来源：Cloning and expression of in silico modeled protein enriched with branched chain amino acids in Pichia pastoris（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
支链氨基酸（BCAA）对慢性肝病的膳食干预具有重要价值。本研究在前期计算机模拟设计含56.4% BCAA的蛋白质三维结构基础上，通过同源建模优化获得Protein Model-51，将其编码基因合成后克隆至pPICZαC载体，并在毕赤酵母X-33中实现分泌表达。重组蛋白经镍亲和纯化获得1.412 mg/L产量，SDS-PAGE和Western blot确认分子量约11 kDa的目标蛋白条带。这是首次将计算机设计的BCAA富集蛋白在毕赤酵母中成功克隆和表达。
研究背景
甲基营养型酵母毕赤酵母（Pichia pastoris，异名Komagataella paffi）已被商业化用于重组蛋白的高效生产[1]，广泛应用于治疗性蛋白的工业制造及多拷贝整合表达[2]。该系统可从毫克级到克级规模生产大量蛋白质[3]，多种食品级重组蛋白已通过醇氧化酶1（AOX1）启动子成功表达[4,5]。AOX1是甲醇利用途径中首个在转录水平受到严格调控的酶[6]，其表达受甲醇诱导，因此控制该酶合成的AOX1启动子被用于重组蛋白的高水平表达[7]。毕赤酵母作为单细胞微生物，易于操作和培养，可在极限培养基中实现高密度生长，并能利用甲醇作为碳源[8]。该系统特别适合外源蛋白表达，具备基因操作便利、胞内或胞外高水平表达以及糖基化、蛋白水解加工、二硫键形成等真核蛋白修饰能力[1]。
研究方法
2.1 材料
化学合成的BCAA基因和小鼠抗His抗体购自美国GenScript公司。毕赤酵母X-33宿主菌株、pPICZαC载体、DH5α化学感受态细胞购自Invitrogen公司。EcoRI和NotI限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Thermo Scientific公司。所有引物由Proteogen Biosciences（印度）合成。DNA和蛋白质标记物购自Hi-media公司。Zeocin、His Select HF Nickle亲和凝胶、ALP偶联的抗小鼠IgG（全分子）二抗购自Sigma公司。
2.2 蛋白质设计
以牛α-乳白蛋白为模板模型，对BCAA富集蛋白进行建模。预测含94个氨基酸的BCAA富集蛋白使用SWISS-MODEL、I-TASSER、RaptorX、ExPASy工具和Allergenonline.com进行建模，如前所述[9]。从Protein Model-50的最终氨基酸序列中删除甲硫氨酸，以便在N末端整合酵母α-分泌因子实现分泌表达。对氨基酸序列进行轻微修饰以获得更高质量的蛋白质模型（命名为Protein Model-51）。对Protein Model-50和Protein Model-51的二级结构预测、三级结构、验证和评估进行比较。在C末端添加六个组氨酸残基（6×His标签），用于重组蛋白的一步纯化和抗His抗体的简便检测。
2.3 反向翻译与密码子优化
将BCAA51建模蛋白（Protein Model-51）的氨基酸序列使用in silico软件（http://in-silico.net/tools/biology/sequence_conversion）反向翻译为核苷酸序列并进行密码子优化。使用NEBcutter服务器（http://www.labtools.us/nebcutter-v2-0/）检查BCAA基因的DNA序列中常见的限制性酶切位点[10]。BCAA51设计的核苷酸序列由GenScript（美国）化学合成。
2.4 转化及阳性转化子筛选
将所得克隆质粒（pPICZαC/BCAA51）通过热激法按Invitrogen方案成功转化至DH5α化学感受态大肠杆菌细胞。阳性转化子在LB-zeocin平板（100 μg/mL）上筛选。使用QIAprep Spin Miniprep Kit提取质粒。使用EcoRI和NotI限制性内切酶进行双酶切，并通过1%琼脂糖凝胶确认。用于扩增BCAA基因的引物由ProteoGen Biosciences India Pvt Ltd合成。引物针对BCAA51基因的N末端和C末端区域特异设计。为便于将BCAA51基因克隆到目标载体中，在正向引物（5′-GAT ATC GAATTC ATG GAG CAG TTA ATC-3′）和反向引物（5′-CTA TAT GCGGCCGC TTA TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG GCC-3′）中分别构建了EcoRI和NotI限制性酶切位点。PCR循环参数设定如下：初始变性2分钟，随后37个循环的95°C 30秒、50°C 30秒和72°C 45秒扩增，最后在72°C延伸10分钟。所得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳（1.0%（w/v）凝胶）分析，使用QIAquick PCR纯化试剂盒进行PCR纯化。DNA序列通过双脱氧链终止法使用自动化DNA测序仪3500 Genetic Analyzer（Applied Biosystems, HITACHI）测定。测序使用针对质粒的T7正向和反向引物，按制造商方案进行。
2.5 毕赤酵母转化
质粒用PmeI限制性内切酶线性化，以便高效整合并通过电穿孔转化至毕赤酵母[11]。线性化质粒pPICZαC/BCAA51通过电穿孔转化至电感受态毕赤酵母X-33。细胞在0.2 cm电转杯（Gene Pulser Xcell 617BR1, Bio-Rad）中以2 kV、25 µF电容和200 Ω电阻进行电击。细胞涂布于YPDS-zeocin平板（100 µg/mL），30°C孵育3–5天生长。观察生长情况，挑取单个菌落接种于YPD-zeocin平板（100 µg/mL）。通过菌落PCR确认BCAA51基因整合至毕赤酵母基因组。
2.6 蛋白质表达及设计蛋白的确认
选择成功转化的毕赤酵母菌落进行大规模生产。将10 mL YPD培养基在30°C、180 rpm振荡培养24小时。细胞转移至500 mL BMGY培养基，30°C、180 rpm振荡培养24小时，直至OD 600 nm达到4–10。细胞在5000 rpm、4°C离心5分钟。细胞重悬于1 L BMMY培养基中。为诱导蛋白质表达，每24小时添加甲醇至终浓度0.5%，持续至96小时。在不同时间间隔收集10 mL培养物，用于分析蛋白质表达水平。培养物（1 L）在5000 rpm、4°C离心5分钟。上清液储存于−20°C备用。蛋白质含量和生长分别通过Bradford法和600 nm吸光度每日记录。SDS-PAGE在12%凝胶上使用Tris-甘氨酸电泳缓冲液按Laemmli方法进行[12]。蛋白凝胶用考马斯亮蓝染色观察，使用标记物估算蛋白质大小。
2.7 金属螯合层析纯化蛋白质
培养上清液在4°C下通过硫酸铵沉淀（0–90%）处理。样品溶液在5000 rpm、4°C离心20分钟。沉淀溶解于最小体积的0.02 M醋酸钠缓冲液（pH 5）中，然后通过Econo-Pac 10 DG柱（BIO-RAD）脱盐。脱盐样品的pH调节至7.5–7.9之间，与500 μL His Select HF Nickle亲和凝胶混合，4°C孵育过夜。混合物在4°C搅拌2–3小时，装柱（30 mL体积）。柱用0.02 M磷酸钠缓冲液洗涤，分别用10 mM、50 mM和250 mM咪唑缓冲液洗脱。蛋白洗脱组分通过SDS-PAGE和Western blotting确认。
2.8 Western blotting
SDS-PAGE后，蛋白条带按Burnette所述方法[13]从SDS-PAGE转移至硝酸纤维素膜。Western blot分析使用小鼠抗组氨酸标签单克隆抗体（Sigma）作为一抗，碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠二抗（Sigma）作为二抗。使用NBT/BCIP（氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐）底物显色。
【数据】菌株：DH5α大肠杆菌、毕赤酵母X-33；载体：pPICZαC；抗生素：zeocin 100 μg/mL；PCR条件：95°C 30s/50°C 30s/72°C 45s×37循环；电转化参数：2 kV、25 µF、200 Ω；诱导剂：0.5%甲醇；纯化：His Select HF Nickle亲和凝胶；洗脱：10/50/250 mM咪唑；SDS-PAGE：12%凝胶
研究结果
3.1 蛋白质设计
在前期研究中，我们已根据WHO/FAO/UNU规定的相对营养水平成功构建了富含BCAA（56.4%）的目标蛋白（Protein Model-50）的3D结构，并使用高声誉生物信息学工具进行了验证[9]。本研究使用SWISS-MODEL、I-TASSER和RaptorX对Protein Model-51进行了轻微修饰建模，特别是对早期模型的N末端氨基酸序列进行了改进，以获得更好的质量特征。此外，从Protein Model-51中删除了起始甲硫氨酸，以便在N末端整合酵母α-分泌因子实现分泌表达。通过SAVES服务器等计算工具对建模蛋白（Protein Model-50和Protein Model-51）进行了比较和评估。近期，Jahangiri等人也开展了类似的外膜蛋白A新型天然结构的计算机模拟设计研究[14]。Protein Model-50和Protein Model-51的图像由ProSA web服务器生成（图1Aa和1Ba）。模型质量可通过基于知识的能量验证，其中负值表明模型无错误（图1Ab和1Bb）。模型的整体质量通过Z-score评估，负值表明模型质量良好（图1Ac和1Bc）。ERRAT服务器验证模型的整体质量因子，结果发现两个模型均在可接受范围内（图1Ad和1Bd）。PROCHECK服务器用于验证Ramachandran图统计数据，发现两个模型中的大多数氨基酸残基位于phi-psi分布的最有利区域（图1Ae和1Be）。Protein Model-50和Protein Model-51均被证明是稳定、正确折叠、可靠且一致的模型。最终Protein Model-51的验证结果在可接受标准范围内，因此Protein Model-51被进一步用于克隆和表达研究。
【数据】BCAA含量：56.4%；模板：牛α-乳白蛋白；验证工具：ProSA-web、ERRAT、PROCHECK
3.2 Protein Model-51的氨基酸序列
在C末端添加六个组氨酸残基（6×His标签），用于重组蛋白的一步纯化以及抗His抗体的简便检测。为终止蛋白质合成，在6×His标签后插入终止密码子（TGA）。在5′和3′端分别引入EcoRI和NotI限制性酶切位点。经过这些修饰后模型质量良好。Protein Model-51的最终氨基酸序列如下：
EQLTKLEIVIRVLKLLKLIGGLVSLVEWVLTALVTLLGDKVLDDILTDVIMLVKKILDKVIGIVYVLAILALILSEVLDILWLLEKLVEILEGHHHHHH
【数据】氨基酸数目：约94个（含His标签）；His标签：C端6×His；终止密码子：TGA
3.3 反向翻译与密码子优化
将建模蛋白（Protein Model-51）的氨基酸序列反向翻译为核苷酸序列，并进行密码子优化以改善毕赤酵母中的异源基因表达。密码子优化旨在实现毕赤酵母（酵母）中的最大表达，使用in silico软件（http://in-silico.net/tools/biology/sequence_conversion）进行。稀有密码子会导致mRNA翻译效率低下、mRNA稳定性降低以及罕见的提前翻译终止[15]。使用NEBcutter工具检查DNA序列（BCAA51基因）中的限制性酶切位点。该工具对决定用于克隆DNA的限制性酶切位点非常有帮助。该序列不包含任何常见限制性酶切位点，如EcoRI、NotI、PmeI等。这是一个额外优势，因为可以使用这些限制性酶切位点将基因克隆到质粒中。合成DNA的GC和AT含量分别为39%和61%。
【数据】GC含量：39%；AT含量：61%；限制性位点：无EcoRI/NotI/PmeI等常见位点
3.4 克隆载体构建、转化与双酶切
将带有6×His标签密码子的BCAA51基因序列送至GenScript（美国）合成。合成的BCAA51基因（DNA序列）使用EcoRI和NotI限制性酶切位点与pPICZαC载体连接。重组pPICZαC/BCAA51的基因构建总览如图2所示。
含合成DNA的质粒（pPICZαC/BCAA51）通过热激法转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。转化后，挑取的菌落在37°C振荡培养过夜。划线平板上观察到菌落生长，表明转化效率良好。图3A展示了从菌落#8和#10提取的质粒DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳图。两个菌落（菌落#8和#10）中均观察到重组质粒DNA条带，大小约为3.9 kb。质粒条带位于4 kb以下，即3.9 kb处，确认转化成功（图3A）。穿梭载体pPICZαC大小为3.6 kb，插入DNA（BCAA51基因）额外增加了0.3 kb。因此，质粒DNA（pPICZαC/BCAA51）长度应为3.9 kb。该结果表明阳性菌落含有预期大小的目标质粒（pPICZαC/BCAA51）。
使用限制性内切酶（EcoRI和NotI）进行双酶切，并通过0.8%琼脂糖凝胶电泳确认，如图3B所示。与高范围和低范围DNA ladder比较，质粒DNA（pPICZαC/BCAA51-10）显示两条条带：一条在约3.6 kb处的明显条带，另一条在300碱基对处（即200至400碱基对之间）（图3B）。结果表明，在泳道1中观察到质粒和基因插入片段的预期大小（图3B）。上条带代表pPICZαC质粒（3.6 kb），下条带代表BCAA51基因插入片段（317 bp）。这与图3A所示的重组质粒（质粒+插入片段）长度一致。
DNA测序确认了BCAA51基因在大肠杆菌中的存在。DNA测序结果显示BCAA51基因的序列顺序正确，与计算机模拟设计的序列完全匹配。DNA测序确认了构建体与ATG和C末端六组氨酸标签的读框一致。
【数据】质粒大小：pPICZαC为3.6 kb；重组质粒：3.9 kb；基因插入片段：317 bp；双酶切：EcoRI+NotI
3.5 毕赤酵母转化
将确认的质粒（pPICZαC/BCAA51-1）用限制酶PmeI线性化，线性化质粒通过电穿孔转化至电感受态毕赤酵母X-33。阳性重组毕赤酵母细胞在含zeocin（100 µg/mL）的YPDS平板上筛选，平板在30°C孵育直至菌落可见（3–5天）。孵育3天后，YPDS zeocin琼脂平板上可见多个zeocin阳性菌落。通过菌落PCR确认BCAA51基因整合至毕赤酵母基因组。选择毕赤酵母菌落#10进行菌落PCR。图3C中，泳道1的清晰条带表明存在BCAA51基因，大小为317 bp。泳道2中的条带较大，原因是包含了BCAA正向引物和AOX1反向引物的AOX区域（图3C）。如预期所料，泳道3中未观察到条带，该泳道为不含BCAA51基因的毕赤酵母X-33野生型（未转化）菌株（图3C）。选择毕赤酵母菌落#10进行大规模蛋白质表达。
【数据】筛选平板：YPDS+zeocin 100 µg/mL；孵育：30°C、3–5天；菌落PCR条带：317 bp
3.6 毕赤酵母系统中的大规模蛋白质生产
菌落PCR确认后，使用携带BCAA51基因的毕赤酵母克隆进行大规模蛋白质表达。选择毕赤酵母菌落#10进行此目的，因为基因整合已通过菌落PCR确认。大规模蛋白质表达通过向1 L BMMY培养物中添加0.5%甲醇（终浓度）作为碳源进行诱导，每24小时一次，持续至144小时（6天）。毕赤酵母0至144小时的生长曲线如图4A所示。培养液的OD值在A600处测量以确定毕赤酵母的生长。A600处的光密度通常用于监测毕赤酵母和细菌的生长[16]。从图4A可以看出，生长逐渐增加至96小时，之后生长趋于平稳。
SDS-PAGE分析显示了重组BCAA51基因在毕赤酵母中的蛋白表达（图4B）。在24、48、72和96小时收集的样品中，约11 kDa处观察到蛋白质条带。
【数据】诱导：0.5%甲醇、每24小时、至144h；生长监测：A600；蛋白条带：~11 kDa
讨论与解读
本研究成功实现了计算机模拟设计的BCAA富集蛋白在毕赤酵母中的克隆与表达。重组蛋白通过His Select Nickel亲和柱层析纯化，最终产量为1.412 mg/L。SDS-PAGE和Western blotting确认了重组蛋白的成功表达。据我们所知，这是首次尝试在毕赤酵母中克隆和表达计算机设计的BCAA富集蛋白。该BCAA富集蛋白可能用于慢性肝病的膳食治疗。随着合成生物学和计算生物学方法的发展，我们现在能够设计新型蛋白质和含密码子优化的合成DNA，以生产新型营养或治疗性蛋白质。该方法在医学、农业和食品工业中具有挑战性和前景广阔的未来。本工作的未来方向在于生产携带这些重组BCAA富集蛋白的转基因植物或微生物（如乳酸杆菌）。然而，这一策略将在未来探索，同时考虑食品安全规则和法规。
编译者解读
本研究展示了典型的"计算机设计—基因合成—异源表达"合成生物学闭环流程。方法上的亮点在于将in silico蛋白设计与毕赤酵母真核表达系统结合，利用AOX1启动子实现甲醇诱导的分泌表达，并通过His标签实现一步纯化。1.412 mg/L的产量在实验室规模尚可，但距离商业化应用仍有距离——未来可通过密码子进一步优化、多拷贝整合或发酵条件优化（如甲醇流加策略）提升产量。值得肯定的是，该研究为计算机设计的营养型蛋白从序列到蛋白的完整验证提供了可复制的技术范式，对食品级重组蛋白开发具有参考价值。
参考来源
期刊：International Journal of Biological Macromolecules, 2020
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2019.10.133
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2019.10.133