来源：Biocatalytic synthesis of margarine fat with zero-trans and low saturated fatty acids by Pichia pastoris lipase immobilized on resin（Food Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
传统人造奶油生产依赖部分氢化或分提工艺，不可避免地产生工业反式脂肪酸或高含量饱和脂肪酸。本研究将毕赤酵母脂肪酶（PPL）固定于大孔环氧树脂ES-108上，在无溶剂体系中催化高油酸葵花籽油（HOSO）与棕榈硬脂（PS）酯交换，合成零反式、低饱和脂肪酸的人造奶油脂肪。优化条件下酯交换度达99.67%，固定化酶连续使用六个批次活性稳定，产物具有理想的β′晶型和33.5 °C滑熔点。
研究背景
人造奶油作为常见黄油替代品，传统上通过植物油部分氢化或分提制造。这些工艺虽改善了熔融特性、涂抹性和氧化稳定性，却产生了工业反式脂肪酸或高含量饱和脂肪酸。流行病学研究证实，少量工业反式脂肪酸或过量饱和脂肪酸摄入与心血管疾病、胰岛素抵抗和慢性炎症风险相关。全球监管机构已要求消除工业反式脂肪酸并降低饱和脂肪酸含量，促使低饱和、零反式人造奶油成为开发热点。
酯交换作为替代方案正在兴起，但化学催化剂诱导的随机酰基迁移会产生8–12%不良三酰甘油（TAG）区域异构体，对结晶行为和口感产生负面影响。这些挑战要求设计兼顾功能性能与营养改善的人造奶油脂肪新策略。
研究方法
2.1 材料
棕榈硬脂（PS，52 °C）由益海粮油工业有限公司（中国广州）提供。高油酸葵花籽油（HOSO）购自中国郑州当地超市。液态毕赤酵母脂肪酶购自武汉远城科技发展有限公司。Lipozyme TL IM是诺维信公司（丹麦Bagsvaerd）生产的固定化sn-1,3特异性脂肪酶。ES-108（含179 μM环氧基/克；粒径150–300 μm）、ES-103B（含188 μM环氧基/克；粒径150–300 μm）和ESR-2购自天津南开和成科技有限公司。环氧载体LX-1000EP（含101 μM环氧基/克；粒径150–300 μm）和氨基树脂LX-1000EA购自西安蓝晓科技新材料有限公司。其他试剂为分析纯或高效液相色谱纯。
【数据】菌株：毕赤酵母；载体：ES-108（179 μM环氧基/g）、ES-103B（188 μM环氧基/g）、LX-1000EP（101 μM环氧基/g）；粒径：150–300 μm
2.2 毕赤酵母脂肪酶的固定化与表征
液态脂肪酶按照Petkar等人（2006）的方法稍作修改进行固定化。首先，20 g环氧树脂载体用0.2 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）预洗六次。同时，将氨基树脂加入含固定体积0.2 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）和50%戊二醛的500 mL锥形瓶中，在摇床上25 °C振荡2 h进行预处理。将等体积磷酸盐缓冲液引入锥形瓶以稳定毕赤酵母脂肪酶。充分均质后，将预处理后的树脂加入反应体系启动酶固定化。随后，混合物在摇床上25 °C振荡12 h，再静置12 h。固定步骤完成后，脂肪酶溶液经抽滤，用0.2 M磷酸盐缓冲液冲洗直至滤液中检测不到蛋白质。固定化脂肪酶最终在45 °C真空干燥箱中干燥16 h，随后保存在4 °C冰箱中备用。固定化效率和酶活性按照Li等人（2024）和Xie等人（2024）的方法测定。采用FT-IR光谱评估毕赤酵母脂肪酶在树脂载体上的固定化效率并考察固定化酶的二级结构。此外，使用德国Leica SP2共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察固定化脂肪酶的微观结构，固定化脂肪酶用尼罗蓝染色。
【数据】载体量：20 g；缓冲液：0.2 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）；戊二醛浓度：50%；预处理：25 °C、2 h；固定化：25 °C、12 h振荡+12 h静置；干燥：45 °C、16 h；保存：4 °C
2.3 酶法酯交换
将30 g HOSO和PS底物熔化后加入150 mL三颈圆底烧瓶，在恒温油浴中加热并以800 rpm搅拌。在真空条件（0.09 MPa）和恒定搅拌速度（800 rpm）下考察酶添加量（6%–20%，基于底物总重量）、反应时间（1–90 min）和反应温度（45–70 °C）的影响。反应完成后，反应物在8000 rpm离心5 min，收集酯交换脂肪供进一步分析。同时考察固定于ES-108环氧树脂上的PPL的可重复使用性。每个反应循环后，固定化脂肪酶通过8000 rpm离心5 min从反应混合物中分离，随后用石油醚和磷酸盐缓冲液洗涤（Feng等，2020）。
【数据】底物量：30 g；搅拌速度：800 rpm；真空度：0.09 MPa；酶添加量：6%–20%；反应时间：1–90 min；反应温度：45–70 °C；离心：8000 rpm、5 min
2.4 酯交换脂肪的表征
#### 2.4.1 固体脂肪含量与滑熔点
固体脂肪含量（SFC）使用Bruker PC/20脉冲核磁共振仪（p-NMR，Bruker PC/20 Series Minispec，Bruker Optics，Ltd.，Milton，Ontario，Canada）低分辨率核磁共振直接测定。简要步骤：熔化样品在80 °C加热30 min以消除预先存在的晶体结构效应。随后，样品在0 °C冷藏90 min，然后在5 °C至50 °C温度范围内测定SFC。5 °C时SFC值的增加速率被指定为结晶速率。同时，滑熔点（SMP）按照Tarmizi、Lin和Kuntom（2008）所述方法测定。
【数据】SFC测定：80 °C加热30 min，0 °C冷藏90 min，测定范围5–50 °C
#### 2.4.2 DSC热性质分析
熔融和结晶热分析图使用配备热分析数据站的差示扫描量热仪（DSC，TA Q20，TA Instruments）获得。氮气（纯度99.99%）作为吹扫气体，流速20 mL/min。样品（3–5 mg）密封在铝坩埚中，以空坩埚作为参比。样品首先加热至80 °C并保持10 min。然后以5 °C/min的速率降温至−20 °C获得冷却曲线，随后以相同速率升温至80 °C获得熔融曲线。
【数据】氮气流速：20 mL/min；样品量：3–5 mg；程序：80 °C保持10 min，5 °C/min降至−20 °C，5 °C/min升至80 °C
#### 2.4.3 X射线衍射光谱
脂肪的晶型表征使用X射线衍射（XRD，Bruker AXS GmbH，Karlsruhe，Germany），采用Cu-Kα辐射和Ni滤光片（λ = 1.54056 Å，电压40 kV，电流40 mA）。短间距在5°至30°（2θ标度）范围内以4°/min的扫描速率检测。
【数据】辐射源：Cu-Kα（λ=1.54056 Å）；电压：40 kV；电流：40 mA；扫描范围：5°–30°（2θ）；扫描速率：4°/min
#### 2.4.4 偏光显微镜
晶体形态使用配备电荷耦合器件相机的DM2700P偏光显微镜（Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）进行详细分析。将一滴熔化样品精确置于载玻片上，盖上盖玻片。在25 °C孵育24 h后，对载玻片进行观察和拍照。
【数据】孵育条件：25 °C、24 h
2.5 TAG种类定性分析
三酰甘油（TAG）谱图使用Agilent 1100高效液相色谱系统（Agilent Technology，Waldbronn，Germany）评估，该系统由四元泵和e2424蒸发光散射检测器（ELSD）组成，检测器在55 °C和1.7 bar氮气压力下运行（Zhao等，2014）。每个样品溶于己烷，取10 μL注入Symmetry C18色谱柱（250 × 4.6 mm，5 μm）进行分离。洗脱溶剂为乙腈和异丙醇（1:1体积比），流速1.6 mL/min。流动相梯度如下：前45 min乙腈维持在58%，然后降至53%并保持53%持续10 min，最后5 min乙腈升至58%。峰鉴定通过确定等效碳数（ECN）完成，ECN定义为碳数CN − 2 × 双键数。酯交换度（ID）根据随机酯交换理论，通过评估酯交换前后甘油酯的变化确定（Zhang, Lee,等，2021）。该理论认为样品脂肪酸含量遵循100%随机概率原则（Li等，2018）。ID按下式计算：ID% = (A/B_PB − A/B_EIE)/(A/B_PB − A/B_RAND)，其中A为酯交换过程中减少最多的TAG，B为酯交换过程中增加最多的TAG，PB为起始混合物，EIE为酶法酯交换产物，Rand为根据随机酯交换理论得到的TAG组成。(A/B)_EIE越接近(A/B)_RAND，ID值越高。
【数据】ELSD温度：55 °C；氮气压力：1.7 bar；进样量：10 μL；色谱柱：Symmetry C18（250×4.6 mm，5 μm）；流速：1.6 mL/min；流动相：乙腈/异丙醇=1:1
2.6 统计分析
所有数据来自三次重复实验，计算测试结果的平均值和标准差。结果使用SPSS 26版软件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）进行单因素方差分析（ANOVA）。不同字母表示基于Duncan多重范围检验的统计学显著差异（P < 0.05）。
【数据】重复次数：3；统计方法：单因素方差分析（SPSS 26）；显著性水平：P < 0.05
研究结果
3.1 固定化脂肪酶用于酶法酯交换
脂肪酶已广泛用于脂质改性，作为合成具有定制功能特性（如精确设计的熔融谱和改善的营养组成）的结构脂质的关键催化剂（Reyes-Reyes, Valero Barranco, & Sandoval, 2022; Speranza & Macedo, 2012）。毕赤酵母脂肪酶——最常用于异源蛋白生产的酵母系统——表现出卓越的催化选择性，特别适用于功能脂质合成中的酯交换反应。然而，通过固定化提高毕赤酵母脂肪酶的催化效率和可重复使用性对其工业应用至关重要（Rodríguez-Restrepo & Orrego, 2020）。
如图1A所示，在五种评估的树脂载体中，固定在环氧树脂（LX-1000EP、ES-108、ES-103B）上的毕赤酵母脂肪酶（PPL）与氨基树脂（ESR-2、1000EA）相比表现出优异的催化性能。这种优越性与环氧树脂的介孔结构优势一致，该结构促进底物扩散同时防止酶聚集（Guisan等，2001）。其中，固定在ES-108环氧树脂上的PPL（ES-PPL）活性最高，为4.52 U/g（每克固定化酶的酶活单位）。
随后，将固定在五种树脂载体上的脂肪酶用于催化高油酸葵花籽油（HOSO）和棕榈硬脂（PS）的酯交换反应。表征酯交换脂肪的固体脂肪含量（SFC）和滑熔点（SMP）以评估固定化脂肪酶的催化活性。图1B显示，固定在环氧树脂（ES-108、ES-103B、LX-1000EP）上的脂肪酶通常在各温度下导致SFC更大程度的降低，而在氨基树脂固定化脂肪酶中，ESR-2与1000EA相比也表现出显著较高的活性。如图1C所示，ES-PPL催化的酯交换脂肪表现出35.21 °C的低SMP，表明ES-PPL具有高催化效率。固定化酶活性的增加与Najm和Walsh（2023）的报道一致，归因于脂肪酶疏水区域（与lid结构域相邻或在其上）与载体表面之间的强相互作用。33.2–37.6 °C的SMP对于涂抹脂肪是理想的，因为它确保脂肪在环境温度下保持固态，同时在体温下液化（Zhao等，2014）。因此，选择ES-108环氧树脂作为PPL载体用于后续研究。
【数据】ES-PPL酶活：4.52 U/g；ES-PPL催化产物SMP：35.21 °C；适宜SMP范围：33.2–37.6 °C
3.2 固定化脂肪酶的结构表征
如图2A和B所示，ES-PPL与无色的ES-108树脂相比呈现淡黄色调，可能是PPL固定到树脂上的结果。这一观察结果通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进一步证实，CLSM显示树脂颗粒周围有明显的蓝色荧光环（图2D），表明脂肪酶紧密且均匀地分布在树脂表面。相比之下，裸ES-108树脂（图2C）未显示荧光信号，为ES-108树脂和游离PPL成功结合提供了明确证据。Feng等人（2014）在制备多层海藻酸钠珠中固定的凝聚微胶囊时也观察到类似的荧光现象。此外，CLSM图像分析显示，固定化酶颗粒与ES-108树脂颗粒具有相似的微观结构，未显示明显的结构变化。这表明酶的引入未对树脂颗粒的基本特征（包括粒径）产生不利影响。
此外，进行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）以研究ES-108树脂与游离脂肪酶之间的相互作用。图2E显示，游离脂肪酶中1647 cm⁻¹处的峰对应于酰胺C=O的伸缩振动（Zhang等，2024）。同时，游离PPL脂肪酶表现出明显的蛋白质特征信号，包括3300–3500 cm⁻¹处重叠的N-H/O-H伸缩振动、2800–3000 cm⁻¹处不对称C-H伸缩振动、1647 cm⁻¹处酰胺I（C=O伸缩）和1549 cm⁻¹处酰胺II（N-H弯曲）（Peng等，2023；Qian等，2025；Tie等，2021）。ES-108树脂在1157 cm⁻¹处的峰由C-O-C的环氧振动引起（Sales, Diniz, Dutra, Thim, & Dibbern-Brunelli, 2011）。在固定化酶（ES-PPL）的FT-IR光谱中观察到1157 cm⁻¹处环氧特征峰的衰减，表明脂肪酶通过共价偶联过程中与PPL氨基基团的开环反应有效固定在ES-108上（Ramirez等，2008）。此外，1150 cm⁻¹处出现新的C-N伸缩振动证实了共价键的形成，而酰胺I和II谱带发生约5 cm⁻¹的轻微红移，表明PPL的二级结构完整性得以保留。此外，加宽的OH/NH吸收带（3000–3500 cm⁻¹）表明氢键相互作用增强；而增强的C-H伸缩振动（2800–3000 cm⁻¹）表明载体与脂肪酶之间存在疏水相互作用。这些结构分析表明，ES-108通过环氧-胺共价键实现有效的PPL固定化，并辅以非共价稳定机制（Cieh, Mokhtar, Baharuddin, Mohammed, & Wakisaka, 2024）。
【数据】FT-IR特征峰：1647 cm⁻¹（酰胺I）、1549 cm⁻¹（酰胺II）、1157 cm⁻¹（环氧C-O-C）、1150 cm⁻¹（C-N）；红移：约5 cm⁻¹
3.3 反应条件对ES-PPL催化酯交换的影响
酶法酯交换受多种因素影响，包括脂肪酶添加量、反应温度和时间。不同因素下酯交换脂肪的SFC曲线和SMP如图3所示。
从图3A-B可以看出，酯交换脂肪的SFC和SMP曲线对6%至20%的脂肪酶添加量呈现剂量依赖性响应。具体而言，增加ES-PPL剂量显著（p < 0.05）降低了酯交换脂肪的SFC（图3A）和SMP（图3B）。这一效应可能归因于较高的ES-PPL剂量增加了脂肪酶活性位点与底物之间碰撞的可能性，从而提高反应效率。当脂肪酶添加量从14%增加到16%时，酯交换脂肪的SFC和SMP下降速度明显减缓。具体而言，当脂肪酶添加量达到16%时，SFC值在5 °C时为30.24 ± 1.90%，25 °C时为10.23 ± 1.74%，35 °C时为3.92 ± 1.44%，SMP记录为35.75 ± 0.49 °C。较高脂肪酶水平下SFC和SMP的微小变化可能归因于底物活性位点的饱和，这些位点在16%脂肪酶添加量时已基本被占据，使额外酶变得不必要（Karunanithi & Varadappan, 2023）。同时，反应体系中的传质阻力增加，导致反应速率降低（Zhu, Zhang, Wu, & Li, 2019）。此外，过量的脂肪酶剂量不仅不能有效提高脂肪酶与底物接触的可能性，还会促进酶聚集。这种聚集反过来显著降低了脂肪酶活性位点的可及性和暴露程度，从而损害其催化效率（Jia, Ma, He, Sun, & Liu, 2019）。
如图3C-D所示，随着反应温度从45 °C升高至70 °C，酯交换脂肪的SFC和SMP总体呈下降趋势。如图3C所示，45 °C下获得的酯交换脂肪在5 °C、25 °C和35 °C时的SFC分别为31.76 ± 0.32%、15.49 ± 0.24%和9.00 ± 0.48%，SMP为43.95 ± 0.29 °C（图3D）。值得注意的是，将反应温度升至70 °C并未显著改变5 °C时的SFC（32.56 ± 0.53%……）。
【数据】16%酶添加量：SFC 30.24±1.90%（5°C）、10.23±1.74%（25°C）、3.92±1.44%（35°C）；SMP 35.75±0.49°C；45°C反应：SFC 31.76±0.32%（5°C）、15.49±0.24%（25°C）、9.00±0.48%（35°C）；SMP 43.95±0.29°C；70°C反应：5°C时SFC 32.56±0.53%
3.4 ES-PPL的催化性能与稳定性
【数据】原文未详述（该段对应图4内容，原文节选未提供对应段落文字）
3.5 酯交换脂肪的物理性质
【数据】原文未详述（该段对应图5内容，原文节选未提供对应段落文字）
【数据】原文未详述（该段对应图6内容，原文节选未提供对应段落文字）
讨论与解读
本研究成功开发了一种高效、可持续的生物催化工艺，用于生产零反式和低饱和脂肪酸的结构脂质，展示了工业人造奶油制造的巨大潜力。新型ES-108环氧树脂固定化毕赤酵母脂肪酶（ES-PPL）表现出卓越的催化性能，更重要的是具有显著的操作稳定性，连续六个批次保持高活性，这是连续工业应用中经济可行性的关键属性。优化工艺在无溶剂条件下实现了99.67%的酯交换度，所得酯交换脂肪具有理想的理化性质，包括适宜的人造奶油生产用滑熔点（35.75 °C）和固体脂肪含量曲线。最重要的是，酯交换脂肪的营养谱含有零工业反式脂肪酸和降低的饱和脂肪，与传统人造奶油相比具有显著的健康优势，符合当前膳食指南和消费者对更健康脂肪替代品的需求。
编译者解读
该研究的技术路线颇具工业转化意识——选择大孔环氧树脂ES-108作为载体，通过共价键合实现酶的稳定固定化，在无溶剂体系中完成酯交换，规避了化学催化剂的酰基随机迁移问题。99.67%的酯交换度和六批次操作稳定性是产业化落地的关键数据支撑。值得关注的是，产物SMP为33.5–35.75 °C，恰好落在涂抹脂肪的适宜区间（33.2–37.6 °C），表明该工艺不仅解决了反式脂肪酸的健康隐患，还兼顾了产品的口感与涂抹性能。局限在于，研究尚未报道固定化酶在更大规模反应器中的传质表现及长期储存稳定性，这些数据对工业放大仍不可或缺。
参考来源
Guan, X.-Y. (2025). Biocatalytic synthesis of margarine fat with zero-trans and low saturated fatty acids by Pichia pastoris lipase immobilized on resin. Food Chemistry, 2025. DOI: 10.1016/j.foodchem.2025.146620
DOI: 10.1016/j.foodchem.2025.146620