来源：Constructing CRISPR-Cas9 system for metabolic reprogramming and cordycepin biomanufacturing in Pichia pastoris（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
虫草素是一种主要由蛹虫草产生的核苷类似物，在食品、医药和饲料行业应用广泛。传统微生物工程面临抗生素抗性基因带来的环境风险。本研究利用优化的CRISPR-Cas9系统（gRNA-tRNA阵列与Brex27增强同源重组），在毕赤酵母中实现了无抗生素标记的虫草素生物合成。通过模块化代谢工程策略，工程菌株PC19在摇瓶发酵中达到2509.7 mg/L虫草素产量，在10 L生物反应器中通过补料分批发酵实现18.3 g/L的最高产量，CO₂当量排放比现有系统低3.3–57.6倍。
研究背景
虫草素（3′-脱氧腺苷）是一种天然核苷类似物，存在于蛹虫草、蝉花、冬虫夏草等子囊菌真菌中。虫草素具有抗菌、抗病毒、抗氧化、免疫调节和神经调节等多种生物活性，其抗癌潜力已在NUC-7738的I/II期临床试验中得到验证。化学合成虫草素面临产率低、手性控制困难、底物和催化剂昂贵、锡残留量高以及有机溶剂污染等问题。生物合成仍是虫草素的主要生产途径，但蛹虫草子实体经50–60天培养仅含2–3 mg/kg虫草素。虽然基因工程结合培养基优化可将蛹虫草菌丝体液态发酵产量提升至6.5–8.6 g/L，但仍需30–60天。两种生产方法都严重依赖小麦、大米和葡萄糖等食品来源原料。毕赤酵母作为甲基营养型酵母，具有强启动子、蛋白分泌能力和高密度发酵优势，是构建虫草素细胞工厂的理想底盘。
研究方法
2.1 菌株、质粒与基因
大肠杆菌DH5α用于质粒构建和扩增。毕赤酵母GS115（ATCC 20864）作为CRISPR-Cas9基因编辑平台和虫草素生产菌株的亲本菌株。所有质粒组装均通过重叠延伸PCR（OE-PCR）和Gibson组装（E2611S，New England BioLabs，MA，USA）完成。虫草素生物合成基因，包括氧化还原酶/脱氢酶（cns1，CCM_04436）、金属依赖性磷酸水解酶（cns2，CCM_04437）和核苷/核苷酸激酶（cns3/NK，CCM_04438），从蛹虫草CP1（CCTCC M2019671）中克隆。这些基因经毕赤酵母密码子优化后合成为Ppcns1、Ppcns2和Ppcns3/NK（Tsingke，北京，中国）。同样，来自大肠杆菌的cpdB基因（b4213）编码2′,3′-环核苷酸2′-磷酸二酯酶，经优化合成为PpcpdB（Tsingke，北京，中国）。磷酸二羟丙酮合酶（das1，PAS_chr3_0832）、过氧化物酶体生物发生因子8（pex8，PAS_chr1-4_0349）、磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶（purF，PAS_chr1-1_0430）、腺苷酸琥珀酸合酶（adss，PAS_chr4_0613）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（zwf1，PAS_chr2-1_0308）和磷酸甘油酸激酶（pgk，PAS_chr1-4_0292）的基因从毕赤酵母GS115基因组DNA中扩增获得。本研究使用的所有质粒、菌株、引物、基因和gRNA序列列于补充材料表S1-S5中。
【数据】菌株：E. coli DH5α、P. pastoris GS115（ATCC 20864）；基因来源：C. militaris CP1（CCTCC M2019671）；质粒组装方法：OE-PCR + Gibson assembly（E2611S，NEB）；基因合成：Tsingke，北京
2.2 培养基与培养条件
大肠杆菌在低浓度Luria-Bertani（LLB）培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨和5 g/L NaCl）、LLBZ（LLB含50 mg/L Zeocin）和LLBK（LLB含50 mg/L卡那霉素）中于37°C、150 rpm振荡培养。毕赤酵母菌株在30°C下培养于YPD（20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨和10 g/L酵母提取物）、YPDZ（YPD含100 mg/L Zeocin）、BMGY（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、13.4 g/L无氨基酸酵母氮碱（YNB）、100 mM磷酸钾（PBS）、4×10⁻⁴ g/L d-生物素和10 g/L甘油）、BMMY（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、13.4 g/L YNB、100 mM PBS、4×10⁻⁴ g/L d-生物素和1%（v/v）甲醇）、BMG（10 g/L甘油、13.4 g/L YNB、4×10⁻⁴ g/L d-生物素）、BMM（1%（v/v）甲醇、13.4 g/L YNB、4×10⁻⁴ g/L d-生物素）和BMD（20 g/L葡萄糖、13.4 g/L YNB、4×10⁻⁴ g/L d-生物素）培养基中，用于菌株筛选和虫草素生产。腺苷-3′-单磷酸（3′-AMP）购自Sigma-Aldrich（A9272，St Louis，MO，USA），用氢氧化铵调pH至7.5制备10 mg/mL储备液。NADPH和NADH购自Solarbio（N8100和N8120，北京，中国）。毕赤酵母高密度发酵使用基础盐培养基（BSM）并添加PTM1微量元素。补料分批培养在10 L发酵罐（BIOTECH-10JS，BXBIO，上海，中国）中进行，含4 L BSM和4.4 mL/L PTM1。毕赤酵母接种物在YPD培养基中制备，以10%（v/v）工作体积转移到BSM中。在20 h批次阶段，pH用25%氢氧化铵控制在5.0，温度30°C，通过搅拌（200–1000 rpm）和通气（2–6 vvm）维持溶解氧（DO）在30–50%。当DO超过60%时开始补料分批阶段，以25 mL/L/h连续补加含1.2%（v/v）PTM1的50%（m/v）甘油，pH维持在5.0。当OD₆₀₀达到300时，停止甘油补加进行2.5 h饥饿期。甲醇诱导以含1.2%（v/v）PTM1的100%甲醇以7.5 mL/L/h开始补加。在诱导阶段（至144 h），pH调节至5.5，DO通过增加搅拌（500–1000 rpm）和通气（4–8 vvm）维持在20–40%。
【数据】E. coli培养温度：37°C，150 rpm；毕赤酵母培养温度：30°C；LLB组成：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L NaCl；YPD组成：20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物；3′-AMP储备液：10 mg/mL，pH 7.5；10 L发酵罐：4 L BSM + 4.4 mL/L PTM1，接种量10%（v/v），批次阶段20 h，pH 5.0，温度30°C，DO 30–50%，搅拌200–1000 rpm，通气2–6 vvm；甘油补加速率：25 mL/L/h（50% m/v甘油+1.2% PTM1）；饥饿期：2.5 h；甲醇补加速率：7.5 mL/L/h（100%甲醇+1.2% PTM1）；诱导阶段：至144 h，pH 5.5，DO 20–40%，搅拌500–1000 rpm，通气4–8 vvm
2.3 CRISPR-Cas9系统的构建与优化
hCas9基因从质粒p414-TEF1p-Cas9-CYC1t（#43802，Addgene，MA，USA）扩增，随后与Kozak序列（CGGACC）、GAP启动子（pGAP）、AOX1终止子（tAOX1）、DAS1终止子（tDAS1）和SV40核定位信号（NLS）融合构建hCas9表达盒。从质粒pAO815扩增的PpHIS4-1和PpHIS4-2片段位于hCas9表达盒两侧，生成hCas9整合复合体。该复合体通过单交换重组插入毕赤酵母GS115基因组，产生菌株GS115-hCas9（ZBJ001）。为增强同源重组能力，将密码子优化的Brex27基序（ALDFLSRLPLPPPVSPICTFVSPAAQKAFQPPRSCG）通过（GGGGS）₃柔性连接肽融合到hCas9的C末端，形成hCas9-Brex27表达盒。将该表达盒通过单交换重组整合到毕赤酵母GS115基因组中，产生菌株GS115-hCas9-Brex27（ZBJ002）。pZBJ sgRNA质粒由sgRNA表达盒、Zeocin抗性标记、乳酸克鲁维酵母复制起点（panARS）和大肠杆菌复制起点（ori）组成。sgRNA表达盒包括TEF1启动子（PpTEF1）、tAOX1、毕赤酵母内源tRNA、三个IIs型限制性酶切位点（BsaI/BspQI/BbsI）和gRNA骨架。所有gRNA靶向序列使用CHOPCHOP设计。供体质粒骨架来源于质粒pPICKan的Kan-GJ片段。位于Cas9切割位点两侧的同源臂（约1 kb）从毕赤酵母GS115基因组DNA扩增。Kan-GJ片段、上下游同源臂、启动子、终止子和目标基因通过OE-PCR和Gibson组装整合到供体质粒中。供体质粒通过在LLBK平板上生长后经Sanger测序验证确认。使用GenePulser Xcell电穿孔系统共转化sgRNA质粒和供体DNA片段，转化菌株在YPDZ平板上培养3天。每次转化随机挑选20个菌落进行PCR确认。为消除sgRNA质粒，确认的阳性菌株在20 mL YPD培养基中培养24 h，然后划线到YPD平板上。通过在YPDZ平板上复制接种确认质粒成功消除。
【数据】hCas9来源：p414-TEF1p-Cas9-CYC1t（Addgene #43802）；Kozak序列：CGGACC；Brex27基序：ALDFLSRLPLPPPVSPICTFVSPAAQKAFQPPRSCG；连接肽：（GGGGS）₃；同源臂长度：约1 kb；电转化：GenePulser Xcell（Bio-Rad）；YPDZ平板培养：3天；阳性克隆筛选：每转化20个；质粒消除：20 mL YPD培养24 h
2.4 酵母双杂交实验
蛋白-蛋白相互作用通过Clontech Matchmaker Gold酵母双杂交系统（No.630489，TaKaRa，东京，日本）验证。PpRad51和Brex27分别整合到质粒pGADT7和pGBKT7中，与GAL4 DNA激活域（DNA-AD）和GAL4 DNA结合域（DNA-BD）融合，分别作为猎物和诱饵构建体。在Y2HGold化学感受态细胞中共转化后，使用SC-Leu-Trp、SC-Leu-Trp-His-Ade和含X-α-Gal的SC-Leu-Trp-His-Ade缺失平板分析酵母双杂交结果。
【数据】酵母双杂交系统：Clontech Matchmaker Gold（TaKaRa No.630489）；分析平板：SC-Leu-Trp、SC-Leu-Trp-His-Ade、SC-Leu-Trp-His-Ade + X-α-Gal
2.5 虫草素的分析与鉴定
虫草素标准品（SC8470，Solarbio，北京，中国）和过滤发酵液（0.22 μm，Pall，NC，USA）在配备Zorbax SB-C18色谱柱（Agilent Technologies，CA，USA）的Ultimate 3000 HPLC系统（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）上分析。流动相由10 mmol/L乙酸水溶液（相A）和1:1（v/v）甲醇-乙腈混合物（相B）组成。色谱分离以25 μL进样量在40°C柱温下进行，检测波长为260 nm。质谱参数包括3200 V喷雾电压、300°C毛细管和探针加热器温度、40 Arb鞘气流量、8 Arb辅助气流量和100 µA最大喷雾电流。
【数据】HPLC系统：Ultimate 3000（Thermo Fisher）；色谱柱：Zorbax SB-C18；流动相：10 mmol/L乙酸（A）+ 1:1甲醇-乙腈（B）；进样量：25 μL；柱温：40°C；检测波长：260 nm；质谱：喷雾电压3200 V，温度300°C，鞘气40 Arb，辅助气8 Arb，最大喷雾电流100 µA
2.6 NADPH/NADP⁺比值和ATP含量分析
毕赤酵母细胞在8000g、4°C离心2 min后，用磷酸盐缓冲液（10 mM，pH 6.0）洗涤两次。胞内NADPH/NADP⁺比值和ATP含量的测定方法原文未详述。
【数据】离心：8000g，4°C，2 min；洗涤缓冲液：10 mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0；NADPH/NADP⁺和ATP测定方法：原文未详述
研究结果
3.1 通过gRNA-tRNA阵列优化sgRNA质粒构建
CRISPR-Cas9系统需要sgRNA和Cas9协同作用实现靶向基因组编辑。前期研究表明，人密码子优化的hCas9在靶向效率上优于化脓性链球菌SpCas9和毕赤酵母PpCas9。本研究通过单交换重组，利用野生型HIS4基因作为同源臂，将hCas9整合到毕赤酵母GS115基因组（His4⁻，p.C557R）中，产生菌株GS115-hCas9（ZBJ001，His4⁺，p.557C）（图1A）。这种遗传互补恢复了组氨酸原养型，增强了细胞生长和目标产物合成（图1A）。
传统sgRNA载体依赖HH/HDV核酶自切割进行5′-3′加工，而同源依赖性切割机制将可变区从20 bp扩展到63 bp，增加了载体构建成本并限制了多重编辑。gRNA-tRNA阵列通过提高sgRNA组装效率解决了这一限制。gRNA-tRNA阵列使用毕赤酵母内源tRNA（tRNA1，72 bp；tRNA3，80 bp；tRNA4，85 bp；tRNA5，72 bp）设计（图1B）。位于tRNA和gRNA骨架两侧的三个IIs型限制性酶切位点（BsaI、BspQI、BbsI）可在线性化pZBJ质粒中实现gRNA的快速替换（图1B）。
为评估NHEJ效率，研究以ZBJ001菌株中的甘油激酶基因gut1为靶点。BMG平板检测显示，通过BspQI（98.4%）进行的ΔGUT1编辑显著超过BsaI（84.1%）和BbsI（71.4%）的结果（图1C）。这种差异可能源于tRNA自切割效率的不同。NHEJ介导的DSB修复在gut1位点产生了三种突变类型，包括单碱基缺失、双碱基缺失和单碱基插入（图1D）。
【数据】gRNA-tRNA阵列：tRNA1 72 bp、tRNA3 80 bp、tRNA4 85 bp、tRNA5 72 bp；ΔGUT1编辑效率：BspQI 98.4%、BsaI 84.1%、BbsI 71.4%；突变类型：单碱基缺失、双碱基缺失、单碱基插入
3.2 通过Brex27与hCas9融合表达增强HDR效率
多重基因组整合方法对于复杂酶促途径的快速组装至关重要，需要高效的HDR系统用于底盘细胞工程。本研究使用甘油激酶GUT1、醇氧化酶AOX1和组氨酸多功能酶HIS4三个报告基因，在BMG、BMM和BMD平板上评估多重编辑性能（图2A）。GS115-hCas9-Brex27菌株（ZBJ002，His4⁺，p.557C，Brex27）对ΔGUT1、ΔGUT1-ΔAOX1和ΔGUT1-ΔAOX1-ΔHIS4的HDR敲除率分别达到93.7%、87.3%和81.0%，显著超过ZBJ001菌株（77.8%、31.7%和20.6%）（图2B、C和D）。
观察到的HDR效率低于总靶向效率，因为NHEJ介导的敲除发生在部分选定的营养缺陷型克隆中。这一现象通过模拟分析、PCR扩增和Sanger测序得到系统验证。Cas9-Brex27融合通过Brex27介导的RAD51招募到DSB位点，将HDR效率提高2–3倍。该机制促进RAD51-ssDNA核蛋白丝形成和d-loop生成。前期研究证明了Brex27介导的ScRAD51在酿酒酵母中的富集。序列比对显示ScRAD51与hRAD51的氨基酸同一性为50.12%，而PpRAD51与hRAD51的同源性更高（56.47%）。酵母双杂交实验证实Brex27通过直接蛋白相互作用招募PpRAD51（图2E和F）。这些发现表明，hCas9-Brex27系统通过在DSB位点局部富集PpRAD51来增强毕赤酵母的HDR效率。
【数据】ZBJ002 HDR敲除率：ΔGUT1 93.7%、ΔGUT1-ΔAOX1 87.3%、ΔGUT1-ΔAOX1-ΔHIS4 81.0%；ZBJ001 HDR敲除率：ΔGUT1 77.8%、ΔGUT1-ΔAOX1 31.7%、ΔGUT1-ΔAOX1-ΔHIS4 20.6%；HDR效率提升：2–3倍；ScRAD51与hRAD51氨基酸同一性：50.12%；PpRAD51与hRAD51同源性：56.47%
3.3 毕赤酵母中虫草素生物合成途径的构建与优化
虫草素生物合成直接受cns1和cns2控制，其直接前体3′-AMP来源于mRNA降解和腺苷转化途径（图3A）。HPLC分析显示标准品和发酵虫草素的保留时间相同（10.9 min），标准品回收率为98.8%至100.7%（图3B）。质谱确认工程毕赤酵母产生虫草素，分子量（251.24）和质荷比（标准品252.10873 vs. 样品252.10890）匹配（图3B）。
在虫草素高产的蛹虫草中，cns1的转录水平比cns2和cns3高2–5倍。在毕赤酵母甲醇诱导型启动子中，pAOX1和pDAS2表现出强诱导，pCAT1（约为pAOX1活性的50%）中等诱导，pFLD1（约为pAOX1活性的30%）弱诱导。结果表明，Ppcns2在pFLD1、pCAT1和pDAS2启动子下的表达水平分别达到Ppcns1表达水平的41.1%、59.1%和102.2%。pAOX1-pFLD1组合获得最高虫草素产量（1709.7 mg/L），其次是pAOX1-pCAT1（1483.3 mg/L）和pAOX1-pDAS2（1388.9 mg/L）（图3C）。这与解脂耶氏酵母研究中强pTEF-cns1和弱pFBA-cns2最大化虫草素生产的结果一致。
基因拷贝数扩增是提高目标产物产量的常用策略，但与PC01相比，PC04和PC05的虫草素产量未能显著提高（图3C）。这表明PC01中Ppcns1和Ppcns2表达充足，限速步骤位于3′-AMP上游。补料分批发酵中添加350 mg/L 3′-AMP使虫草素产量提高到1999.2 mg/L，3′-AMP转化率达82.7%（图3C）。添加后立即进行HPLC分析检测到明显的3′-AMP峰，但这些峰在2–4 h内消失，表明完全消耗。对于胞内检测，细胞在1000–1300 bar下用AH-NANO高压均质机（ATS Engineering，Brampton，Canada）裂解15个循环，提取缓冲液pH为7.5。在7天期间，发酵液和细胞裂解液中均未检测到3′-AMP。同时，几乎所有虫草素和腺苷都分泌到发酵液中。这些观察结果表明毕赤酵母中3′-AMP储存极少，由PpCns2和PpCns1催化快速转化为虫草素。与前期发现一致，毕赤酵母GS115中3′-AMP未检测到。
PpCns3/NK磷酸化腺苷产生3′-AMP，而PpCpdB通过激活mRNA降解途径增强3′-AMP供应（图3A）。过表达PpCns3、PpCns3/NK、PpCpdB及其组合使PC06-PC10的虫草素产量相比PC01显著提高10.6%、9.6%、6.0%、13.6%和15.7%（图3C）。作为比腺苷更直接的前体，细胞中有限的3′-AMP可用性是高产虫草素生产的主要瓶颈。
【数据】HPLC保留时间：10.9 min；标准品回收率：98.8%–100.7%；分子量：251.24；质荷比：标准品252.10873 vs. 样品252.10890；cns1转录水平：比cns2和cns3高2–5倍；Ppcns2相对表达水平：pFLD1下41.1%、pCAT1下59.1%、pDAS2下102.2%；虫草素产量：pAOX1-pFLD1 1709.7 mg/L、pAOX1-pCAT1 1483.3 mg/L、pAOX1-pDAS2 1388.9 mg/L；3′-AMP添加：350 mg/L，产量1999.2 mg/L，转化率82.7%；3′-AMP消耗时间：2–4 h；高压均质：1000–1300 bar，15循环；PC06-PC10产量提升：10.6%、9.6%、6.0%、13.6%、15.7%
3.4 甲醇同化、前体增强和辅因子供应的组合代谢工程提高虫草素产量
除cns1-3基因簇和mRNA降解途径外，虫草素生物合成还涉及碳代谢、嘌呤代谢以及ATP和NADPH辅因子供应的协调调控。甲醇在毕赤酵母中既是诱导剂又是产物积累期间的唯一碳源。增强过氧化物酶体甲醇同化已被证明可有效提高广藿香醇、脂肪酸、脂肪醇和3-羟基丙酸的生产。原文此部分后续内容未在节选范围内详细展开。
【数据】甲醇双重角色：诱导剂 + 唯一碳源；原文未详述更多参数
3.5 高密度发酵实现低碳高效合成虫草素
通过高密度发酵在毕赤酵母细胞工厂中实现了虫草素的低碳高效合成（图5A）。不同细胞工厂合成每公斤虫草素的CO₂当量排放对比显示，本研究构建的毕赤酵母系统CO₂-eq排放比蛹虫草和其他微生物细胞工厂低3.3–57.6倍（图5B）。
【数据】最高产量：18.3 g/L（3.05 g/L/d和122.2 mg/g DCW）；CO₂-eq排放：比现有系统低3.3–57.6倍
讨论与解读
本研究通过gRNA-tRNA阵列和Brex27增强同源重组优化CRISPR-Cas9系统，实现了无抗生素标记的虫草素生物合成。工程毕赤酵母PC19在10 L生物反应器中达到18.3 g/L的最高报道产量，CO₂-eq排放比现有系统低3.3–57.6倍。模块化代谢策略——包括3′-AMP供应改善（+15.7%）、甲醇同化增强（+6.8%）、前体供应强化（+14.5%）和ATP/NADPH平衡（+7.1%）——共同推动了产量提升。该研究确立了毕赤酵母作为虫草素低碳生物合成的优良底盘细胞，展示了合成生物学推动可持续生物制造的潜力。
编译者解读：该研究的技术亮点在于将CRISPR-Cas9系统本身作为代谢工程的使能工具加以系统优化——gRNA-tRNA阵列解决了多重编辑的构建瓶颈，Brex27融合将HDR效率提升2–3倍，无抗生素标记的设计契合了工业菌株的环境安全要求。从合成生物学应用角度看，18.3 g/L的产量和3.3–57.6倍的碳减排优势使毕赤酵母成为虫草素商业化生产的极具竞争力的底盘。值得关注的是，3′-AMP供应被确认为限速瓶颈，这为其他核苷类似物的细胞工厂构建提供了可借鉴的代谢分析范式。原文未详述的部分（如NADPH/NADP⁺和ATP的具体测定数值）有待查阅全文获取。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2025
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132967
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132967