来源：Evaluation of Ogataea polymorpha DUR31 TPP riboswitch as a tool to downregulate gene expression in the yeast Komagataella phaffii（New Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
TPP核糖开关是一种通过代谢物调控mRNA剪接的天然调控元件。本研究将来自多形汉逊酵母的OpDUR31内含子核糖开关引入产甘油酵母（K. phaffii，即毕赤酵母），验证其在糖酵解GAP启动子驱动下调控外源基因表达的功能。研究表明该核糖开关在异源宿主中具备功能，但存在高基础表达、开关比有限等问题，为合成生物学基因表达精细调控工具的选型提供了参考。
研究背景
K. phaffii（原名Pichia pastoris）是广泛用于重组蛋白生产的甲基营养型酵母，也越来越多地被用作C1代谢产物的细胞工厂。然而，该宿主中用于调控蛋白表达的工具仍然有限，主要依赖碳代谢来源的启动子。核糖开关——通过配体依赖性折叠调控翻译或剪接的mRNA元件——提供了一种补充调控层次，但在K. phaffii合成生物学中仍未得到充分利用。在多形汉逊酵母（Ogataea polymorpha）中，DUR31基因内的一个内含子充当硫胺素焦磷酸（TPP）核糖开关，通过选择性剪接下调基因表达，并在外源硫胺素存在时保留提前终止密码子。本研究旨在评估该TPP核糖开关在K. phaffii中作为调控糖酵解GAP启动子表达的工具。
研究方法
2.1 培养基与菌株
载体构建与繁殖使用大肠杆菌DH10β（Invitrogen），在LB培养基（10 g/L大豆蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl，pH 7.5）中于37°C培养。LB平板含20 g/L琼脂，添加25 µg/mL Zeocin或50 µg/mL nourseothricin用于筛选。K. phaffii CBS 2612（CBS-KNAW真菌生物多样性中心，荷兰）菌株用作非表达对照和转化背景菌株。酵母在YPD培养基（20 g/L大豆蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖，pH 7.5）中预培养，根据需要添加50 µg/mL Zeocin或100 µg/mL nourseothricin以确保表达盒维持，于25°C、280 rpm振荡过夜，总体积1 mL，使用24深孔板（24-DWP）。YPD平板添加20 g/L琼脂。酵母主培养在无硫胺素的YNB培养基（38 g/L无硫胺素、硫酸铵或氨基酸的YNB，Formedium）、10 g/L (NH₄)₂SO₄、100 mmol/L磷酸钾缓冲液，pH 6.5）或新开发的KNB培养基（Komagataella氮源基础：10 g/L (NH₄)₂SO₄、2 g/L KH₂PO₄、2.05 g/L MgSO₄·7H₂O、0.20 g/L NaCl、1 mL/L 1000×微量元素储备液、4 µg/L生物素、100 mmol/L磷酸钾缓冲液，pH 6.5，其中1000×微量元素储备液含0.4 g/L FeCl₃·6H₂O、1.28 g/L ZnSO₄·7H₂O、0.13 g/L CuSO₄·5H₂O、0.80 g/L MnSO₄·H₂O、0.40 g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.20 g/L KI、1 g/L H₃BO₃、0.53 g/L CaCl₂·2H₂O）中进行，于25°C、280 rpm振荡，总体积2 mL，使用24-DWP。硫胺素盐酸盐（ThiCl·HCl）以10至100 µmol/L的浓度添加到培养基中。
【数据】菌株：E. coli DH10β、K. phaffii CBS 2612；培养基：LB（10 g/L大豆蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl，pH 7.5）、YPD（20 g/L大豆蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖，pH 7.5）、YNB无硫胺素、KNB；温度：37°C（E. coli）、25°C（酵母）；转速：280 rpm；抗生素：25 µg/mL Zeocin、50 µg/mL nourseothricin（E. coli）、50 µg/mL Zeocin、100 µg/mL nourseothricin（酵母）；硫胺素浓度：10–100 µmol/L
2.2 载体构建
载体克隆使用基于Golden Gate的GoldenPiCS [10]工具包。P_GAP、P_THI11、EGFP和ScCYC1终止子序列直接使用系统骨架作为插入供体。含有OpDUR31内含子序列与EGFP CDS融合的插入片段以gBlock（Integrated DNA Technologies）为内含子模板，通过重叠延伸PCR使用引物fwd_iDUR31_Fs2_BsaI、rev_OpDUR31int_ofw_EGFP、orv_OpDUR31int_fwd_EGFP和BsaI_Fs3_EGFP_rev（补充表S1）从GoldenPiCS载体BB1_23_EGFP扩增。含有OpDUR31内含子序列与UBIYΔkGFP* CDS融合的插入片段以BBa_K2670001（iGEM）为模板，通过重叠延伸PCR使用引物fwd_iDUR31_Fs2_BsaI、rev_OpDUR31int_ofw_UBI4、orv_OpDUR31int_fwd_UBI4和BsaI_Fs3_EGFP_rev（补充表S1）扩增。PCR产物经Golden Gate组装到BB1_12中并转化至E. coli进行筛选和扩增；质粒分离后经Sanger测序验证BB1s（FASTA格式的CDS序列见补充文件附录B）。表达载体（补充表S2）由BB1s经Golden Gate组装到BB3_aZ或BB3_rN载体中，转化至E. coli并通过菌落PCR验证。BB3表达载体用AscI（New England Biolabs）线性化并电穿孔转入感受态K. phaffii细胞。转化子在含有适当抗生素的YPD琼脂平板上筛选，并通过菌落PCR验证插入片段存在（BB3aZ载体）或插入整合到靶基因组位点（BB3rN载体为P_RGI2）。
【数据】克隆方法：Golden Gate（GoldenPiCS工具包）；模板：gBlock、BB1_23_EGFP、BBa_K2670001；引物：fwd_iDUR31_Fs2_BsaI、rev_OpDUR31int_ofw_EGFP、orv_OpDUR31int_fwd_EGFP、BsaI_Fs3_EGFP_rev、rev_OpDUR31int_ofw_UBI4、orv_OpDUR31int_fwd_UBI4；线性化酶：AscI（NEB）；转化方法：电穿孔
2.3 流式细胞术数据采集与分析
主培养的细胞悬液用PBS稀释50倍（v/v）。流式细胞术数据在CytoFLEX（Beckman Coulter）上采集，激发波长488 nm，绿色发射滤光片（525–550 nm）。为减少细胞形态对比较分析的影响，测量的荧光根据幂律关系参照前向散射，该关系通过回归模型[34]实验确定，对强荧光阳性对照菌株用主成分回归求解最小绝对距离问题。确定的关系（log(FL-A) ∼ 1.19 log(FSC-A)）用于所有菌株的计算。使用Epanechnikov核进行密度估计；估计的众数作为比较统计参数以保持对异常值的稳健性。形态参照荧光归一化至非表达对照。散射面积通道中所有非负值事件均纳入分析。
【数据】稀释倍数：50倍（v/v）；仪器：CytoFLEX（Beckman Coulter）；激发波长：488 nm；发射滤光片：525–550 nm；幂律关系：log(FL-A) ∼ 1.19 log(FSC-A)；密度估计：Epanechnikov核
2.4 RNA提取与半定量RT-PCR
主培养样品的RNA分离使用甲酰胺-EDTA方案[35]，针对K. phaffii进行了改良：提取所用细胞量增加10倍，并使用玻璃珠在Ribolyser（MP Bio）中以5.5 m/s破碎细胞40秒替代匀浆器。每份RNA样品取2 µg当量，加入1 µL rDNase I（Invitrogen DNA-free Kit），总体积50 µL，37°C处理30分钟，之后再加入1 µL rDNase I孵育30分钟。加入10 µL DNase灭活试剂，室温孵育2分钟，10,000 rcf离心90秒；上清转移至无核酸酶管中。cDNA从8.5 µL DNase处理后的RNA合成，总体积20 µL，使用Biozym cDNA合成试剂盒按制造商说明进行，含RNase抑制剂，55°C孵育45分钟，使用Oligo dT（New England Biolabs）或EGFP_RT_rv引物（补充表S1）；同时设置无逆转录酶对照。分析PCR使用2 µL cDNA，总体积20 µL，23个循环，ACT1_up/ACT1_low引物用于阴性对照，pGAP_RT_fw/EGFP_RT_rv用于剪接表征（引物见补充表S1）。电泳在1.5%琼脂糖凝胶中进行，TAE缓冲液，Midori Green（Nippon Genetics）染色，以Quick-Load 1 kb Plus DNA Ladder（New England Biolabs）为标记。
【数据】RNA提取：甲酰胺-EDTA方案改良版；细胞量：增加10倍；破碎：玻璃珠、Ribolyser、5.5 m/s、40 s；DNase处理：2 µL rDNase I、37°C、30 min×2；DNase灭活：10 µL试剂、室温2 min、10,000 rcf离心90 s；cDNA合成：8.5 µL RNA、20 µL总体积、55°C、45 min；PCR循环数：23；电泳：1.5%琼脂糖、TAE缓冲液
研究结果
为评估含TPP核糖开关的OpDUR31内含子在K. phaffii中的功能，我们将内含子序列作为N端融合引入EGFP开放阅读框，紧随ATG起始密码子之后，模拟天然OpDUR31基因结构。由于缺乏K. phaffii和O. polymorpha剪接位点序列背景研究，我们参考了近期S. cerevisiae组合文库研究[36,37]，发现虽然内含子序列对剪接效率的影响已有研究，但关于外显子序列背景影响的文献尚不存在。这并不意外，因为外显子序列的进化与编码蛋白序列的进化相耦合；这种缺乏进化独立性可能正是许多mRNA调控元件位于UTR或其邻近区域的原因，OpDUR31核糖开关也是如此。S. cerevisiae的5′剪接位点（5′ SS）下游保守至6 nt，共有序列GUAUGU与OpDUR31内含子中的GUAUAC不对应。事实上，S. cerevisiae 5′ SS中+5位置的G在富集和隐蔽5′ SS基序中高度保守，而OpDUR31内含子在该位置含有A，甚至不满足低特异性的GNANGN基序。相比之下，3′剪接位点（3′ SS）与S. cerevisiae共有序列UAG匹配，共有分支位点基序UACUAAC位于其正上游，间隔5 nt长的polyU序列，因此整体3′ SS结构与S. cerevisiae相当。
鉴于OpDUR31内含子天然位于5′ UTR之后几乎紧邻的位置，仅以4 nt的GUUA序列与起始密码子相隔，我们决定在转移序列中包含这4 nt以更好地保留天然宿主中的即时序列背景。我们选择不从5′ SS进一步向上游转移OpDUR31序列，因为这将导致所用K. phaffii启动子序列的5′ UTR改变。根据我们的设计，TPP分子与适体结合将导致mRNA折叠成一种结构，使剪接位点被占用从而阻止内含子剪接。内含子含有一个提前终止密码子，导致翻译仅进行8个密码子即终止。在无TPP时，剪接位点可自由参与剪接，内含子连同提前终止密码子被移除，允许翻译继续通过3′剪接位点（图1）。
含或不含内含子的EGFP ORF被克隆在糖酵解GAP启动子（PGAP，不受外源硫胺素影响）和ScCYC1终止子之间，所得表达盒被引入K. phaffii CBS 2612基因组。确认的转化子在无硫胺素YNB或添加10、50和100 µmol/L ThiCl·HCl的YNB中培养，基于K. phaffii胞内硫胺素浓度和摄取速率的可用数据[38]，我们认为这些浓度已达到饱和。样品在6 h和22 h采集并通过流式细胞术分析。未转化野生型菌株用作非表达参考，无内含子构建体用作EGFP表达的阳性对照。
我们在流式细胞术（图2）中观察到所有样品均有清晰荧光信号（转化细胞比非表达参考强>10倍）。对于PGAP intron(+)菌株，即使培养基中无硫胺素，荧光信号也普遍弱于PGAP-EGFP阳性对照（6 h时弱约4倍，22 h时弱约3.5倍）。在6 h时，PGAP intron(+)菌株的荧光不受硫胺素添加影响，无论测试浓度如何。在22 h时，所有添加硫胺素的培养中PGAP intron(+)菌株的信号比无硫胺素时弱约3倍。这证实将OpDUR31内含子作为N端框内融合引入报告蛋白序列会导致硫胺素存在时表达强度下降，表明异源核糖开关在K. phaffii中有功能。然而，即使在高达100 µmol/L ThiCl·HCl浓度下，观察到的荧光信号仍为非表达参考的10倍。高基线表达表明该核糖开关缺乏紧密的关闭状态。
荧光蛋白的稳定性已知是监测分子关闭系统时的一个问题，因为报告蛋白在开启状态随时间积累，导致信号在时间上溢出到关闭状态的时间窗口[39,40]。为确保硫胺素存在时观察到的高荧光不是这种伪影，我们换用去稳定化的UBIYΔkGFP报告蛋白[41]，该蛋白由GFP（F64L、S65T、V163A）与N端UBIYΔk降解决定子融合组成，可将报告蛋白靶向蛋白酶体降解。除PGAP intron(+/–)菌株外，我们还纳入了在K. phaffii THI11基因的硫胺素抑制启动子（P_THI11 intron(–)）控制下表达无内含子GFP的菌株——该启动子可被纳摩尔浓度的外源硫胺素紧密抑制[21,38]——作为已建立的K. phaffii硫胺素响应开关的对照，并作为生物传感器确认关闭状态条件下无外源硫胺素。
由于初始实验中使用的YNB培养基含有K. phaffii不需要的辅助因子，我们将其调整为KNB培养基（Komagataella氮源基础；组成见方法），包含YNB的所有无机组分和唯一必需辅助因子生物素。所有菌株在相同装置中培养，不添加硫胺素（开启状态）和添加100 µmol/L ThiCl·HCl（关闭状态），18 h后取样。流式细胞术中的荧光信号分布（图3）显示，所有使用UBIYΔkGFP的PGAP intron(+/–)菌株的分布显著更宽（IQR高>2倍），与EGFP构建体相比。细胞群体内荧光变异性的增加表明UBIYΔkGFP报告蛋白的去稳定化已实现，因为泛素化报告蛋白的设计者已证明其动态范围增加但平均信号强度降低，这正是我们观察到的模式。
原始作者认为这种模式主要归因于GFP发色团的延迟、氧依赖性成熟形成UBIYΔkGFP系统的瓶颈；此外，新出芽细胞开始表达去稳定化报告蛋白至检测限以上需要最短时间，意味着群体分布显示新生细胞亚群的低端尾部，这在表达稳定EGFP报告蛋白的菌株中未观察到[41]。硫胺素调控的参考P_THI11 intron(–)菌株在硫胺素存在（关闭状态）下记录的信号与非表达参考重叠。在开启状态（不添加硫胺素）下，EGFP信号强约12倍，UBIYΔkGFP信号强约14倍，表明实验装置允许评估硫胺素抑制的分子开关。三个研究的PGAP intron(+)菌株在开启状态下达到接近阳性对照的信号水平（以EGFP为报告蛋白），关闭状态下荧光信号低约2.9倍。当使用不稳定的UBIYΔkGFP*与PGAP intron(+)组合时，开启状态与关闭状态之间的信号比约为2.4。对于两种GFP报告构建体，核糖开关在硫胺素存在下均表现出高关闭状态基线表达，表明其不能被视为紧密的分子开关。即使在100 µmol/L ThiCl·HCl补充条件下，核糖开关构建体菌株的高基线荧光表明……
【数据】荧光信号：转化细胞比非表达对照强>10倍；PGAP intron(+) vs PGAP-EGFP对照：6 h弱约4倍、22 h弱约3.5倍；硫胺素添加效果（22 h）：信号弱约3倍；100 µmol/L ThiCl·HCl时：信号仍为非表达参考的10倍；UBIYΔkGFP分布IQR：比EGFP构建体高>2倍；P_THI11 intron(–)开启/关闭比：EGFP约12倍、UBIYΔkGFP约14倍；PGAP intron(+)关闭状态：信号低约2.9倍；UBIYΔkGFP*开启/关闭比：约2.4；采样时间：6 h、22 h、18 h
讨论与解读
本研究证明了来自O. polymorpha的OpDUR31 TPP核糖开关在K. phaffii中具有功能。含适体的内含子可在异源宿主中发生剪接。尽管O. polymorpha在系统发育上与K. phaffii接近——两个物种均为甲基营养型，目前均归类于Pichiaceae科——核糖开关原则上应是宿主无关的。该核糖开关可作为K. phaffii中蛋白表达控制的合成生物学工具，通过将内含子序列插入目标蛋白开放阅读框起始处实现硫胺素依赖性敲低，本研究的荧光报告蛋白表达实验已证实这一点。然而，我们观察到该开关在关闭状态具有高基础表达水平，这是配体抑制型核糖开关系统的常见特征，阻碍其用作紧密关闭开关[43,44]，与本研究实验装置中包含的THI11启动子等硫胺素抑制型启动子形成对比。迄今唯一在K. phaffii中验证的另一种核糖开关——四环素核糖开关——也表现出类似的性能特征，作者成功将其用于配体控制的Ku70p敲低[32]。OpDUR31核糖开关的开启:关闭比（2–3倍）略高于先前报道的四环素开关（1.5倍），且本研究的荧光报告蛋白定量方法比四环素开关所用的半乳糖苷酶测定更直接。
编译者解读
从合成生物学应用角度看，本研究的意义在于将天然存在于近缘甲基营养酵母的TPP核糖开关成功移植到工业底盘K. phaffii中，拓展了该宿主的基因下调工具库。其方法学上值得借鉴之处在于：采用流式细胞术配合去稳定化报告蛋白（UBIYΔkGFP*）排除蛋白稳定性对开关动态范围评估的干扰，使"泄漏表达"的定量更为可靠。不过，2–3倍的开关比和显著的基础泄漏意味着该元件更适合需要温和下调的场景，而非严格的基因关闭。未来若需提升开关性能，或可考虑对外显子剪接背景进行工程化改造——本研究中额外外显子插入导致蛋白表达消失的结果提示，剪接效率对局部序列背景高度敏感，这既是挑战也是可优化的切入点。
参考来源
Małecki P. Evaluation of Ogataea polymorpha DUR31 TPP riboswitch as a tool to downregulate gene expression in the yeast Komagataella phaffii. New Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.nbt.2026.06.009
DOI: 10.1016/j.nbt.2026.06.009