来源：Sustainable production of lipids from cocoa fatty acid distillate fermentation driven by adaptive evolution in Yarrowia lipolytica（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
微生物单细胞油（SCO）被视为替代动植物油脂的可持续平台，但底物成本长期制约其商业化。本研究将可可脂肪酸蒸馏物（CFAD）这一食品工业副流与适应性实验室进化（ALE）相结合，使解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）CBS 2072 菌株的生物量提升 2 倍、脂质产量提升 3 倍以上。通过转录组学分析，研究进一步鉴定了与脂质组成调控、副流利用及脂质产量提升相关的关键候选基因，为利用富含脂质的工业副流生产微生物油脂提供了新路径。
研究背景
脂质是膳食中不可或缺的组分，不仅提供必需营养素，还影响食品风味。当前食品油脂主要来源于动植物，但农业用地有限与畜牧业不可持续性促使全球寻求替代脂质生产平台。微生物脂质（单细胞油，SCO）是前景广阔的替代方案，而产油酵母如解脂耶氏酵母、圆红冬孢酵母（Rhodotorula toruloides）、斯达氏油脂酵母（Lipomyces starkeyi）和胶红酵母（Rhodotorula glutinis）是优秀的脂质生产者——其干重中脂质含量可达 70%，其中 80–90% 为三酰甘油（TAG）。然而，以葡萄糖为碳源的传统发酵成本高昂，成为商业化瓶颈。利用工业副流替代葡萄糖作为底物，是降低成本的有效策略。
研究方法
2.1 菌株、培养基与材料
本研究所用产油酵母菌株包括：圆红冬孢酵母 ATCC 10788 和 ATCC 20406（美国典型培养物保藏中心，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）；解脂耶氏酵母 CBS 2070 和 CBS 2072（CBS-KNAW 培养物保藏中心，荷兰乌得勒支 Westerdijk 真菌生物多样性研究所）。
可可脂肪酸蒸馏物（CFAD）培养基配制如下：10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨，以及不同浓度的 CFAD 副流（用于 ALE 实验）。酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（酵母标准实验室培养基）含 10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨和 20 g/L 葡萄糖。酵母提取物和蛋白胨购自 BD 培养基公司，D-葡萄糖和琼脂购自 Sigma-Aldrich。酵母 DNA 使用 YeaStar 基因组 DNA 试剂盒（Zymo Research）按制造商方案提取。其他试剂包括二甲基亚砜和稀释至 1× 的磷酸盐缓冲液（PBS）。
【数据】菌株：R. toruloides ATCC 10788、ATCC 20406，Y. lipolytica CBS 2070、CBS 2072；培养基组分：酵母提取物 10 g/L、蛋白胨 20 g/L、葡萄糖 20 g/L（YPD）；CFAD 浓度：不同浓度（用于 ALE）
2.2 可可脂肪酸蒸馏物培养基制备
CFAD 副流购自新加坡 Tiong Lam Supplies Pte. Ltd.。底物按前期报道（Peterson et al., 2023）方法制备并略作修改。简言之，CFAD 副流经 121°C、115 PSI 高压灭菌 20 分钟，储存于 −20°C 备用。按所需浓度称取 CFAD（克数），加入已灭菌的 YP 培养基中。培养基每天使用前新鲜配制，置于 65°C 烘箱中使固体融化，使用前涡旋混匀成均一混合物。
【数据】灭菌条件：121°C、115 PSI、20 min；储存温度：−20°C；融化温度：65°C
2.3 适应性实验室进化：细胞传代
采用适应性实验室进化（ALE）改善产油酵母菌株的生长。首先，为提供诱变压力，将菌株划线于 YPD 平板上，经紫外光照射不同时间（0、10 或 30 秒），随后于 30°C 过夜培养。从所得平板挑取单菌落，接种至新鲜 YPD 培养基中，于 30°C、250 rpm 振荡过夜培养以恢复。将过夜培养物的 10% 体积转移至含 10 g/L CFAD 的培养基中，使菌株承受 CFAD 组分（即咖啡因）带来的胁迫。培养物每 24 小时按 10% 体积传代至新的含 CFAD 培养基中，以使其适应胁迫条件。通过测定过夜培养物在 600 nm 处的光密度（OD600nm）估算细胞密度，用于鉴定生长优于野生型菌株的培养物或群体。
获得表现优于亲本菌株的菌株后，将其传代至更高 CFAD 浓度的培养基中。CFAD 浓度每步增加 10 g/L，最高至 40 g/L。随后在含 20 g/L CFAD 的培养基中表征进化菌株，以匹配生物反应器的能力——前期研究发现，在较高 CFAD 底物负荷下生物反应器存在起泡限制。
【数据】紫外诱变时间：0、10、30 s；培养温度：30°C；振荡：250 rpm；传代比例：10%（体积）；CFAD 起始浓度：10 g/L；CFAD 递增梯度：每步 +10 g/L，最高 40 g/L；表征浓度：20 g/L；传代间隔：24 h
2.4 亲本菌株与进化菌株的比较
需要比较时，将亲本菌株新鲜划线于 YPD 平板，30°C 培养。挑取单菌落接种至 YPD 培养基，30°C、250 rpm 振荡过夜。将进化群体和亲本菌株分别在 1 mL YPD 和 1 mL 含 CFAD 培养基（传代浓度）中归一化至 OD600nm = 0.35，随后于 30°C、250 rpm 振荡过夜培养。以 600 nm 处的光密度值比较进化菌株与亲本菌株在 YPD 和含 CFAD 培养基中的生长情况。
【数据】起始 OD600nm：0.35；培养温度：30°C；振荡：250 rpm；培养时间：过夜
2.5 单菌落分离
在含 CFAD 培养基中 OD600nm 值高于亲本菌株、且在含 CFAD 培养基中生长速率高于 YPD 培养基的群体被选作单菌落分离，以从进化群体中分离出表现最佳的单菌落候选。将群体接种至 1 mL 含 CFAD 培养基中，30°C、250 rpm 培养 6 小时。6 小时后，将培养物稀释 2 倍、10 倍或 50 倍，涂布于 YPD 平板上，30°C 过夜培养。从每个群体中随机挑选 20 个不同菌落作进一步表征。将其接种至 1 mL 含 CFAD 培养基（传代浓度）中，根据过夜 OD600nm 读数进行比较。最终根据相较野生型更高的 OD600nm 读数选定进化菌株。
【数据】预培养时间：6 h；稀释倍数：2×、10×、50×；筛选菌落数：每群体 20 个；培养温度：30°C；振荡：250 rpm
2.6 稳定性测定
对分离的单菌落进行稳定性测定，以确认所观察到的变化在去除胁迫后仍然稳定。将选定菌株从甘油储备液中复苏至 YPD 平板，30°C 过夜培养。从每个菌株中随机选取 3 个菌落，接种至 1 mL YPD 培养基中，30°C、250 rpm 培养。24 小时后测定 OD600nm 读数，归一化至 0.35 后重新接种至新鲜 YPD 培养基。重复传代至新鲜 YPD 培养基一次，使这些菌株在无胁迫培养基中经历多代。最后一代传代时，将 OD600nm 读数归一化至 0.35，重新引入含 20 g/L CFAD 的培养基中。以 24 小时生长后的 OD600nm 读数确定表现更优的菌株。共有 4 个保留良好 CFAD 生长能力的菌株被最终确定，用于进一步发酵表征。
【数据】YPD 无胁迫传代：3 代（含最后引入 CFAD 前的 2 次传代）；起始 OD600nm：0.35；CFAD 浓度：20 g/L；测定时间点：24 h；最终筛选菌株数：4
2.7 生物反应器发酵
为研究最佳生长条件下的 SCO 生产，进行了生物反应器研究。在生物反应器发酵前，将 50 mL 接种物在 CFAD 培养基（0.28 g/L CFAD）和额外 10 g/L Tween 80 中于 30°C、250 rpm 培养 24 小时。随后将接种物转移至装载 2 L CFAD 培养基（20 g/L CFAD）和额外 10 g/L Tween 80 的 5 L 生物反应器中，起始 OD600nm 为 0.1。发酵条件为 pH 6.8、温度 30°C、通气量 1 L 压缩空气/分钟、搅拌速度 900–1000 rpm。发酵 48 小时后，以 8000 rpm 离心 30 分钟收集细胞。细胞沉淀和剩余上清液分别冻干，用于定量粗脂质和脂肪酸组成。
【数据】接种物体积：50 mL；接种物 CFAD 浓度：0.28 g/L；Tween 80：10 g/L；接种物培养：30°C、250 rpm、24 h；反应器体积：5 L（装液 2 L）；发酵 CFAD 浓度：20 g/L；起始 OD600nm：0.1；pH：6.8；温度：30°C；通气：1 L/min；搅拌：900–1000 rpm；发酵时间：48 h；离心：8000 rpm、30 min
2.8 脂肪酸组成分析
脂质提取、衍生化和脂肪酸定量按前期报道方法进行，唯一区别在于所用色谱柱为 SUPELCO SP2560 熔融石英毛细管柱（100 m × 0.25 mm × 0.20 μm），载气为氦气（1.0 mL/min）。
【数据】色谱柱：SUPELCO SP2560（100 m × 0.25 mm × 0.20 μm）；载气：氦气，1.0 mL/min
2.9 mRNA 测序与差异基因表达分析
为理解进化菌株转录组的变化，进行了总 mRNA 测序和差异基因表达分析。将菌株 CBS 2072、EVO1 和 EVO3 划线于 YPD 平板，从每个菌株中随机选取 3 个菌落作为生物学重复。在含 CFAD 培养基（20 g/L CFAD）中启动 10 mL 过夜培养。次日，将所有生物学重复以起始 OD600nm = 0.2 转接至新鲜的 50 mL 同种培养基中。在 10 小时和 24 小时时间点各收集 2 mL 培养物，通过台式离心机在 4°C、4500 rpm 离心 5 分钟获得细胞沉淀。弃去上清液，将细胞沉淀在液氮中速冻，样品储存于 −80°C 直至 RNA 提取。使用 QIAGEN RNeasy Midi 试剂盒按制造商方案提取细胞总 RNA。提取的 RNA 随后提交至 NovogeneAIT Genomics Singapore Pte Ltd 进行真核生物 mRNA 测序。
【数据】生物学重复：3 个/菌株；起始 OD600nm：0.2；培养体积：50 mL；取样时间点：10 h、24 h；取样量：2 mL；离心：4500 rpm、5 min、4°C；储存温度：−80°C；CFAD 浓度：20 g/L
研究结果
3.1 适应性实验室进化获得优良生长与脂质产量
ALE 被用作产生适应 CFAD 培养基中更优生长的酵母菌株的主要工具，应用于 4 种不同的产油酵母菌株（Rhodotorula toruloides ATCC 10788、ATCC 204091，Yarrowia lipolytica CBS 2070 和 CBS 2072）。这些菌株在含 20 g/L CFAD 的培养基上生长。经过 79 次传代后，仅有一个菌株（Y. lipolytica CBS 2072）实现了优于野生型菌株的生长。其余 3 个菌株即使在多轮传代后也未显示明显的生长改善（数据未显示）。
【数据】ALE 传代次数：79；CFAD 浓度：20 g/L；获得优良生长的菌株：Y. lipolytica CBS 2072（1/4）
3.1.1 葡萄糖与副流 20 g/L 培养基上的生长比较
为提供 Yarrowia lipolytica CBS 2072 菌株 SCO 生产的起始参考对照，将其分别在标准实验室培养基 YPD 和 CFAD 20 g/L 培养基上生长。CFAD 20 g/L 中产生的生物量（细胞干重）为 4.1 ± 0.3 g/L，比 YPD 中产生的生物量（7.5 ± 0.2 g/L）低约 45%（p 值 < 0.05）（图 1A，表 1）。尽管 CFAD 20 g/L 中的脂质含量是 YPD 中的两倍（CFAD 中脂质占生物量的 12.3%，YPD 中为 6%），但两种条件下的最终脂质滴度相当（图 1A）。相关脂质谱（图 1B）表明，CFAD 中较高的脂质伴随较高含量的饱和脂肪，尤其是 C16:0 和 C18:0（p 值 > 0.05）。这很可能是由于从培养基中摄取了富含饱和游离脂肪酸（FFA）的组分。本研究所用 CFAD 与前期发表报道（Peterson et al., 2023）相同。然而，两种培养物均以不饱和 FFA 为主要成分。
【数据】CFAD 生物量：4.1 ± 0.3 g/L；YPD 生物量：7.5 ± 0.2 g/L；生物量降低幅度：约 45%（p < 0.05）；CFAD 脂质含量：12.3% 生物量；YPD 脂质含量：6% 生物量
3.1.2 在 20 g/L 副流培养基中的优良生长
前期工作已证明多种产油酵母可在 10 g/L 和 20 g/L CFAD 培养基中成功生长。然而，为使 Y. lipolytica CBS 2072 菌株获得更高的生长脂质滴度和得率，进行了 79 轮传代的 ALE，多个菌株群体平行传代。在鉴定出生长优于野生型的群体后，将其转移至 YPD 中培养 3 代、再转回 CFAD 20 g/L，以评估进化表型的稳定性。两个群体（697–5 和 697–20）在 20 g/L CFAD 中表现出优于野生型细胞的生长（p 值 < 0.05，学生 t 检验）（图 1C），被选作单菌落分离。在从每个群体测试的 20 个菌落中，超过 90% 的菌落在 20 g/L CFAD 中表现出显著高于野生型的 OD600nm（p 值 < 0.05，学生 t 检验）。部分菌落的 OD600nm 提升了 1.5 倍（见补充材料）。基于这些结果，共选定了 4 个菌落用于进一步的脂质和生长分析。EVO1 和 EVO2 源自群体 697–5，EVO3 和 EVO4 源自群体 697–20。
【数据】YPD 无胁迫传代：3 代；筛选群体：697–5、697–20；高 OD600nm 菌落比例：>90%（p < 0.05）；OD600nm 最大提升：1.5 倍；最终筛选菌株数：4（EVO1、EVO2 来自 697–5；EVO3、EVO4 来自 697–20）
3.1.3 摇瓶发酵
进化菌株的摇瓶发酵在 50 mL 20 g/L CFAD 体积下进行。4 个进化菌株的细胞干重均比野生型菌株高 2 倍（图 2A，表 1）。生物量的改善伴随 3–4 倍的脂质滴度增加（图 2B）。EVO1 的脂质滴度为 2.3 ± 0.4 g/L，而野生型菌株为 0.5 ± 0.1 g/L。进化菌株的总脂质占生物量百分比是野生型的两倍（表 1）。这表明这些进化菌株从培养基中摄取了更多的外源脂质。
【数据】生物量提升：2 倍；脂质滴度提升：3–4 倍；EVO1 脂质滴度：2.3 ± 0.4 g/L；野生型脂质滴度：0.5 ± 0.1 g/L；脂质占生物量比例：进化菌株为野生型 2 倍
3.1.4 优良进化菌株在摇瓶中的脂质组成
野生型和 4 个进化菌株的细胞干重、脂质滴度和脂质组成列于表 1。图 2A 也展示了这些测试的脂质组成。可以看出，菌株 EVO2 具有最高的不饱和度百分比（55.9 ± 6.0%）和最高的不饱和脂质滴度（1.1 ± 0.3 g/L）。菌株 EVO1 具有最高的脂质滴度 2.3 ± 0.4 g/L，其中 38.2 ± 8.5% 为不饱和脂质。菌株 EVO4 的脂质滴度相对较低，为 1.7 ± 0.3 g/L，不饱和脂质滴度为 0.9 ± 0.1 g/L（p 值 < 0.05）。总体而言，所有进化菌株的总脂质滴度均高于野生型，而不饱和脂质滴度低于野生型（p 值 < 0.05）（表 1，图 1B）。值得注意的是，EVO1、EVO3 和 EVO4 中 C16:0 的总体百分比相比野生型翻倍，但这些差异在统计学上不显著。此前有报道称脂肪酸结合蛋白可能具有链长偏好（Dulermo et al., 2015）。然而，高度不饱和 FFA 的存在表明发生了 de novo 脂质合成，其中 EVO2 在进化菌株中显示出最高的 C18:1 产生百分比（39.8 ± 4.8%）。因此，本研究证明了能够产生具有更高生长能力和不同脂肪酸组成的菌株。这些菌株有可能用于生产具有特定脂肪酸谱的食品或饲料替代脂质。例如，EVO2 在脂肪酸组成上与猪脂肪高度相似（Wu et al., 2022），而 EVO1 含有高比例的饱和脂肪酸（约 60%）和增强的 C16:0/C18:0 比率。
【数据】EVO2 不饱和度：55.9 ± 6.0%；EVO2 不饱和脂质滴度：1.1 ± 0.3 g/L；EVO1 脂质滴度：2.3 ± 0.4 g/L，不饱和脂质占比 38.2 ± 8.5%；EVO4 脂质滴度：1.7 ± 0.3 g/L，不饱和脂质滴度 0.9 ± 0.1 g/L（p < 0.05）；EVO2 C18:1 百分比：39.8 ± 4.8%；EVO1 饱和脂肪酸比例：约 60%
3.1.5 野生型与进化菌株的生物反应器发酵
对野生型 CBS 2072 和进化菌株 EVO1（因其具有最高脂质滴度和得率）进行了 5 L 生物反应器运行。发酵参数列于表 1。野生型和 EVO1 在生物反应器中获得的生物量无显著差异。然而，EVO1 的总脂质百分比和脂质得率在 24 小时时比野生型高 3 倍、在 48 小时时高 1.5 倍。在进化菌株的两个时间点，不饱和脂肪酸比例均下降了 30%（表 1）。EVO1 在 24 小时的不饱和脂质总滴度为 1.5 ± 0.0 g/L。进化菌株在 48 小时的行为在 50 mL 摇瓶和 5 L 生物反应器中差异明显。生物反应器中 48 小时时脂质占生物量百分比（12.5 ± 0.1%）低于摇瓶中的约 26.8 ± 6.1%。然而，24 小时时两种培养条件下的表现相似，观察到 3–4 倍的改善且饱和脂肪含量高。有趣的是，尽管 CFAD 的组成为 40% C16:0 和 26% C18:0，但 EVO1 中观察到的 C18:0 含量高于 C16:0，表明脂肪酸摄取存在链长偏好。值得注意的是，EVO1 与野生型值之间观察到的所有差异均具有统计学显著性（p 值 < 0.05）（表 1，图 2B）。这与在葡萄糖上生长的广泛工程菌株中观察到的 3.1 倍改善相当（Xu et al., 2016）。
48 小时时野生型的细胞干重得率（YX/S g/g）为 0.81 ± 0.01，与 EVO1 的 0.78 ± 0.02 相当。而 48 小时时野生型的表观脂质得率（YL/S g/g）为 0.07 ± 0.00，EVO1 为 0.11 ± 0.00（表 1），两者也相当。24 小时时的脂质得率为 0.25 ± 0.00，是 48 小时时的两倍。但应注意，该时间点未测量残余脂质（表 1）。本研究的得率与近期关于 Y. lipolytica 在挥发性脂肪酸（Gao et al., 2020）或木质纤维素生物质（Yook et al., 2020）上培养产脂的报道相当或更优。已知 Y. lipolytica 在早期稳定期比晚期稳定期积累更多脂质（Carsanba et al., 2020; Papanikolaou et al., 2009）。摇瓶和生物反应器中脂质谱的差异可能是由于两种条件下耶氏酵母细胞生长速率的差异。因此，多种因素的组合导致了这些观察结果。
【数据】生物量（野生型 vs EVO1）：无显著差异；脂质得率提升：24 h 3 倍、48 h 1.5 倍；不饱和脂肪酸比例下降：30%；EVO1 24 h 不饱和脂质滴度：1.5 ± 0.0 g/L；生物反应器 48 h 脂质占比：12.5 ± 0.1%；摇瓶 48 h 脂质占比：26.8 ± 6.1%；CFAD 组成：40% C16:0、26% C18:0；YX/S（野生型）：0.81 ± 0.01 g/g；YX/S（EVO1）：0.78 ± 0.02 g/g；YL/S（野生型，48 h）：0.07 ± 0.00 g/g；YL/S（EVO1，48 h）：0.11 ± 0.00 g/g；YL/S（24 h）：0.25 ± 0.00 g/g；所有 EVO1 差异：p < 0.05
3.2 转录组学分析
【数据】差异表达基因筛选阈值：padj < 0.05，log2 倍数变化 > 2；取样时间点：10 h、24 h；生物学重复：3 个/菌株
讨论与解读
本研究通过 79 轮适应性实验室进化，成功使 Yarrowia lipolytica CBS 2072 在可可脂肪酸蒸馏物副流上的生物量提升 2 倍以上、脂质含量提升 3–4 倍，最终实现 4.8 g/L 的脂质滴度（32% 不饱和度）。转录组学分析鉴定了 LIP4、LIP8、OLE1、AAL9 和 MEP2 等基因的表达变化，这些变化使进化菌株能够更有效地利用富含脂质的副流。进化菌株在 20 g/L CFAD 中的优良生长和脂质积累能力在传代后保持稳定，且所得菌株的脂肪酸组成具有多样性——EVO2 的脂质谱接近猪脂肪，EVO1 则富含饱和脂肪酸——这为定制化脂质生产提供了可能。
编译者解读
该研究的核心价值在于将"废弃物升级利用"与"菌株进化"两大策略巧妙结合——不依赖基因工程改造，仅通过紫外诱变加定向传代压力，便使野生型菌株获得显著提升的副流利用能力。这一策略避开了转基因生物在食品应用中的监管障碍，具有直接的产业化潜力。值得注意的是，ALE 的成功率（4 株中仅 1 株成功）提示菌株背景对进化响应的决定性影响。此外，转录组学揭示的链长偏好现象为后续理性改造提供了靶点。局限在于，摇瓶与生物反应器间的脂质积累差异提示放大过程中的工艺参数仍需系统优化。
参考来源
Sofeo N. Sustainable production of lipids from cocoa fatty acid distillate fermentation driven by adaptive evolution in Yarrowia lipolytica. Bioresource Technology, 2024. DOI: 10.1016/j.biortech.2024.130302
DOI: 10.1016/j.biortech.2024.130302