR至菌株SQ-7）（图1）。
随着HMGR拷贝数的增加，工程菌株的角鲨烯滴度逐渐升高。与菌株SQ-5相比，携带六个拷贝HMGR的菌株SQ-9（317.59 ± 0.69 mg/L）的角鲨烯滴度增加了2.5倍（图3A）。这表明HMGR对促进毕赤酵母中角鲨烯合成至关重要。重组菌株的生长情况如图3B所示。因此，选择携带五个拷贝HMGR的菌株SQ-9进行后续研究。
图3 HMGR基因剂量对角鲨烯生产的影响。（A）各菌株的角鲨烯滴度和产量（mg/g DCW）。（B）各菌株的生长曲线。三次重复。
【数据】SQ-9角鲨烯滴度：317.59 ± 0.69 mg/L；较SQ-5提高：2.5倍；HMGR拷贝数：6个
3.3 促进角鲨烯的胞外分泌
细胞内萜类化合物积累导致的细胞毒性和储存限制[34]可通过外排蛋白增强产物外排有效解决[35]。萜烯外排作为一种新方法，可促进工业生产中产物的纯化和分离[36]。基于先前报道，Osh蛋白促进细胞器之间的脂质转运，Osh3是该家族中最可能结合酿酒酵母中角鲨烯的蛋白[37]，但在毕赤酵母中尚无相关报道。因此，研究探索将不同来源的Osh3整合至SQ-9中，观察其对细胞内角鲨烯分泌的影响（图4）。
不同Osh3来源之间角鲨烯分泌无显著差异，但毕赤酵母内源Osh3的总角鲨烯量最高，因此菌株SQ-9-Osh3(Pp)被用于后续研究。研究挖掘并筛选了参与甾醇转运的转运蛋白，以PDR5和SNQ2为对照，测试了初步筛选的内源转运蛋白STE6–2p、SEC61复合物和SRP-alpha——这些蛋白出现在文献报道中[36,38]。
对所选结合蛋白或转运蛋白与角鲨烯进行分子对接，并计算各自结合自由能。作为对照的PDR5（-4.97 kcal/mol）和SNQ2（-3.62 kcal/mol）均比本研究筛选的其他三种转运蛋白具有更高的结合自由能（图5A）。STE6–2p具有最低的结合自由能，表明它是最有前景且最易与角鲨烯结合的转运蛋白。这些转运蛋白与pTEF启动子偶联并整合至携带Osh3的菌株SQ-9（SQ-9-Osh3(Pp)）中。使用摇瓶发酵测试转运蛋白的效果。
与PDR5、SNQ2、SEC61复合物和SRP-alpha相比，STE6–2p的转运效率更好，转运效率达到18.60%，有效促进了角鲨烯外排并减轻了细胞内产物积累的负担（图5B）。这些结果表明毕赤酵母中角鲨烯分泌被成功促进。
图4 不同来源Osh3对菌株SQ-9细胞内角鲨烯外排的影响。Pp代表毕赤酵母，Sc代表酿酒酵母，Yl代表解脂耶氏酵母。三次重复。
图5 转运蛋白对角鲨烯分泌的促进作用。（A）所选转运蛋白与角鲨烯的分子对接构象和结合自由能，角鲨烯以橙色表示，转运蛋白以粉色表示。（B）摇瓶发酵测试转运蛋白。三次重复。
【数据】PDR5结合自由能：-4.97 kcal/mol；SNQ2结合自由能：-3.62 kcal/mol；STE6–2p转运效率：18.60%
3.4 优化甲醇利用途径进一步提升角鲨烯产量
乙酰-CoA是萜类化合物合成的关键前体。研究筛选了甲醇代谢途径中的基因（图6A）进行优化，以进一步提高角鲨烯产量并增强乙酰-CoA的上游代谢供应[39,40]。在重组菌株SQ-9中过表达了与甲醇利用途径相关的DAK、FBA1、RPE1–2、TKL以及与乙酰-CoA供应相关的Yhm2（来自酿酒酵母）。
基因TKL对角鲨烯积累的贡献最为显著（SQ-10）（图6B）。在此基础上，过表达DAK和RPE1–2获得菌株SQ-11，其角鲨烯滴度进一步增加至395.19 ± 5.17 mg/L（图6C），表明优化甲醇代谢途径可提高角鲨烯产量。重组菌株的生长情况如图6D所示。这些结果表明，过表达甲醇利用途径酶通过优化甲醇利用途径有助于驱动代谢流朝向乙酰-CoA生物合成。
图6 增强甲醇利用效率对角鲨烯生产的影响。（A）甲醇代谢途径示意图（红色标记基因表示过表达基因，绿色标记基因表示未表达基因）。（B）甲醇代谢途径中关键基因对角鲨烯生产的影响。（C）DAK和RPE1–2过表达对角鲨烯生产的影响。（D）菌株生长曲线。三次重复。
【数据】SQ-11角鲨烯滴度：395.19 ± 5.17 mg/L；过表达基因：DAK、FBA1、RPE1–2、TKL、Yhm2
3.5 特比萘芬对工程毕赤酵母生产角鲨烯的影响
特比萘芬是一种烯丙胺类合成抗真菌剂，是角鲨烯环氧酶的有效非竞争性抑制剂。这导致细胞内角鲨烯积累显著增加，同时减少角鲨烯流向麦角甾醇[41]。在酿酒酵母和解脂耶氏酵母中已有使用特比萘芬选择性抑制角鲨烯环氧酶（由ERG1基因编码）以增加细胞内角鲨烯滴度的报道[19,42,43]，但不同宿主中添加的浓度各异[6]。因此，确定合适的特比萘芬浓度对生产角鲨烯至关重要。
角鲨烯分泌菌株SQ-9-Osh3(Pp)可以成功分泌角鲨烯，但SQ-9-Osh3(Pp)的角鲨烯产量略低于甲醇利用途径优化菌株SQ-11（图1）。总体而言，工程菌株SQ-11中特比萘芬的浓度...
图7 特比萘芬对工程菌株SQ-11生产角鲨烯的影响。（A）工程菌株SQ-11在不同特比萘芬浓度下的产量。（B）细胞生长曲线。（C）CRISPR-dcpf1系统下调ERG1基因与特比萘芬选择性抑制ERG1基因的比较。
【数据】特比萘芬：烯丙胺类合成抗真菌剂；作用靶点：角鲨烯环氧酶（ERG1基因编码）
3.6 甲醇浓度对工程菌株SQ-11角鲨烯生产的影响
（本节原文未提供详细内容，仅提及图8展示了甲醇浓度对角鲨烯生产的影响。）
图8 甲醇浓度对工程菌株SQ-11角鲨烯生产的影响。（A）角鲨烯滴度和产量（mg/g DCW）。（B）菌株生长曲线。三次重复。
【数据】原文未详述
3.7 转录组分析
（本节原文未提供详细内容，仅提及图9展示了转录组分析结果。）
图9 转录组分析概览。（A）DEGs的KEGG通路富集分析。（B）角鲨烯合成及相关通路中DEGs的分析。向上箭头代表上调基因。三次重复。
【数据】原文未详述
3.8 5-L补料分批发酵生产角鲨烯
（本节原文未提供详细内容，仅提及图10展示了利用工程菌株SQ-11在5-L补料分批发酵中生产角鲨烯的结果。）
图10 利用工程菌株SQ-11在5-L补料分批发酵中生产角鲨烯。三次重复。
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过优化和重构MVA途径与甲醇利用途径，有效构建了毕赤酵母角鲨烯高产菌株。添加30 mg/L特比萘芬和0.5%甲醇作为碳源，摇瓶中最终角鲨烯滴度达到932.08 ± 11.64 mg/L。最终通过补料分批发酵，在5-L发酵罐中积累20.80 g/L角鲨烯，实现了以毕赤酵母为底盘从甲醇生产角鲨烯的最高产量。在高密度发酵过程中，消耗了1023.8 g甲醇，角鲨烯得率为0.076 g角鲨烯/g甲醇。此外，角鲨烯在毕赤酵母中成功实现了分泌，促进了角鲨烯的合成。这些发现为利用有机一碳作为碳源在毕赤酵母中过量生产高值化学品和生物燃料提供了新颖有效的策略和见解。
图11 构建了高效生产角鲨烯的毕赤酵母细胞工厂，为毕赤酵母作为有机一碳平台高效生产高值生物化学品和生物燃料奠定了基础。
编译者解读
本研究展示了甲醇作为一碳原料在萜类化合物生物制造中的巨大潜力。值得关注的是，作者不仅通过传统MVA途径重构提升产量，还创新性地将分子对接筛选的转运蛋白STE6–2p用于角鲨烯外排，缓解了产物积累的细胞负担——这种"分泌工程"策略对高疏水性萜烯的工业化生产具有借鉴意义。20.80 g/L的产量和0.076 g/g甲醇的得率已具备工业竞争力。不过，特比萘芬作为化学抑制剂的使用可能增加生产成本，未来若能通过CRISPR-dcpf1系统实现ERG1的动态调控替代化学抑制，将更符合绿色生物制造的理念。总体而言，该研究为甲醇基一碳生物炼制提供了可复制的范式。
参考来源
Zhang X. Engineering Pichia pastoris for high-level biosynthesis of squalene. Biochemical Engineering Journal, 2025. DOI: 10.1016/j.bej.2025.109677
DOI: 10.1016/j.bej.2025.109677