毕赤酵母表达抗蝎毒神经毒素单链抗体及功能表征

来源：Expression and characterization of scFv-6009FV in Pichia pastoris with improved ability to neutralize the neurotoxin Cn2 from Centruroides noxius（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：代谢通路设计

导读

蝎子蜇伤是全球公共卫生问题，年发生率约150万例，死亡2600人。单链抗体（scFv）因其分子小、特异性强，是理想的抗毒素候选分子。本研究在甲醇营养型酵母毕赤酵母中成功表达了靶向蝎毒神经毒素Cn2的单链抗体scFv-6009FV，产量达31.6±2 mg/L，其IC50较大肠杆菌表达产物改善40%，并在小鼠离体中和实验中有效中和Cn2毒素及全蝎毒。该工作为抗蝎毒抗体的真核表达系统提供了新选择。

研究背景

单克隆抗体和抗蝎毒血清是治疗动物中毒的关键生物药物。传统抗蝎毒血清来源于超免疫动物血浆，含有高度多样化的抗体谱。新一代抗蝎毒策略倾向于使用重组毒素作为免疫原，产生IgG、Fab和scFv等抗体片段。scFv由重链和轻链可变区（VH和VL）通过柔性连接肽拼接而成，缺乏Fc区，因此不具备抗体依赖细胞毒性和补体依赖性细胞毒性等效应功能。毕赤酵母作为真核表达宿主，具备蛋白折叠、翻译后修饰和分泌表达的能力，且比哺乳动物细胞培养更经济。本研究旨在利用毕赤酵母表达针对墨西哥蝎Centruroides noxius神经毒素Cn2的功能性scFv-6009FV，并与大肠杆菌表达产物进行比较。

研究方法

2.1 试剂

培养基、分子生物学及蛋白组学试剂购自Sigma-Aldrich（美国）：LB肉汤、LB琼脂、MD肉汤、KH₂PO₄、NH₄HCO₃、Na₃PO₄、甘油、溴化乙锭、琼脂糖、氨苄青霉素、组氨酸、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、巯基乙醇、TEMED、Tween 20、Tris-HCl、SDS、脱氧胆酸钠、咪唑、乙酸乙酯、TFA、葡萄糖、琼脂、山梨醇、生物素、甲醇、KCl、氢氧化铝、氯胺酮、甲苯噻嗪、糜蛋白酶；Thermo Scientific™（美国）：YNB、T4 DNA连接酶、1-Step™ NBT/BCIP底物溶液、PageRuler™ Plus预染蛋白Marker（10–250 kDa）、蛋白胨、碘乙酰胺、胰蛋白酶、甲酸、乙腈、弗氏佐剂；Taylor Scientific：酵母提取物BBL™；Invitrogen™（美国）：pPIC9、EcoRI、AvrII、SalI、T4 DNA连接酶、5′和3′ AOX引物、6His-tag单克隆抗体AP、山羊抗兔IgG CH+L HRP、HRP；Bio-Rad（美国）：考马斯亮蓝R-250、Bradford试剂；Fisher Scientific（美国）：NaCl；Roche（德国）：Anti-His6-peroxidase、ABTS。C. noxius（Hoffmann, 1932）全蝎毒及Cn2毒素购自Octolab（墨西哥韦拉克鲁斯州哈拉帕）。此外，Cn2此前已通过Sephadex G-50凝胶过滤和阳离子交换色谱从蝎毒中分离并表征[23,45]。

【数据】试剂来源：Sigma-Aldrich、Thermo Scientific™、Taylor Scientific、Invitrogen™、Bio-Rad、Fisher Scientific、Roche；Cn2毒素来源：Octolab，经Sephadex G-50凝胶过滤和阳离子交换色谱纯化

2.2 生物材料

scFv-6009FV的转化和表达使用营养缺陷型菌株毕赤酵母GS115（Thermo Fisher Scientific™, Invitrogen™，美国）。该菌株在组氨醇脱氢酶位点（his4）存在基因缺失，因此通过含有该基因的pPIC9质粒进行恢复。质粒的繁殖、克隆和亚克隆步骤使用One Shot™ TOP10F’化学感受态大肠杆菌（Thermo Fisher Scientific™ Invitrogen™，美国）。E. coli TG1 pSyn1-scFv-6009F [23]由Dr. Baltazar Becerril Lujan和Dra. Lidia Riaño Umbarila（IBt-UNAM）惠赠，用于基因模板扩增及作为对照表达scFv-6009F。兔高免疫血清制备使用两只雌性新西兰大白兔，2月龄，体重3.5±0.2 kg。选择雌兔以减少攻击行为。Cn2抑制实验使用CD-1小鼠，性别不限，体重18–20 g，6周龄。动物实验按照墨西哥国立自治大学生物技术研究所生物伦理委员会动物护理指南（伦理批准号IBt/Project #411）执行，该指南遵循墨西哥官方标准（NOM-062-ZOO-1999）及《实验动物护理和使用指南》（2011，美国国家研究委员会）。兔和小鼠均在常规兽医护理下妥善处理以减少痛苦和不适，饮水和饲料自由摄取。实验在IBt-UNAM动物设施中进行。

【数据】毕赤酵母菌株：GS115（his4缺陷）；大肠杆菌菌株：One Shot™ TOP10F’、TG1 pSyn1-scFv-6009F；兔：雌性新西兰大白兔，2只，2月龄，3.5±0.2 kg；小鼠：CD-1，18–20 g，6周龄；伦理批准号：IBt/Project #411

2.3 载体与菌株构建

scFv-6009F的DNA编码序列来自此前构建并在E. coli TG1菌株中表达的pSyn1质粒[23]。使用SnapGene® viewer 6.1（Dotmatics）和Gene Designer 2.0（Atum）生物信息学软件进行新载体pPIC9-scFv-6009FV的计算机设计和组装。从过夜培养物中，使用GeneJET质粒小提试剂盒（Thermo Fisher Scientific™，美国）从含100 μg/mL氨苄青霉素的LB肉汤培养基中的E. coli TG1中纯化含scFv-6009F编码序列的pSyn1质粒。设计特异性引物扩增scFv-6009F插入片段，正向引物5′-GTAGAATTCGAGGTGCAGCTGGTGG-3′和反向引物5′-GCCCTAGGTTATTAATGGTGATGATGGTG-3′，含EcoRI和AvrII限制性酶切位点（下划线标注）。PCR条件如下：95°C初始变性1分钟，然后30个循环：95°C变性30秒，70°C退火40秒，72°C延伸90秒，最后72°C延伸10分钟。目标扩增产物807 bp经2%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，使用GeneJET凝胶回收试剂盒（Thermo Fisher Scientific™，美国）纯化。pPIC9质粒和扩增片段（本文命名为scFv-6009FV）分别用EcoRI和AvrII限制酶消化，然后在含T4 DNA连接酶的单次反应中连接，按制造商说明操作。插入片段在载体中的正确克隆（本文命名为pPIC9-scFv-6009FV）通过核苷酸测序确认，并在化学感受态大肠杆菌中繁殖。随后从阳性克隆（本文命名为E. coli-pPIC9-scFv-6009FV）中分离质粒，通过标准方法电转化入毕赤酵母GS115[46]。简言之，取1.2 μg从E. coli-pPIC9-scFv-6009FV过夜培养物中纯化的pPIC9-scFv-6009FV质粒，用SalI消化以促进酵母基因组重组，加入80 μL毕赤酵母GS115感受态细胞于0.2 cm电转杯中。冰上孵育5分钟，立即使用Eppendorf Eporator®施加2.5 kV电脉冲。脉冲后，细胞重悬于1 mL冰预冷1 M山梨醇中。然后30°C静置孵育3小时，回收细胞涂布于不含组氨酸的BMMY（2%（w/v）葡萄糖、1.5%（w/v）琼脂和1.34%（w/v）YNB）琼脂平板上进行营养缺陷型筛选，28°C孵育5天至菌落形成。挑选的菌落通过PCR和基因组测序使用商业引物5′和3′ AOX确认。阳性菌落（本文命名为P. pastoris GS115-scFv-6009FV）于−80°C甘油中冷冻保存用于后续实验。

【数据】PCR条件：95°C 1 min初始变性；30个循环（95°C 30 s变性，70°C 40 s退火，72°C 90 s延伸）；72°C 10 min终延伸；扩增产物：807 bp；电转化：1.2 μg质粒，SalI消化，80 μL感受态细胞，0.2 cm电转杯，2.5 kV；恢复：1 mL冰预冷1 M山梨醇，30°C静置3 h；筛选平板：BMMY琼脂（2%葡萄糖、1.5%琼脂、1.34% YNB），无组氨酸，28°C培养5天

2.4 培养条件与单链抗体表达

动力学参数和蛋白产量在转化菌株中进行评估。对于P. pastoris GS115-scFv-6009FV，使用两种不同培养基进行表达和比较。首先，将P. pastoris-scFv-6009FV冻存管接种于BMGY复合培养基（1%（w/v）酵母提取物、2%（w/v）蛋白胨、1%（w/v）甘油、100 mM磷酸钾、1.34%（w/v）YNB、4×10⁻⁵%生物素，pH 6.0）中，使用250 mL带挡板摇瓶，装液量50 mL。初始培养在28°C、250 rpm恒温振荡（211DS摇床，Labnet International Inc.，美国）下进行，直至两种培养基中光密度（OD₅₉₅ₙₘ）达到2吸光度单位（A.U.），使用SpectraMax Plus 384酶标仪（Molecular Devices, LLC，美国）测定。然后，细胞通过高速离心机5430（Eppendorf，德国）7000 rpm离心10分钟从培养上清中收集。取1 A.U.（OD₅₉₅ₙₘ）酵母细胞重悬于含甲醇的复合诱导培养基BMMY（1%（w/v）酵母提取物、2%（w/v）蛋白胨、0.5%（w/v）甲醇、100 mM磷酸钾、1.34%（w/v）YNB、4×10⁻⁵%生物素，pH 6.0）和含甲醇的最低诱导培养基BMM（100 mM磷酸钾、1.34% YNB、0.5%甲醇、4×10⁻⁵%生物素，pH 6.0）中，使用250 mL带挡板摇瓶，装液量50 mL。摇瓶再次在28°C、250 rpm恒温振荡培养96小时。为促进酵母生长和重组蛋白表达，每24小时向摇瓶补充0.5%（v/v）纯甲醇。随后，在0、6、12、24、36、48、60、72、84和96小时收集1 mL培养样品，通过OD₅₉₅ₙₘ测定生物量积累并评估分泌蛋白。蛋白评估时，收集1 mL培养样品，7000 rpm离心，上清保存于−80°C用于后续分析。培养结束时，总上清通过7000 rpm离心收集，储存于−80°C用于后续亲和纯化。

【数据】培养基：BMGY（1%酵母提取物、2%蛋白胨、1%甘油、100 mM磷酸钾、1.34% YNB、4×10⁻⁵%生物素，pH 6.0）；BMMY（1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.5%甲醇、100 mM磷酸钾、1.34% YNB、4×10⁻⁵%生物素，pH 6.0）；BMM（100 mM磷酸钾、1.34% YNB、0.5%甲醇、4×10⁻⁵%生物素，pH 6.0）；培养条件：28°C、250 rpm、96 h；甲醇诱导：每24 h补加0.5%（v/v）；接种密度：1 A.U.（OD₅₉₅ₙₘ）；取样时间点：0–96 h共10个时间点；离心：7000 rpm 10 min

研究结果

3.1 重组菌株P. pastoris GS115-scFv-6009FV的构建

所得载体由pPIC9质粒和807 bp的scFv-6009F序列组成，添加了EcoRI和AvrII限制性酶切位点以利于克隆（图1A）。由于限制性酶切位点的引入，新构建体在N端添加了12个核苷酸（TACGTAGAATTC），编码酪氨酸、缬氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸（YVEF）（图S1和图1B）。此外，pPIC9载体包含α-factor氨基酸序列，通过ER-高尔基体途径诱导重组蛋白分泌；甲醇诱导启动子序列pAOX1用于蛋白表达；营养缺陷型筛选基因HIS4用于毕赤酵母GS115阳性克隆筛选。

毕赤酵母具有在ER-高尔基体中对蛋白进行N-甘露糖基化的途径[65,66]。因此，我们使用生物信息学软件NetNGlyc-1.0[47]评估了蛋白序列中潜在的N-甘露糖基化位点。结果提示该蛋白无N-甘露糖基化位点（数据未显示）。接下来，从pSyn1（图S2）获得scFv-6009F的核苷酸序列，按照DNA连接酶方案连接到pPIC9中。片段连接通过PCR使用商业可用的5′和3′ AOX引物验证，扩增质粒中已克隆的scFv-6009F区域。结果在2%琼脂糖凝胶电泳上观察到1288 bp的扩增产物（图1C）。

构建验证后，将pPIC9-scFv-6009FV质粒转化入毕赤酵母，酵母克隆在不含组氨酸的培养基中生长筛选。孵育五天后，挑取菌落并通过5′和3′ AOX引物基因组PCR验证。结果再次显示1288 bp的扩增产物（图1D），表明scFv-6009FV正确整合入毕赤酵母GS115基因组。使用5′和3′引物的DNA自动测序（数据未显示）确认了大肠杆菌和毕赤酵母中正确的核苷酸连接和基因组整合。

【数据】载体：pPIC9 + 807 bp scFv-6009F；新增核苷酸：12 bp（TACGTAGAATTC），编码YVEF；PCR验证扩增产物：1288 bp；N-糖基化预测：无位点（NetNGlyc-1.0）

3.2 毕赤酵母GS115-scFv-6009FV的生长动力学与蛋白表达

我们在两种不同培养基——BMMY复合培养基和BMM最低培养基中评估重组scFv-6009FV的生产，使用250 mL自制改良带挡板摇瓶，装液量50 mL。毕赤酵母GS115-scFv-6009FV先在BMGY复合培养基中生长以积累生物量，然后接种至BMMY和BMM培养基进行蛋白生产，每24小时添加0.5% v/v纯甲醇以维持96小时内的蛋白诱导。动力学参数在线性标度上绘制。

结果显示，在96小时时，BMMY和BMM培养基中最大生物量积累分别为19.3±0.2和6.2±0.0 A.U.（OD₆₀₀ₙₘ）（图2A）。重组菌株在两种培养基中的比生长速率（μ）通过对数生物量图获得（图2B）。结果显示BMMY和BMM培养基中分别为0.096±0.002和0.065±0.007 h⁻¹（表1）。

【数据】最大生物量（96 h）：BMMY 19.3±0.2 A.U.，BMM 6.2±0.0 A.U.（OD₆₀₀ₙₘ）；比生长速率μ：BMMY 0.096±0.002 h⁻¹，BMM 0.065±0.007 h⁻¹

3.3 重组scFv-6009FV的SDS-PAGE分析与免疫检测

通过12% SDS-PAGE检测毕赤酵母GS115-scFv-6009FV上清中重组scFv-6009FV的存在，并使用识别重组scFv-6009FV的6 His标签的抗体进行WB免疫检测。每次培养结束（96小时）收集的上清按材料与方法处理，每种培养基取10 μg总蛋白进行分析。结果显示，重组蛋白scFv-6009FV在BMMY（图3A泳道2和3）和BMM（图3B泳道2和3）中均表达并分泌，检测到表观分子量约28 kDa的条带（黑色箭头）。值得注意的是，使用anti-His6抗体的WB结果也证实了两种培养条件下上清中重组蛋白的存在：BMMY（图3C泳道2和3）和BMM（图3D泳道2和3）。WB未观察到任何额外条带，表明该蛋白在我们培养条件下可能以单体形式分泌且无蛋白水解降解。为估算上清中重组蛋白的产量和得率，我们使用Image J V1.53k进行光密度图像分析（表1）。

【数据】SDS-PAGE：12%；上样量：10 μg总蛋白；表观分子量：约28 kDa；检测方法：anti-His6抗体WB

3.4 Ni-NTA纯化scFv-6009FV

重组蛋白scFv-6009FV从毕赤酵母GS115-scFv-6009FV上清中通过Ni-NTA柱（Qiagen，美国加利福尼亚州圣地亚哥）亲和层析处理，按材料与方法所述。从Ni-NTA柱洗脱的组分通过SDS-PAGE和anti-His6抗体WB免疫检测分析。结果表明重组scFv-6009FV被成功识别、结合并从柱上洗脱（图5）。由于WB中观察到的双条带（图5A和B），我们决定对scFv-6009FV进行计算机分析，通过不同算法预测潜在的糖基化谱，并比较该表达宿主中可能被修饰的甘露糖基化残基（表2）。

【数据】纯化方法：Ni-NTA亲和层析；洗脱：30 mM和300 mM咪唑；检测：SDS-PAGE + anti-His6 WB；观察现象：双条带

3.5 重组scFv-6009FV的二级结构

通过远紫外圆二色（CD）光谱测定毕赤酵母和大肠杆菌中产生的重组scFv-6009FV的二级结构（图6A），重组蛋白浓度为15 μg/mL，25°C。使用K2D3在线软件[50]对毕赤酵母来源的重组scFv-6009FV的CD数据进行分析，结果显示二级结构由6.1% α-螺旋、49.1% β-折叠和44.8%不规则结构组成（图6，表3）。我们通过I-TASSER（Iterative Threading ASSEmbly Refinement）蛋白质结构与功能预测工具进行了3D预测模型（图6B），通过IMGT/V-Quest分析并用ChimeraX可视化。预测结果显示α-螺旋、β-折叠和不规则二级结构分别为3.3%、62.2%和34.5%。我们的大肠杆菌scFv-6009F CD数据显示α-螺旋和不规则结构增加；另一方面，β-折叠含量减少（见表3）。

【数据】CD检测条件：15 μg/mL，25°C；毕赤酵母来源scFv-6009FV二级结构：6.1% α-螺旋、49.1% β-折叠、44.8%不规则结构；I-TASSER 3D预测：3.3% α-螺旋、62.2% β-折叠、34.5%不规则结构

3.6 产量与生产参数比较

通过光密度分析比较了BMMY和BMM两种培养基中毕赤酵母GS115-scFv-6009FV的生产参数。结果显示，BMMY培养基中重组scFv-6009FV的产量显著高于BMM培养基，最高产量达31.6±2 mg/L（表1，图4）。体积生产率（q）和得率（Y）等参数也呈现相同趋势。

【数据】最高产量：31.6±2 mg/L（BMMY培养基）；产量比较：BMMY > BMM

3.7 兔免疫血清与亲和纯化

使用毕赤酵母产生的重组scFv-6009FV免疫新西兰大白兔，免疫方案为：初始剂量在第0周和第1周注射，之后每周注射一次并逐步增加抗原量（图7）。兔血清中抗体的存在通过SDS-PAGE和WB评估（图8A和B）。使用抗体免疫亲和层析纯化scFv-6009FV（图8C）。

【数据】免疫方案：第0周和第1周初始剂量，之后每周增加剂量；检测方法：12% SDS-PAGE + WB

3.8 Cn2神经毒素识别与IC50测定

通过ELISA评估重组scFv-6009FV对Cn2神经毒素的识别能力。毕赤酵母来源的scFv-6009FV（蓝色方块）和大肠杆菌来源的scFv-6009F（红色圆圈）的IC50值通过曲线确定（图9）。结果显示，毕赤酵母来源的scFv-6009FV的IC50值比大肠杆菌来源的scFv-6009F改善40%。

【数据】IC50：毕赤酵母来源scFv-6009FV较大肠杆菌来源scFv-6009F改善40%

3.9 小鼠离体中和实验

设计了离体中和实验方案（图10），将重组scFv-6009FV与纯Cn2毒素或C. noxius全蝎毒预孵育后注射小鼠，评估其保护效果。结果显示，scFv-6009FV能够在离体条件下中和纯Cn2毒素和C. noxius全蝎毒，在小鼠救援实验中表现出保护作用。

【数据】实验模型：CD-1小鼠；中和对象：纯Cn2毒素和C. noxius全蝎毒；结果：scFv-6009FV有效中和

3.10 scFv与Cn2毒素的分子相互作用

通过计算机模拟分析scFv与Cn2毒素的分子相互作用（图11A）。将scFv-6009FV+Cn2复合物（紫色和黄色丝带）与scFv 9004G+Cn2晶体结构（蓝色和红色丝带）进行结构比较，RMSD值为0.358 Å。图像放大显示了相互作用界面的细节。

【数据】结构比较：scFv-6009FV+Cn2 vs scFv 9004G+Cn2；RMSD：0.358 Å

讨论与解读

蝎子蜇伤全球年发生率约150万例，导致2600人死亡，是美洲、中东、印度和非洲等地区的公共卫生问题。蝎毒含有神经毒性蛋白、盐类、酸性蛋白等成分。利用抗体——特别是能结合并中和毒素的scFv——是灭活蝎毒的有效策略之一。已有多种scFv在大肠杆菌系统中表达，但存在产量低或形成包涵体的问题。本研究选择非常规甲醇营养型酵母毕赤酵母表达功能性抗体scFv-6009FV，利用甲醇诱导启动子实现蛋白分泌表达。

在建立小规模生物过程培养条件时，发现结果存在差异，特别是生长动力学方面，这可能与培养基组成有关[68–71]。BMMY是缓冲复合培养基，而BMM是最低培养基，因此BMMY中预期获得更高的生物量积累和比生长速率。此外，摇瓶培养条件下存在氧气摄取限制。

编译者解读：本研究展示了毕赤酵母作为scFv表达宿主的实用价值——31.6±2 mg/L的摇瓶产量虽非极致，但可溶性分泌表达避免了包涵体复性步骤，且IC50较大肠杆菌产物改善40%提示真核表达系统在抗体活性维持上的优势。质谱确认无糖基化修饰这一点尤为关键，消除了酵母N-甘露糖基化对抗体功能影响的顾虑。从合成生物学应用角度看，该工作为蝎毒抗体的规模化生产提供了可行路径，未来若结合高密度发酵和启动子工程，产量有望进一步提升。

参考来源

Adame M. Expression and characterization of scFv-6009FV in Pichia pastoris with improved ability to neutralize the neurotoxin Cn2 from Centruroides noxius. International Journal of Biological Macromolecules, 2024.

DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.133461

DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.133461