来源：RS24090, a TetR family transcriptional repressor, negatively affects the rimocidin biosynthesis in Streptomyces rimosus M527（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
TetR家族调控因子（TFRs）通常作为阻遏蛋白，参与链霉菌次生代谢产物生物合成的调控。本研究通过转录组分析，从Streptomyces rimosus M527中鉴定出一个差异表达显著的调控蛋白RS24090，经系统发育与结构比对确认其属于TetR家族，命名为TetR24。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除TetR24后，rimocidin产量较野生型提高38.08%；过表达该基因则使产量下降40.31%。EMSA与DNase I足迹分析证实TetR24通过结合rimA和rimR2启动子区域直接抑制rim基因转录，从而负调控rimocidin生物合成。
研究背景
链霉菌是广泛分布于土壤中的革兰氏阳性菌，以其复杂的形态分化和次生代谢过程著称，是发掘次生代谢产物的重要生物资源。聚酮类化合物作为链霉菌产生的重要次生代谢产物，具有多样的结构和功能，已在农业（杀虫剂、生物除草剂）和医药等领域得到应用。已有研究表明，多种调控蛋白参与链霉菌次生代谢产物的生物合成，形成复杂的调控网络。TetR家族调控因子是链霉菌中最常见的转录调控因子之一，可作为途径特异性或全局性调控因子发挥作用，通过其DNA结合域识别并结合靶基因启动子区来调控转录。TFRs通常被视为次生代谢生物合成的阻遏蛋白。例如，Fu等人报道XdhR负调控天蓝色链霉菌中放线紫红素的生物合成，ΔxdhR突变体中放线紫红素产量提高2.5倍；Gou等人发现CalR3同样作为负调控因子发挥作用。然而，TFRs在S. rimosus M527中调控rimocidin生物合成的具体作用尚不清楚。
研究方法
2.1 质粒、菌株与引物
本研究所用质粒和菌株列于表1。大肠杆菌JM109用于基因克隆；大肠杆菌BL21(DE3)用于蛋白表达；大肠杆菌ET12567/pUZ8002作为大肠杆菌-链霉菌接合转移的供体菌株。质粒pCRISPomyces-2用于通过CRISPR/Cas9技术敲除S. rimosus M527中的基因。质粒pIB139用于链霉菌中的染色体整合和基因过表达。此外，质粒pET-28a(+)用于在大肠杆菌中表达重组六组氨酸标签TetR24（His6-TetR24）蛋白。根据需要添加抗生素：氨苄青霉素（100 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）、氯霉素（25 μg/mL）和安普霉素（50 μg/mL）。S. rimosus M527保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC: M2013270）。本研究所用引物（限制性酶切位点加下划线）列于表2。
【数据】抗生素浓度：氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氯霉素25 μg/mL、安普霉素50 μg/mL；菌株：E. coli JM109、BL21(DE3)、ET12567/pUZ8002；质粒：pCRISPomyces-2、pIB139、pET-28a(+)
2.2 培养基与培养条件
大肠杆菌菌株在LB培养基中于37°C培养。孢子产生和接合转移实验所用MS和2CMC固体培养基按照Song等人的方法配制。S. rimosus M527菌株在CP液体培养基中于28°C、180 rpm振荡预培养48小时。将种子培养物以4%（v/v）接种量接种于含40–50 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，在相同条件下培养72小时。
【数据】培养基：LB、MS、2CMC、CP液体培养基；温度：37°C（E. coli）、28°C（S. rimosus）；转速：180 rpm；时间：48h（预培养）、72h（发酵）；接种量：4%（v/v）；装液量：40–50 mL/250 mL锥形瓶
2.3 转录组分析
转录组数据（登录号：PRJNA872286）及Illumina文库构建遵循Liao等人的方法。基因表达水平采用FPKM（每千碱基转录本每百万测序读段数）进行定量。差异表达基因（DEGs）通过DESeq分析鉴定。
【数据】转录组登录号：PRJNA872286；分析方法：FPKM、DESeq
2.4 系统发育分析
基因的系统发育分析使用NCBI BLAST进行。系统发育树（邻接法）使用MEGA 7.0构建。
【数据】软件：MEGA 7.0；方法：Neighbor-Joining
2.5 RT-qPCR分析
RNA提取和rim基因转录分析遵循Zhao等人和Li等人的方法。
【数据】分析方法：RT-qPCR
2.6 基因敲除、互补与过表达
将TetR24基因序列上传至Benchling在线工具（www.benchling.com），根据评分选择高效sgRNA。按照Cobb等人和Yeo等人的方法，通过Bbs I介导的Golden Gate Assembly将靶向TetR24的sgRNA插入pCRISPomyces-2质粒，获得pCRISPomyces-2-sgRNA。使用引物Pup-F/R和Pdown-F/R分别扩增TetR24的上游和下游同源臂（表2），通过Gibson Assembly将其插入pCRISPomyces-2-sgRNA，生成pSGUD。通过测序确认组装正确。按照Song等人的方法将pSGUD质粒转入野生型S. rimosus M527。所得突变菌株命名为S. rimosus M527-ΔTetR24。对于TetR24互补实验，构建了含TetR24编码区及200-bp启动子序列的pSET152::TetR24质粒，该片段使用引物PTetR24-F和P24-R（表2）扩增。对于S. rimosus M527中TetR24基因过表达，构建了含585-bp TetR24编码区片段的pIB139-TetR24质粒，该片段使用引物P24-F/R（表2）扩增。采用前述接合转移方法将pSET152::TetR24和pIB139-TetR24分别转入M527-ΔTetR24和野生型S. rimosus M527，获得M527-ΔTetR24::TetR24和M527-TetR24菌株。
【数据】sgRNA设计工具：Benchling；同源臂扩增引物：Pup-F/R、Pdown-F/R；互补片段：TetR24编码区+200-bp启动子；过表达片段：585-bp编码区；组装方法：Golden Gate Assembly、Gibson Assembly
2.7 His6标签TetR24蛋白的表达与纯化
使用引物P28a-24-F/R（表2）扩增TetR24基因，插入pET-28a(+)的相应位点，生成pET-28a(+)-TetR24，并经测序确认。His6-TetR24蛋白的表达和纯化按照Li等人的方法进行。
【数据】表达载体：pET-28a(+)；纯化方法：Ni-NTA亲和层析
2.8 蛋白质结构预测
将氨基酸序列提交至I-TASSER服务器（https://zhanglab.dcmb.med.umich.edu/I-TASSER/）进行二级和三维结构预测。I-TASSER通过比较与蛋白质数据银行（PDB）中已知模板的全局和局部相似性来预测蛋白质功能。基于PDB数据库鉴定的模板，使用I-TASSER的线程化算法构建未表征蛋白的结构模型。
【数据】预测工具：I-TASSER；数据库：PDB
2.9 EMSA实验
EMSA按照Li等人描述的方法进行。使用生物素标记引物以S. rimosus M527基因组DNA为模板PCR扩增rim基因的推定启动子区域。同时使用生物素标记探针和未标记探针作为竞争剂。除序列3′端添加生物素外，生物素标记探针的序列与竞争探针完全相同。EMSA使用Light shift化学发光EMSA试剂盒（Thermo, Fisher, MA, USA）按照制造商方案进行。生物素化探针转移至尼龙膜（Millipore）上。
【数据】试剂盒：Light shift Chemiluminescent EMSA Kit（Thermo Fisher）；探针：生物素标记；膜：尼龙膜（Millipore）
2.10 DNase I足迹分析
DNase I足迹分析按照Zheng等人和Cao等人的方法进行。用引物rimR2pF/R和rimApF/R通过PCR扩增rimR2和rimA启动子区域的有义链探针（RimR2p、RimAp），将150–200 bp的扩增产物克隆至pMD-18 T载体（TaKaRa）。使用引物M13F-FAM和M13-R生成荧光染料6-羧基荧光素（FAM）标记的探针。FAM标记探针经胶纯化后，在有或无TetR24的条件下于反应缓冲液中孵育，随后进行DNase I消化和分析，具体步骤如Cao等人所述。TetR24保护的DNA序列输入RegPredict进行分析。
【数据】载体：pMD-18 T载体（TaKaRa）；荧光标记：FAM；启动子片段长度：150–200 bp；分析工具：RegPredict
2.11 rimocidin的HPLC分析
rimocidin的HPLC分析按照Zhao等人描述的方法进行。使用Supersil ODS2色谱柱（4.6 × 150 mm，5 μm）通过高效液相色谱（HPLC）分析上清液中rimocidin的产量，流速为1.0 mL/min。
【数据】色谱柱：Supersil ODS2（4.6 × 150 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min
2.12 统计分析
统计分析按照Li等人描述的方法进行。所有实验至少进行三次，结果以平均值±标准差表示。统计分析采用Student's t检验。
【数据】统计方法：Student's t检验；重复次数：≥3
研究结果
3.1 通过转录组分析筛选出差异表达显著的RS24090
在我们此前的研究中，通过发酵优化提高了rimocidin产量，在最优发酵培养基下，摇瓶实验中S. rimosus M527的rimocidin产量从0.11 ± 0.01 g/L提高至0.23 ± 0.02 g/L。基于比较转录组数据（正常培养基与优化培养基中的S. rimosus M527）（登录号：PRJNA872286），共有11个预测编码TetR家族转录调控因子的差异表达基因（表S1）。其中，RS24090、RS08820和RS04030基因的差异表达最为显著。通过qRT-PCR验证转录组数据，结果显示正常培养基发酵后RS24090基因的转录水平在24 h、48 h和72 h三个时间点分别显著高于优化培养基中的对应值（2.10倍、4.77倍和2.26倍），与转录组数据最为接近。因此，选择RS24090基因进行后续实验。
【数据】rimocidin产量：0.11 ± 0.01 g/L → 0.23 ± 0.02 g/L；RS24090差异倍数：2.10倍（24h）、4.77倍（48h）、2.26倍（72h）；差异表达基因数：11个
3.2 基于系统发育分析和结构模型验证RS24090为TetR家族调控因子
根据S. rimosus M527基因组序列，RS24090基因编码一个推定的TetR家族调控因子（TFR），由194个氨基酸组成，分子量约为23.4 kDa。使用BLASTp分析RS24090蛋白的氨基酸序列，鉴定并下载了链霉菌中与RS24090同源性为68.07%至94.85%的同源序列。如图1所示，RS24090的同源物在链霉菌属中广泛保守和分布。基于I-TASSER服务器预测的蛋白质模型（图S2），使用C-score（置信度得分）、TM-score（模板建模得分）和RMSD（均方根偏差）等关键指标，确定了RS24090的最优模型（TM-score: 0.75 ± 0.10，RMSD: 4.7 ± 3.1 Å，C-score: 0.3），如图S3A所示。根据注释得分（TM-score = 0.820–0.934），排名前十的相关模型列于表S2，表明RS24090与TetR家族蛋白密切相关。此外，RS24090与模式菌株天蓝色链霉菌A3(2)中的TetR家族调控因子SCO4454的结构比对显示高度结构一致性（TM-score = 0.838），如图S3B所示。这些结果确认RS24090属于TetR家族调控因子。RS24090蛋白被命名为TetR24，其对应基因也被命名为TetR24。TetR24的核苷酸序列已提交至GenBank数据库，登录号为OQ605710。
【数据】氨基酸数：194；分子量：约23.4 kDa；同源性范围：68.07%–94.85%；TM-score：0.75 ± 0.10；RMSD：4.7 ± 3.1 Å；C-score：0.3；SCO4454比对TM-score：0.838；GenBank登录号：OQ605710
3.3 TetR24在rimocidin生物合成中发挥负调控作用
为阐明TetR24在rimocidin产生中的作用，使用CRISPR/Cas9技术失活了TetR24基因（图S4A）。构建了TetR24敲除载体pSGUD，通过接合转移转入S. rimosus M527，获得突变菌株M527-ΔTetR24。通过PCR确认TetR24的敲除（图S4B）。如图S4C所示，从野生型菌株M527中扩增出0.6 kb的TetR24基因片段，但未从M527-ΔTetR24中扩增出该片段。此外，从野生型菌株M527中获得了1.6 kb（代表上游同源臂和部分TetR24片段）和1.7 kb（代表下游同源臂和部分TetR24片段）的扩增产物。使用突变菌株M527-ΔTetR24作为模板时未扩增出此类片段。这些结果确认了TetR24基因在突变体M527-ΔTetR24中成功敲除。
为验证tetR24的缺失是rimocidin产量提高的唯一原因，我们按照“材料与方法”部分所述方法构建了TetR24互补菌株M527-ΔTetR24::TetR24和TetR24过表达菌株M527-TetR24。这些菌株通过表型（图S5）和基因型（图S6）分析进行了验证。通过摇瓶发酵研究TetR24缺失、互补和过表达对rimocidin产生的影响。如图2所示，与野生型菌株（208.89 mg/L）相比，过表达菌株M527-TetR24的rimocidin产量降低了40.31%（124.69 mg/L），而突变菌株M527-ΔTetR24的rimocidin产量增加了38.08%（288.44 mg/L）。同时，互补菌株部分恢复了rimocidin产量至与野生型相当的水平，但未完全恢复。此外，TetR24的缺失或过表达对细胞生长或形态分化没有显著影响（图3）。
【数据】WT产量：208.89 mg/L；M527-TetR24产量：124.69 mg/L（降低40.31%）；M527-ΔTetR24产量：288.44 mg/L（提高38.08%）；敲除验证片段：0.6 kb（TetR24）、1.6 kb（上游同源臂+部分TetR24）、1.7 kb（下游同源臂+部分TetR24）
3.4 TetR24直接或间接抑制rimocidin生物合成基因簇中rim基因的转录水平
为进一步探究TetR24基因在rimocidin生物合成中的调控机制，通过qRT-PCR分析确定TetR24的缺失和过表达是否影响rim簇中rim基因（rimA、rimC、rimG、rimR1、rimR2）的转录水平。RT-qPCR结果显示，在TetR24过表达菌株M527-TetR24中，rim基因的转录水平降低。相反，在缺失菌株M527-ΔTetR24中，rimA和rimR2的转录水平显著上调，而互补菌株M527-ΔTetR24::TetR24中rim基因的转录水平与野生型菌株相比降低（图4）。这些发现表明TetR24作为负调控因子参与S. rimosus M527的rimocidin生物合成。
此外，进行EMSA以检测TetR24蛋白是否直接与rim基因的启动子区域相互作用。His6-TetR24蛋白在大肠杆菌中过表达并纯化（图5A）。如图5B所示，纯化的His6-TetR24蛋白特异性结合并延迟了含有rimR2和rimA启动子区域的DNA片段的迁移。加入过量未标记特异性探针后，条带移位被消除，表明TetR24与rimR2和rimA启动子区域的相互作用是特异性的。与His6-TetR24孵育时，rimC、rimG或rimR1的启动子区域未观察到移位条带。因此，EMSA结果证明了His6-TetR24与靶启动子区域（rimR2和rimA）的特异性结合。
为精确定位TetR24在rimR2（RimR2p）和rimA（RimAp）启动子区域中的结合位点，使用纯化的重组His-TetR24蛋白和FAM标记探针DNA片段进行DNase I足迹分析。电泳图显示了与TetR24蛋白孵育后经DNase I消化各测试启动子的保护模式（图6A）。与EMSA结果一致，DNase I足迹分析确认了TetR24的两个结合位点。TetR24在RimR2p中的保护区域为−92至−66 nt（−92TGCGTATCACCTCACGCAAGGAACTCC−66，回文序列加下划线）（图6B），而TetR24在RimAp中的保护区域为−111至−89 nt（−111AGGAGCTCGTGTCCGAACCCCGG−89，回文序列加下划线）（图6B）。这些结果还揭示了TetR24的共有识别序列为GGAnCTCn，这是通过对这两个结合位点的分析确定的（图6C）。总之，这些发现强烈表明TetR24蛋白通过结合rimR2和rimA的启动子区域负调控rim基因的表达，从而抑制rimocidin的生物合成。
【数据】TetR24结合位点1（RimR2p）：−92至−66 nt，序列TGCGTATCACCTCACGCAAGGAACTCC；TetR24结合位点2（RimAp）：−111至−89 nt，序列AGGAGCTCGTGTCCGAACCCCGG；共有识别序列：GGAnCTCn
讨论与解读
rimocidin因其对多种植物病原真菌具有广谱拮抗活性，已被认为是农业上控制植物病害的理想杀菌剂。然而，S. rimosus M527中rimocidin产量有限，这归因于复杂调控网络的存在。本研究的长期目标是从分子水平阐明rimocidin生物合成的调控机制，通过生物技术改造以提高其产量，满足工业化生产需求。本研究基于比较转录组学，鉴定出差异表达水平显著的RS24090基因。该基因位于S. rimosus M527染色体约6.29 Mb处，与rimocidin生物合成基因簇（登录号MK300953，nt 3,287,154至3,405,565，0.11 Mb）距离较近。系统发育树分析和蛋白结构比对显示，RS24090与多个物种中的TFRs具有高度同源性，特别是模式菌株天蓝色链霉菌A3(2)中的调控因子SCO4454。然而，SCO4454尚未被功能研究，提示这可能是一个潜在的新型调控因子。
编译者解读
本研究通过"转录组筛选—基因编辑验证—分子互作解析"的完整技术路线，系统阐明了TetR24对rimocidin生物合成的负调控机制。研究亮点在于将CRISPR/Cas9基因编辑与EMSA、DNase I足迹分析相结合，从表型到分子机制层层递进，证据链完整。从合成生物学应用角度看，敲除TetR24使rimocidin产量提升38.08%，为工业菌株改造提供了明确的遗传靶点。值得注意的是，TetR24的过表达并未完全抑制rim基因转录，暗示可能存在其他调控因子的协同作用。此外，该调控因子的结合位点GGAnCTCn的鉴定为未来通过启动子工程精细调控rimocidin产量奠定了基础。研究的局限性在于仅验证了TetR24对rimA和rimR2的直接结合，对其他rim基因的间接调控机制尚待深入探究。
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.138043