来源：Enhanced production of short branched chain fatty acid in Pichia pastoris by overexpression of branched chain α-ketoacid dehydrogenase complex（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
短支链脂肪酸（SBCFAs）在食品、化工和医药领域具有重要应用价值。本研究通过向毕赤酵母GS115中导入编码支链α-酮酸脱氢酶复合物（BCKDC）的四个基因片段，构建了重组菌株GS115-BBBL，并系统优化了发酵条件。在最优条件下（发酵时间48 h、接种量8%、BCAA添加量0.5 g/L、发酵开始后24 h添加前体），SBCFA产量达到2.45 g/L。该研究为SBCFAs的高效生物合成及毕赤酵母工业化生产富含SBCFA的脂质奠定了基础。
研究背景
支链脂肪酸（BCFAs）是一类在分子结构中含有一个或多个支链取代基的脂肪酸。短支链脂肪酸（SBCFAs）是其中的一个亚类，具体包括异丁酸（IBA, C4:0）、异戊酸（IVA, C5:0）和2-甲基丁酸（2-MBA, C5:0）。与直链脂肪酸相比，SBCFAs在稳定性、流动性、生物学功能及工业应用方面表现出更优异的性能。已有研究表明，SBCFAs赋予发酵食品独特风味，并对某些革兰氏阴性菌具有抑制作用，因此在食品工业中广泛用于增香和防腐。
目前SBCFAs的生产方法主要包括化学法和生物发酵法。生物发酵法因生产成本低、环境污染小等优势成为最广泛采用的方法，但其生产效率通常低于化学法和酶法，原因在于微生物代谢速率较慢、产量较低。本研究旨在通过遗传改造毕赤酵母，过表达SBCFA合成途径中的限速酶复合物BCKDC，以提高SBCFAs的产量。
研究方法
2.1 材料
本研究所用菌株和质粒列于表1。毕赤酵母GS115和大肠杆菌DH5α购自宁波明舟生物科技有限公司（中国宁波）。酵母重组载体质粒pPICZA-BB和pPIC9K-BL由金唯智生物科技有限公司（中国苏州）合成。限制性内切酶SacI和BamHI购自上海迈瑞尔化学技术有限公司（中国上海）。大肠杆菌质粒提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司（中国南京）。酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基、酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基、二硫苏糖醇（DTT）、极限葡萄糖（MD）培养基、HEPES缓冲液、异丁酸甲酯标准品、异戊酸甲酯标准品、2-甲基丁酸甲酯标准品及博来霉素购自无锡欣瑞柏生物科技有限公司（中国无锡）。Luria-Bertani（LB）琼脂培养基、LB培养基、PEG4000、氯化锂（LiCl）和支链氨基酸（BCAA）（亮氨酸:异亮氨酸:缬氨酸 = 1:1:1）购自苏州格瑞特有限公司（中国苏州）。三甲基硅烷基重氮甲烷和十九烷酸购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司（中国上海）。酵母合成限定培养基和基础盐培养基（BSM：0.93 g/L CaCO₃、18.2 g/L K₂SO₄、7.28 g/L MgSO₄和4.13 g/L KOH，pH = 6.0）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司（中国上海）。盐酸（HCl）、乙酸乙酯和甲醇购自中国医药集团化学试剂有限公司（中国上海）。
【数据】培养基：YPD、LB、MD、BSM（0.93 g/L CaCO₃、18.2 g/L K₂SO₄、7.28 g/L MgSO₄、4.13 g/L KOH，pH=6.0）；BCAA比例：亮氨酸:异亮氨酸:缬氨酸=1:1:1；标准品：异丁酸甲酯、异戊酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯
2.2 重组毕赤酵母菌株GS115-BBBL的构建
重组质粒pPICZA-BB和pPIC9K-BL分别使用限制性内切酶SacI和BamHI进行线性化。每个线性化反应中，2.5 μg质粒与2.5 μL相应限制性内切酶在50 μL反应体系中进行酶切，体系包含5 μL 10 × 酶切缓冲液，其余用ddH₂O补足。反应混合物在37°C恒温金属浴中孵育2 h。为验证线性化结果，取5 μL反应产物与50–10,000 bp DNA marker一同在1%琼脂糖凝胶上、80–120 V电压下电泳30–60 min。
线性化的重组质粒pPICZA-BB和pPIC9K-BL通过电穿孔法依次转化入毕赤酵母GS115感受态细胞。简要步骤如下：将毕赤酵母GS115感受态细胞在冰上解冻，与1 μg线性化质粒DNA混合，转移至电穿孔杯中，冰上孵育15 min。随后将电穿孔杯置于电穿孔仪中，使用Sc2模式脉冲两次。电穿孔后，向悬浮液中加入1 mL 1 mol/L山梨醇并混匀。细胞悬液在30°C孵育2 h。孵育后，细胞在4°C条件下以2935 g离心5 min，去除上清液。将细胞涂布于MD或博来霉素抗性YPD筛选培养基上，培养板在30°C下孵育筛选。
转化后，在YPD筛选培养基上形成明显白色菌落的毕赤酵母GS115细胞被挑选用于聚合酶链式反应（PCR）验证。经检测呈阳性的单菌落被鉴定为成功构建的GS115-BBBL菌株。
质粒pPIC9K含有氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记，该标记已由Kyratsous和Panagiotidis（2011）验证。然而，由于氨苄青霉素不抑制毕赤酵母生长，且本研究中四个目标基因序列相似度较高，难以确定特异性验证位点。Huang等（2018）和Yang等（2013）通过选择G418抗性片段作为筛选标记成功验证了重组子。因此，本研究使用pPIC9K中的G418抗性片段进行筛选和验证。博来霉素抗性片段（已由Zhao等（2017）验证）用于pPICZA衍生重组子的筛选和验证。以pPICZA-BB中的博来霉素抗性片段和pPIC9K-BL中的G418抗性片段作为模板进行PCR扩增。每个PCR反应体系（总体积50 μL）包含：5 μL 10 × PCR缓冲液、4 μL dNTPs、正向和反向引物各1 μL、对应模板DNA 1 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL（1–2 U），其余体积用ddH₂O补足。将反应混合物置于PCR仪中，95°C初始变性3 min，随后95°C变性15 s。循环阶段包括退火15 s（57–60°C）和72°C延伸（G418抗性片段体系1 min，博来霉素抗性片段体系30 s），共35个循环。最后72°C终延伸10 min，产物在4°C下保存最多24 h。电泳分析时，取3 μL PCR产物与1 μL 6 × 上样缓冲液混合，在1%琼脂糖凝胶上与50–15,000 bp DNA marker一同电泳。电泳在120 V恒压下进行30 min，结果用凝胶成像系统观察。
【数据】线性化：2.5 μg质粒+2.5 μL酶，50 μL体系，37°C，2 h；电泳：1%琼脂糖，80–120 V，30–60 min；电转化：1 μg线性化质粒，Sc2模式脉冲2次；复苏：1 mL 1 mol/L山梨醇，30°C，2 h；离心：2935 g，4°C，5 min；PCR体系：50 μL（10×缓冲液5 μL、dNTPs 4 μL、引物各1 μL、模板1 μL、Taq 0.5 μL）；PCR程序：95°C 3 min→95°C 15 s→57–60°C 15 s→72°C（G418：1 min；博来霉素：30 s）×35循环→72°C 10 min；电泳：1%琼脂糖，120 V，30 min
2.3 发酵条件优化
#### 2.3.1 发酵时间的影响
将工程酵母菌株GS115-BBBL的单菌落接种于10 mL液体YPD培养基中，在30°C、200 rpm条件下培养，直至种子培养物OD₆₀₀达到4.0–6.0。随后，将1 mL种子培养物转入含10.8 mL BSM的25 mL锥形瓶中。在对照条件下（200 rpm、30°C、0 g/L BCAA）进行发酵。分别在12、24、36、48、60和72 h时采集样品，在4°C条件下以2935 g离心5 min，收集上清液。
【数据】种子培养：YPD，30°C，200 rpm，OD₆₀₀=4.0–6.0；发酵体系：1 mL种子液+10.8 mL BSM（25 mL锥形瓶）；条件：200 rpm、30°C、0 g/L BCAA；取样时间：12、24、36、48、60、72 h；离心：2935 g，4°C，5 min
#### 2.3.2 GS115-BBBL接种量的影响
种子液培养条件和发酵培养基同2.3.1节所述。GS115-BBBL的接种量分别为：2%、5%、8%、9%、10%和15%。将上述各量的GS115-BBBL种子培养物无菌转入含10.8 mL BSM的25 mL锥形瓶中。在对照条件下（200 rpm、30°C、0 g/L BCAA）于最佳发酵时间进行取样。样品在4°C条件下以2935 g离心5 min，收集上清液。
【数据】接种量梯度：2%、5%、8%、9%、10%、15%；发酵体系：10.8 mL BSM（25 mL锥形瓶）；条件：200 rpm、30°C、0 g/L BCAA；离心：2935 g，4°C，5 min
#### 2.3.3 BCAA添加量的影响
种子液培养条件和发酵培养基同2.3.1节所述。将最佳接种量的种子培养物转入含10.8 mL BSM的25 mL锥形瓶中。在200 rpm、30°C条件下发酵12 h。此阶段，向六个单独的发酵瓶中依次添加BCAAs，使各瓶中BCAA浓度分别调整为0、0.2、0.5、1、1.5和2 g/L。继续发酵，在最佳发酵时间采集样品。样品在4°C条件下以2935 g离心5 min，收集上清液。
【数据】BCAA浓度梯度：0、0.2、0.5、1、1.5、2 g/L；添加时间点：发酵开始后12 h；条件：200 rpm、30°C；离心：2935 g，4°C，5 min
#### 2.3.4 BCAA添加时间的影响
种子液培养条件和发酵培养基同2.3.1节所述。将最佳接种量的种子培养物转入含10.8 mL BSM的25 mL锥形瓶中。在对照条件下（200 rpm、30°C）进行发酵，在特定时间点（0、8、16、24、32和40 h）向五个独立的发酵组中添加最佳浓度的BCAAs。在最佳发酵时间采集样品，在4°C条件下以2935 g离心5 min，收集上清液。
【数据】BCAA添加时间点：0、8、16、24、32、40 h；条件：200 rpm、30°C；离心：2935 g，4°C，5 min
2.4 分析方法
#### 2.4.1 SBCFA分析
游离脂肪酸（FFAs）采用先前发表的方法（Jiang等，2015）进行定量。取1 mL总培养物（在42°C孵育3–25 h）的等分试样，用100 μL 12 mol/L HCl酸化。
【数据】样品量：1 mL；酸化：100 μL 12 mol/L HCl；孵育：42°C，3–25 h
研究结果
3.1 重组质粒的设计与线性化
在某些微生物中，支链α-酮酸脱氢酶复合物（BCKDC）在BCFAs的生物合成中发挥关键作用。具体而言，BCAA分解代谢的第一步是可逆的转氨反应，生成相应的支链α-酮酸。随后，BCKDC催化支链α-酮酸的氧化脱羧，产生相应的酰基-CoA衍生物（如异丁酰-CoA和异戊酰-CoA）。这些物质是BCFA合成的直接前体。在进入脂肪酸生物合成途径后，直接前体经过一系列酶促反应延伸碳链，最终生成BCFAs。
BCKDC由四个亚基组成。如图1所示：E1α（脱氢酶）、E1β（脱羧酶）、E2（二氢硫辛酰胺酰基转移酶）和E3（硫辛酰胺脱氢酶），分别由BkdA1、BkdA2、BkdB和LpdV基因片段编码。E1α和E1β亚基催化支链α-酮酸的脱氢和脱羧反应，产生中间产物。E2亚基接受酰基并将其转移至辅酶A，而E3亚基再生硫辛酸的氧化形式以维持复合物的催化循环。BCKDC活性主要受磷酸化和去磷酸化修饰调控，具体由BCKDC激酶和磷酸酶执行。E1亚基被特异性激酶（如支链酮酸脱氢酶激酶）磷酸化后失活，而去磷酸化则恢复其活性。BCKDC是SBCFAs合成中的关键限速酶。
因此，在重组质粒设计过程中，编码BCKDC的四个基因序列（BkdA1、BkdA2、BkdB、LpdV）被分为两组，插入空白质粒pPICZA和pPIC9K的多克隆位点（MCS）区域。最终获得重组质粒pPICZA-BB和pPIC9K-BL。
重组质粒以环状构象存在。环状质粒主要通过非同源末端连接（NHEJ）机制整合到宿主基因组中，该过程通常是随机的，效率显著低于线性化后通过同源重组进行的靶向整合。此外，NHEJ介导的整合可能导致不可预测的插入位点和拷贝数。线性化过程极大地提高了外源DNA通过同源重组整合到基因组中的概率。因此，该步骤对于产生稳定的转染细胞系至关重要。
如图S1所示，最左侧泳道为DNA ladder（0–10,000 bp），中间和右侧泳道分别为重组质粒pPICZA-BB和pPIC9K-BL。两个重组质粒条带均呈现轻微拖尾。线性化后，pPICZA-BB（序列长度：5306 bp）和pPIC9K-BL（序列长度：11976 bp）的电泳迁移位置与基于DNA marker的预期大小相符，证实线性化成功。条带的明显拖尾可能是由质粒样品浓度过高所致。然而，这并未影响实验结果或后续操作。
【数据】质粒大小：pPICZA-BB为5306 bp，pPIC9K-BL为11976 bp；DNA marker范围：0–10,000 bp
3.2 工程毕赤酵母的构建
如图S2所示，毕赤酵母GS115感受态细胞的菌落在筛选培养基上生长。毕赤酵母转化子（GS115-BBBL）呈淡黄色菌落，通过MD和博来霉素抗性培养基的连续筛选进行鉴定。从这些阳性克隆中挑选单菌落进行PCR扩增和电泳分析。
如图2A所示，左侧1–11泳道的条带位置与博来霉素抗性基因的预期片段大小相符，而右侧1–11泳道的条带与G418抗性基因的片段大小相符（基于DNA marker判断）。这些结果证实重组质粒pPICZA-BB和pPIC9K-BL依次转化到了同一毕赤酵母GS115宿主中。两个质粒作为自主附加体成功转入毕赤酵母GS115的事实通过PCR扩增和电泳检测得到进一步验证。
【数据】PCR验证：博来霉素抗性基因片段（左侧1–11泳道）、G418抗性基因片段（右侧1–11泳道）；菌落形态：淡黄色
3.3 发酵条件优化
#### 3.3.1 发酵时间对SBCFA产量的影响
在12、24、36、48、60和72 h的不同发酵时间点采集样品，检测发酵产物中的FFAs。如图2B所示，工程毕赤酵母GS115-BBBL中SBCFAs的浓度约为发酵48 h的毕赤酵母GS115（0.08 ± 0.02 g/L）的两倍。如图3A所示，发酵产物中SBCFAs的浓度随时间逐渐增加，在48 h时达到峰值浓度0.16 ± 0.02 g/L。此后，SBCFA浓度逐渐下降。
Yao等（2023）在其研究中报道毕赤酵母GS115最终发酵液中SBCFA浓度为0.55 g/L，约为本研究中观察值（0.08 ± 0.02 g/L）的八倍。然而，他们采用的是持续5天的连续发酵方法，每24 h补充甲醇以维持诱导。甲醇作为不可发酵碳源，可能抑制糖酵解。这会触发向氨基酸分解代谢（如BCAA降解）的转变以满足能量需求，从而增强BCFA积累并促进SBCFA的持续生产（Sola等，2007）。在毕赤酵母生长的基础培养基中，甘油（1% w/v）作为碳源。其快速利用可能导致生长后期碳源饥饿，触发蛋白质降解。该过程释放BCAAs，随后被转化为BCFAs。因此，SBCFA的基础产量增加，最终影响其在发酵液中的浓度。综合考虑这些条件以及缺乏毕赤酵母GS115 SBCFA产量的直接数据，本研究中观察到的SBCFA浓度处于合理范围内。
【数据】GS115-BBBL峰值产量：0.16 ± 0.02 g/L（48 h）；GS115对照产量：0.08 ± 0.02 g/L（48 h）；Yao等报道：0.55 g/L（5天连续发酵）；碳源：甘油（1% w/v）
#### 3.3.2 GS115-BBBL接种量对SBCFA产量的影响
接下来，我们分析了接种六种不同量GS115-BBBL的发酵液样品中的SBCFA浓度。如图3B所示，当接种量从2%增加到8%时，SBCFAs浓度从0.24 ± 0.02 g/L显著增加至2.30 ± 0.10 g/L。然而，当接种量超过8%时，浓度从2.30 ± 0.10 g/L逐渐下降至1.49 ± 0.08 g/L。基于这些结果，确定GS115-BBBL的最佳接种量为8%。
接种量在发酵实验中至关重要，因为它直接影响微生物代谢产物积累的速率，并最终影响产物产量。Papanikolaou和Aggelis（2002）研究了不同接种量（OD₆₀₀ = 0.5、1.0和2.0）对解脂耶氏酵母在甘油培养基中生长和脂质积累的影响。过量接种会干扰发酵过程中菌落的形成，而适当的初始接种量可缩短延滞期并提高生物量和脂质产量。然而，过高的接种量可能导致毕赤酵母将碳源转向生长而非发酵，导致营养快速耗竭并降低脂质生产力。
【数据】接种量2%时：0.24 ± 0.02 g/L；接种量8%时：2.30 ± 0.10 g/L；接种量15%时：1.49 ± 0.08 g/L；最佳接种量：8%
#### 3.3.3 BCAA添加量对SBCFA产量的影响
（原文此处未提供更多内容）
【数据】原文未详述
讨论与解读
毕赤酵母在异源表达产物方面具有多项优势。通过工艺优化，毕赤酵母GS115-BBBL的最佳发酵条件确定为：表达培养基为BSM，发酵时间48 h，菌株初始OD₆₀₀值为4.0–6.0，接种量8%（v/v），BCAA添加量0.5 g/L，BCAA添加时间为发酵开始后24 h。在优化条件下发酵的SBCFA浓度峰值达到2.45 ± 0.07 g/L。该结果为深入研究毕赤酵母中特定脂肪酸的生产及脂肪酸产量的提高提供了理论和实验基础。在后续工作中，作者将应用基因工程策略研究毕赤酵母中其他功能性脂质的生产。
编译者解读：本研究采用经典的"限速酶过表达+发酵条件优化"策略，思路清晰、操作规范。将BCKDC四个亚基分两组导入毕赤酵母的策略有效回避了多基因共表达的技术瓶颈，值得借鉴。但值得注意的是，工程菌株在未优化条件下的基础产量仅0.16 g/L，优化后跃升至2.45 g/L，说明发酵调控对产量的贡献远大于遗传改造本身——这提示该系统的代谢瓶颈可能不仅限于BCKDC一步。未来若能结合代谢通量分析，进一步强化前体供给和辅因子再生，产量仍有较大提升空间。从工业应用角度看，BSM培养基成本可控，工艺放大前景较好。
参考来源
Zongrun Li. Enhanced production of short branched chain fatty acid in Pichia pastoris by overexpression of branched chain α-ketoacid dehydrogenase complex. Food Bioscience, 2025. DOI: 10.1016/j.fbio.2025.107884
DOI: 10.1016/j.fbio.2025.107884