来源：Heterologous expression of codon optimized Trichoderma reesei Cel6A in Pichia pastoris（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
纤维素酶成本是木质纤维素生物炼制商业化的关键瓶颈之一。本研究针对里氏木霉纤维素酶系中含量较低但至关重要的纤维二糖水解酶Cel6A（CBH II），通过密码子优化策略提升其在毕赤酵母中的异源表达水平。研究构建了分别受AOX1和GAP启动子调控的两个重组菌株，摇瓶发酵最高产酶265 U/L、蛋白300 mg/L；高密度发酵将酶活提升至1100 U/L、蛋白产量达2.0 g/L。结果表明AOX1启动子更适合Cel6A在毕赤酵母中的表达。
研究背景
木质纤维素生物炼制商业化面临的核心挑战之一，是如何利用纤维素酶经济高效地生产可发酵糖。为降低纤维素酶成本，研究者通过添加β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、AA9及阿魏酸酯酶等辅助蛋白来减少酶用量；同时优化酶系组成与配比也显示出降低总蛋白用量的潜力。实施这些策略的前提是获得足量的单一纤维素酶蛋白。
里氏木霉纤维素酶制剂中，家族6纤维二糖水解酶（Cel6A/CBH II）在纤维素水解中发挥关键作用，但其含量仅占总纤维素酶蛋白的约10–20%。与家族7纤维二糖水解酶不同，Cel6A作用于纤维素链的非还原端，对结晶纤维素具有高比活，释放纤维二糖。CBH II的不足已成为限制纤维素酶协同效应的关键因素之一。鉴于单一酶蛋白分离成本高昂，利用异源表达技术生产目标酶组分成为具有吸引力的替代方案。
研究方法
2.1 材料
毕赤酵母GS115、载体pPIC9K和pGAPZαA购自Invitrogen公司。大肠杆菌DH5α、JM109来源于教育部工业生物技术重点实验室。限制性内切酶、连接酶和Taq DNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司。大肠杆菌和毕赤酵母培养基购自上海生工生物工程有限公司。二硝基水杨酸（DNS）、水杨苷、Avicel和羧甲基纤维素（CMC）购自国药集团化学试剂（上海）有限公司。滤纸购自GE Whatman公司。抗生素Zeocin和G418硫酸盐购自上海生工生物工程有限公司。
【数据】菌株：P. pastoris GS115、E. coli DH5α/JM109；试剂来源：Invitrogen、Takara、Sangon Biotech、Sinopharm、GE Whatman
2.2 培养基与菌株培养
大肠杆菌和毕赤酵母所用培养基包括LB、BMGY、BMMY、YPDS和YPD。大肠杆菌在LB培养基中、220 rpm、37°C条件下过夜培养以提取质粒DNA。
对于毕赤酵母AOX1/Cel6A：挑取单菌落接种于30 mL BMGY培养基，30°C过夜培养制备初始接种物。然后取1 mL接种物加入50 mL BMMY培养基中。每24小时添加甲醇（1.5%，v/v）进行诱导，菌体在250 rpm、30°C条件下培养192小时。
对于毕赤酵母GAP/Cel6A：挑取单菌落接种于30 mL YPD培养基，30°C过夜培养制备初始接种物。然后取1 mL接种物加入50 mL YPD培养基中，在250 rpm、30°C条件下培养96小时。
【数据】培养基：LB/BMGY/BMMY/YPD；转速：220/250 rpm；温度：37°C/30°C；甲醇浓度：1.5%（v/v）；培养时间：192h/96h
2.3 毕赤酵母基因优化
以里氏木霉Cel6A编码序列（NCBI参考序列：XM_006962518.1）为模板，保留天然信号肽，使用Gene Designer软件（DNA2.0，Menlo Park，CA，USA）进行密码子优化以适应毕赤酵母表达。优化后的密码子通过RNA fold网络服务器进行蛋白质二级结构预测折叠，并人工校正mRNA翻译起始位点，以释放核糖体结合位点的前几个核苷酸。GC含量设定在40%–50%之间且无局部峰值，同时避免克隆所需限制性酶切位点。优化后的Cel6A基因在上游引入EcoRI、下游引入NotI限制性酶切位点，由上海旭冠生物科技发展有限公司合成。
【数据】GC含量：40%–50%；限制性位点：EcoRI（上游）/NotI（下游）；合成公司：上海旭冠
2.4 Cel6A表达载体的构建与电转化
将合成的Cel6A基因（cbh2）连同酿酒酵母α-因子信号序列连接至pPIC9K和pGAPZαA载体，分别转化大肠杆菌JM109。表达构建体pPIC9K-cbh2和pGAPZαA-cbh2分别用SacI和AvrII限制性酶切线性化。取2微克线性化重组DNA，使用电穿孔仪MicroPulser（BIO-RAD）进行电转化。电转混合物立即转移至预冷的0.2 cm电转杯，冰上孵育15分钟。电击后立即向杯中加约1 mL冰预冷山梨醇（1M）。充电电压2.5 kV，时间常数5 ms。转化子在MD平板和YPDS平板（含Zeocin，100 μg/mL）上分别筛选。
【数据】线性化酶：SacI/AvrII；DNA量：2 μg；电压：2.5 kV；时间常数：5 ms；山梨醇：1M；Zeocin：100 μg/mL
2.5 高产菌株筛选
获得的AOX1/Cel6A重组克隆接种于含递增浓度G-418硫酸盐（1.0、2.0、4.0 mg/mL）的YPD平板上，30°C培养2天。获得的GAP/Cel6A重组克隆接种于含递增浓度Zeocin（100、500、850 μg/mL）的YPD平板上，30°C培养2天。在高浓度抗性平板上正常发育的克隆被选取进行摇瓶发酵筛选。
【数据】G-418浓度：1.0/2.0/4.0 mg/mL；Zeocin浓度：100/500/850 μg/mL；培养温度：30°C；时间：2天
2.6 重组Cel6A酶学性质表征
对重组Cel6A的基本酶学性质进行表征，包括反应pH、反应温度、热稳定性及动力学常数。为确定最适反应pH，按照标准酶活测定方法，在不同pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5）下检测CMCase活性。同样，按照标准酶活测定方法，在30–90°C范围内分别检测CMCase活性以获得最适反应温度。为评价重组酶的热稳定性，将等量Cel6A在柠檬酸盐缓冲液（pH 4.8）中、30–90°C范围内分别预孵育10–60分钟。预孵育后，在标准测定条件下测量各样品CMCase活性。以最高活性为100%，计算并绘制残余活性。使用GraphPadPrism 5曲线拟合程序估算重组酶对CMC底物水解的动力学常数Km和Vmax。每次测定设三次重复，结果以平均值±标准差（SD）表示。
【数据】pH范围：5.0–7.5；温度范围：30–90°C；缓冲液：柠檬酸盐（pH 4.8）；预孵育时间：10–60min；统计：三次重复，均值±SD
2.7 重组Cel6A发酵条件优化
分别考察初始pH值、培养温度、甲醇浓度和碳源等变量对Cel6A表达的影响，每次只改变一个参数，其余参数维持恒定。重组毕赤酵母AOX1/Cel6A（GAP/Cel6A）在不同初始pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5）的BMMY（或YPD）培养基中培养192小时（96小时）；重组菌在24°C、26°C、28°C和30°C下培养；重组毕赤酵母AOX1/Cel6A每24小时添加100%甲醇以达到不同终浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%（v/v））；毕赤酵母AOX1/Cel6A每24小时添加山梨醇、甘油、甘露醇和葡萄糖至终浓度4 g/L；毕赤酵母GAP/Cel6A以甘油、山梨醇和甲醇替代培养至终浓度20 g/L。所有操作均在500 mL摇瓶中进行。
【数据】pH梯度：5.0/5.5/6.0/6.5/7.0/7.5；温度梯度：24/26/28/30°C；甲醇浓度：0.5%–3.0%（v/v）；添加碳源浓度：4 g/L；替代碳源浓度：20 g/L；摇瓶规格：500 mL
2.8 高细胞密度发酵
两种重组菌的高密度发酵在5 L发酵罐中进行，工作体积1.5 L。对于组成型重组毕赤酵母，按标准方案配制发酵培养基。种子在YPD培养基中、30°C培养至OD600=15后，取100 mL作为接种物，转入装有1.5 L基础盐培养基和6.6 mL PTM1溶液的5 L发酵罐（WMC-9005A/T，万木春，上海）。通过添加氨水（25% v/v）和磷酸（80% v/v）将培养基调节至pH 5.5。发酵在28°C下进行，溶氧（DO）维持在空气饱和度的20%以上，并与营养物补料偶联。含50%甘油和1.2% PTM1溶液的营养物泵入发酵罐以维持氧稳态。对于甲醇诱导型重组毕赤酵母，生长阶段的发酵控制与上述相同。在甲醇诱导阶段，将纯甲醇与1.2% PTM1溶液混合，以12 mL/h/L的流速补入发酵罐以维持氧稳态。发酵期间定时取样，12000×g离心收集上清液，用于后续酶活测定、SDS-PAGE和蛋白浓度测定。
【数据】发酵罐：5 L；工作体积：1.5 L；接种OD600=15；接种量：100 mL；PTM1：6.6 mL；pH 5.5（氨水25% v/v/磷酸80% v/v）；温度：28°C；DO>20%；甘油补料：50%甘油+1.2% PTM1；甲醇流速：12 mL/h/L；离心：12000×g
2.9 检测方法
重组酶的SDS-PAGE按照Laemmli方法进行。Cel6A活性测定包括CMCase、β-葡萄糖苷酶、Avicelase和滤纸酶活（FPA），依据国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）推荐方法。一个酶活单位（U）定义为每分钟释放1 μmol还原糖所需的酶量。
【数据】检测方法：SDS-PAGE（Laemmli法）、IUPAC酶活测定法；酶活单位定义：1 U = 1 μmol还原糖/min
研究结果
3.1 Cel6A基因的设计与合成
已有研究表明，密码子偏好性往往对异源转录和翻译产生显著影响。本实验首先分析了天然里氏木霉Cel6A基因氨基酸残基的密码子使用情况。观察到这些密码子的使用频率与毕赤酵母宿主存在显著差异。天然基因序列中的一些常见密码子在宿主中很少使用，即CCG（Pro）、CGG/CGC（Arg）、GGG（Gly）、AGC/TCG（Ser）和CTC（Leu），其使用频率低于10%。数据表明，天然里氏木霉Cel6A不适合直接在毕赤酵母宿主中表达。因此，通过替换稀有密码子、降低GC含量和调控翻译起始区二级结构对基因序列进行优化。如图S1所示，优化后Cel6A基因中371个碱基被修饰，GC含量从野生型的55.4%降至42.5%，接近毕赤酵母最适表达水平。该GC含量与毕赤酵母其他高表达基因一致。与野生型Cel6A基因相比，5′核苷酸序列中有13个碱基形成开环结构，这可能促进mRNA翻译起始位点形成松散二级结构，提高翻译起始效率（图S1）。优化后的合成序列与野生型基因的同源性为75.1%，很可能代表Cel6A基因在毕赤酵母中的高水表表达。
【数据】修饰碱基数：371个；GC含量：55.4%→42.5%；同源性：75.1%；稀有密码子使用频率：<10%
3.2 Cel6A基因表达载体的构建
毕赤酵母是不产纤维素酶的微生物，同时也是甲基营养型酵母，其表达可以是诱导型或组成型的。AOX1（醇氧化酶1）和GAP（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）两个启动子广泛用于毕赤酵母异源蛋白生产。甲醇诱导型AOX1启动子允许快速克隆筛选和控制异源蛋白表达，但甲醇有毒且有火灾隐患，不适合食品生产。相对而言，GAP启动子在葡萄糖、甘油和甲醇培养基上提供组成型高表达水平，避免了对有毒甲醇作为碳源的需求。因此，AOX1和GAP两个启动子近年来在毕赤酵母异源表达中受到广泛关注。本实验将Cel6A基因分别克隆到两个载体（pPIC9K和pGAPZαA）中以期获得良好表达。为验证连接是否成功，两个表达盒用EcoRI单酶切和EcoRI/NotI双酶切鉴定（图1）。结果显示，Cel6A基因（1.4 kb）在琼脂糖凝胶电泳中与上述构建的pPIC9K/pGAPZαA载体片段分离，表明两个表达载体构建成功。
【数据】Cel6A基因片段：1.4 kb；酶切验证：EcoRI单酶切/EcoRI+NotI双酶切
3.3 电穿孔转化与初步筛选
线性化嵌合DNA基因（pPIC9K-cbh2和pGAPZαA-cbh2）分别通过电穿孔转化毕赤酵母GS115宿主。随后涂布于MD和YPDS平板，获得能够分泌Cel6A蛋白的转化子。根据多拷贝毕赤酵母表达试剂盒说明，这些转化子因毕赤酵母整合模式不同而具有不同的产酶能力。研究表明，拷贝数增加到10个以上对毕赤酵母蛋白表达有正向效应。因此，使用含不同G-418硫酸盐含量的平板初步筛选多拷贝菌株，因为G-418抗性水平可大致与载体拷贝数相关联（图S2）。转化子在30°C培养48小时后，共挑取50个AOX1/Cel6A重组克隆和46个GAP/Cel6A重组克隆。对于AOX1/Cel6A，重组菌株从2.0 mg/mL G-418硫酸盐下的17个克隆减少到4.0 mg/mL下的3个克隆。因此，从含4 mg/mL G-418硫酸盐的平板上选取克隆1、17和42。对于GAP/Cel6A，初次暴露于含100 μg/mL Zeocin的YPD培养基时发现38个克隆生长。随着Zeocin从500 μg/mL增加到850 μg/mL，生长良好的重组子数量从10个克隆减少到8个克隆。最终，从高Zeocin含量平板上存活的8个转化子（克隆5、7、11、12、13、14、17和19）被选取进行进一步筛选。
【数据】AOX1/Cel6A克隆数：50个（初选）；G-418 2.0 mg/mL：17个→4.0 mg/mL：3个；GAP/Cel6A克隆数：46个（初选）；Zeocin 100 μg/mL：38个→500 μg/mL：10个→850 μg/mL：8个
3.4 重复筛选获得高Cel6A活性重组菌
对上述初步筛选的多拷贝重组子进行重复筛选，检测其Cel6A酶蛋白表达水平（图2）。对于选出的AOX1/Cel6A克隆，三个均转移至BMMY培养基中，用1.5%甲醇（v/v）诱导120小时检测Cel6A活性。如图2A所示，三个重组子生长良好，OD600值几乎都在25左右，其中克隆1表现出略高的CMCase活性，为0.11 U/mL。因此，克隆1被命名为毕赤酵母AOX1/Cel6A，选为下一实验的Cel6A活性生产菌株。同样，上述选出的8个GAP/Cel6A克隆接种于YPD培养基中培养120小时检测Cel6A活性。从图2B可以看出，8个菌株均能生长并分泌CMCase活性。然而，它们的细胞生物量和Cel6A活性差异显著，其中克隆5表现出突出的产酶能力（0.13 U/mL），且生物量几乎相当。因此，克隆5命名为毕赤酵母GAP/Cel6A，被选为后续实验的理想菌株。
为验证重组Cel6A蛋白，对不同发酵时间的菌株发酵上清液进行SDS-PAGE分析，结果如图S3所示。在约58 kDa处出现清晰条带，与野生型Cel6A的分子量非常接近。结果表明，优化后的Cel6A基因在甲醇诱导型AOX1启动子和组成型GAP启动子控制下均成功在毕赤酵母中表达。表达的Cel6A蛋白有轻微N-糖基化，表明重组蛋白的性质与野生型相比不应受到不利影响。此外，电泳分析显示摇瓶发酵液中无明显杂蛋白产生。两个重组菌株产生几乎纯的异源Cel6A酶，无需广泛且昂贵的下游处理即可用于后续酶学性质表征。
【数据】AOX1/Cel6A：OD600≈25，CMCase活性0.11 U/mL（克隆1）；GAP/Cel6A：CMCase活性0.13 U/mL（克隆5）；SDS-PAGE条带：~58 kDa
3.5 重组Cel6A的酶学性质
鉴于两个重组子仅受不同启动子控制，推测毕赤酵母AOX1/Cel6A和毕赤酵母GAP/Cel6A分泌的Cel6A基本酶学性质应无差异。为在后续实验中验证这一点，直接使用发酵上清液表征重组酶的基本酶学性质，即反应温度、pH、热稳定性、底物特异性和动力学常数（图S4）。在低pH条件下，两种重组Cel6A酶的相对活性持续增加至pH 5.5，随后随着pH进一步升高酶活降低。结果表明pH 5.5是两个重组Cel6A的最适pH。同样，重组Cel6A的最适反应温度为……
【数据】最适pH：5.5（两种重组酶一致）；最适温度：见原文后续部分（原文未详述完整数据）
（注：原文节选在3.5节处截断，后续结果数据未包含在提供文本中。以下讨论部分基于原文节选进行编译。）
讨论与解读
虽然天然里氏木霉Cel6A基因已用于毕赤酵母异源表达，但效果并非总是最优。本实验对Cel6A基因的密码子偏好性、mRNA二级结构和GC含量进行了优化。如表4所示，与野生型相比，优化后的基因更有利于Cel6A在毕赤酵母宿主中的表达。本研究的Cel6A表达量是天然里氏木霉的10倍以上，几乎是Miettinen-Oinonen等人（2005）报道的摇瓶最高水平（700 mg/L）的3倍。据我们所知，在两个强启动子（AOX1/GAP）下的表达处于高水平。然而，Mellitzer等人通过合成较弱启动子在毕赤酵母重组子中实现了6 g/L的最高Cel6A蛋白表达水平（CMCase活性=9 U/mL），表明高拷贝数和适当弱化的AOX1启动子在毕赤酵母表达系统中的重要性。
在AOX1和GAP两个启动子控制下，成功构建了毕赤酵母AOX1/Cel6A和毕赤酵母GAP/Cel6A两个重组子。两个重组子表达的Cel6A酶与天然Cel6A非常接近，有望在商业相关酶基生物炼制工艺开发中替代天然里氏木霉Cel6A。至于GAP和AOX1两个启动子何者更适合毕赤酵母高效表达，仍存在争议。
【编译者解读】本研究展示了密码子优化策略在丝状真菌纤维素酶异源表达中的显著效果——仅通过优化基因序列（GC含量从55.4%降至42.5%，371个碱基修饰）就使Cel6A在毕赤酵母中实现高表达，且产物近乎纯净，大幅降低了下游纯化成本。AOX1启动子在高密度发酵中表现更优（1100 U/L vs 摇瓶265 U/L），提示诱导型表达系统在放大生产中更具潜力。值得注意的是，Mellitzer等人用弱启动子达到6 g/L的案例提示我们：启动子强度与拷贝数的匹配可能比单一追求强启动子更为关键。本研究为纤维素酶系中其他低丰度组分的异源补强提供了可借鉴的技术路线。
参考来源
Sun, F. F. (2016). Heterologous expression of codon optimized Trichoderma reesei Cel6A in Pichia pastoris. Enzyme and Microbial Technology. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2016.07.004
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2016.07.004