来源：Reusable target-site toolkit for large-fragment (56.2 kilobases) chromosomal integration to enhance erythromycin biosynthesis in Escherichia coli（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
红霉素是一种广谱抗生素，其异源生物合成在大肠杆菌中长期受限于质粒不稳定及前体供给不足。本研究开发了一套基于可复用靶位点的CRISPR-Cas9染色体整合策略，将23个红霉素生物合成基因（总计约56.2 kb）成功整合至大肠杆菌BAP1基因组，构建了无质粒依赖的红霉素A生产菌株sZG9。通过系统敲除竞争性代谢途径及改造磷酸葡萄糖变位酶和丙酰辅酶A合成酶的负调控位点，最终使红霉素A产量达到9.80 mg/L，较亲本菌株提高8.25倍。
研究背景
大肠杆菌作为研究最深入的微生物之一，具有易培养、生长快、遗传操作简便等优势，已成为合成生物学中异源合成天然产物的通用底盘细胞。红霉素作为临床重要的大环内酯类抗生素，是多酮化合物在大肠杆菌中成功异源生物合成的经典代表。其生物合成途径分为两个阶段：首先由一分子丙酰辅酶A与六分子(2S)-甲基丙二酰辅酶A经6-dEB合酶（DEBS）缩合形成聚酮中间体6-脱氧红霉内酯B（6-dEB），随后该核心结构经过两次羟基化、两次糖基化和一次甲基化生成抗菌活性最强的红霉素A。然而，质粒编码基因的不稳定性以及糖单元和丙酰辅酶A胞内供给不足，构成了大肠杆菌高效生产红霉素的主要瓶颈。
研究方法
2.1 菌株与质粒
大肠杆菌DH10B用于质粒构建，大肠杆菌BAP1作为红霉素A生物合成基因染色体整合的母体菌株。本研究所用其他菌株及质粒详见补充材料。
2.2 CRISPR/Cas9介导的大肠杆菌染色体编辑
本研究采用CRISPR/Cas9系统进行大肠杆菌染色体上的基因整合与敲除。
表达sgRNA的pTarget质粒构建：以pTargetF质粒为模板进行反向PCR，所得PCR产物直接转化至DH10B化学感受态细胞。转化子在含50 µg/mL奇霉素的固体LB琼脂平板上筛选，37°C过夜培养。随机挑取单菌落进行质粒提取和测序验证。
供体DNA制备：供体DNA通过重叠延伸PCR或质粒限制性酶切获得。基因组编辑时，将sgRNA表达质粒与供体DNA共同电转化至含有pEcCas的大肠杆菌电感受态细胞中。编辑事件通过PCR扩增及DNA测序验证。
表达框1–4的染色体整合步骤：
1. 以N20_araA1-NGG为靶位点，将130arm整合至BAP1染色体，获得sZG1。
2. 以N20_araA2-NGG（位于130arm中部）为靶位点，以pBP130/HpaI + PacI酶切片段为供体DNA，将表达框1整合至sZG1染色体，获得sZG2。
3. 以N20_thiQ-NGG为靶位点，将144arm整合至sZG2染色体，获得sZG3。
4. 以N20_H2-NGG（位于144arm中部）为靶位点，以pBP144/HpaI + PacI酶切片段为供体DNA，将表达框2整合至sZG3染色体，获得sZG4。
5. 以N20_lacY-NGG为靶位点，将230arm整合至sZG4染色体，获得sZG5。
6. 以N20_thiQ-NGG（位于230arm中部）为靶位点，以pZF230/XbaI + SpeI酶切片段为供体DNA，将表达框3整合至sZG5染色体，获得sZG6。
7. 以N20_malT-NGG为靶位点，将247Aarm整合至sZG6染色体，获得sZG7。
8. 以N20_thiQ-NGG（位于247Aarm 3′端）为靶位点，将247Barm整合至sZG7染色体，获得sZG8。
9. 以N20_H2-NGG（位于247Barm 3′端）为靶位点，将247Carm整合至sZG8染色体，获得sZG9。247Aarm、247Barm和247Carm共同构成表达框4。
电感受态大肠杆菌制备：挑取含pEcCas的大肠杆菌单菌落，接种于2 mL含50 µg/mL卡那霉素的LB培养基中，37°C、220 rpm振荡过夜培养。随后取300 µL过夜培养物转接至30 mL含10 mM L-阿拉伯糖和50 µg/mL卡那霉素的LB培养基中，相同条件下培养至OD600达到0.5–0.7。收集菌液于50 mL离心管中，用冰冷的双蒸水在4°C、6000 rpm条件下洗涤三次，每次5 min。细胞沉淀重悬于300 µL冰冷的10%甘油（以双蒸水配制）中，分装至预冷的1.5 mL微量离心管中，每管100 µL，立即使用或保存于−80°C备用。
电转化程序：取1 µL pTarget系列质粒和1 µL供体DNA加入电感受态细胞中轻轻混匀。混合液转移至预冷的1 mm电转杯中，擦干外壁残留液体。使用Eppendorf Electroporator 2510电转仪，1800 V电击约5 ms。电击后立即加入1 mL室温LB培养基，37°C、220 rpm振荡培养2 h。菌液8000 rpm离心1 min，弃上清，菌体涂布于含50 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL奇霉素的固体LB琼脂平板，37°C过夜培养。
阳性克隆筛选：单菌落划线于含50 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL奇霉素的LB琼脂平板，37°C培养。进行菌落PCR，阳性克隆的扩增产物经DNA测序验证。
pTarget系列质粒消除：同时含有pEcCas和pTarget质粒的大肠杆菌菌株接种于2 mL含50 µg/mL卡那霉素和10 mM鼠李糖的LB培养基中，28°C、220 rpm振荡过夜培养。培养物用接种环划线于含50 µg/mL卡那霉素的LB琼脂平板，37°C过夜培养。挑取单菌落，用无菌牙签分别点接于含50 µg/mL卡那霉素的LB琼脂和含50 µg/mL奇霉素的LB琼脂。仅在LB-卡那霉素平板生长而在LB-奇霉素平板不生长的菌落被鉴定为已丢失pTarget质粒。
pEcCas质粒消除：携带pEcCas质粒的大肠杆菌菌株接种于2 mL含5 g/L葡萄糖的LB培养基中，37°C、220 rpm振荡过夜培养。培养物用接种环划线于含5 g/L葡萄糖和10 g/L蔗糖的LB琼脂平板，37°C过夜培养。挑取单菌落，用无菌牙签分别点接于LB琼脂和含50 µg/mL卡那霉素的LB琼脂。在LB平板生长而在LB-卡那霉素平板不生长的菌落被鉴定为已成功丢失pEcCas质粒。
2.3 发酵培养基与条件
发酵培养基组成为：10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、15 g/L甘油、100 mM HEPES。用10 M NaOH（约5 mL）调pH至7.6，121°C高压灭菌20 min。发酵时，将−80°C保存的大肠杆菌甘油菌用接种环划线于LB琼脂平板，37°C过夜培养。用无菌牙签挑取单菌落接种于2 mL LB培养基，37°C、220 rpm振荡培养约12 h。随后取100 µL种子培养物接种于10 mL含5 mM丙酸钠和0.5 mM IPTG的发酵培养基中，22°C、220 rpm振荡培养7天。
2.4 HPLC和LC-MS/MS分析方法
样品制备：取1 mL发酵液，12,000 rpm离心1 min，上清转移至2 mL微量离心管中。加入800 µL乙酸乙酯，涡旋混匀1 min，12,000 rpm离心1 min。上层乙酸乙酯相转移至新管中并蒸发至干；该萃取步骤重复三次。干燥残渣用100 µL甲醇复溶，涡旋1 min，12,000 rpm离心5 min。上清液随后通过HPLC和LC-MS/MS进行化合物检测。
HPLC分析方法：所有样品在配备Agilent 5 HC-C18(2)色谱柱（4.6 × 250 mm，5 µm粒径）和蒸发光散射检测器（ELSD；Alltech 3300）的Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000 HPLC系统上分析。HPLC梯度程序如下：0 min，71%溶剂B（原文此处截断，后续梯度条件原文未完整呈现）。
【数据】培养基成分：10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、15 g/L甘油、100 mM HEPES；pH：7.6；灭菌：121°C、20 min；诱导剂：5 mM丙酸钠、0.5 mM IPTG；发酵温度：22°C；转速：220 rpm；时间：7天；电转化电压：1800 V；电击时间：约5 ms；抗生素浓度：卡那霉素50 µg/mL、奇霉素50 µg/mL
研究结果
3.1 可复用靶位点工具包介导的染色体整合实现红霉素A合成
大肠杆菌中红霉素A的生物合成共需25个基因。本研究除prpE和sfp两个基因已存在于大肠杆菌BAP1基因组外，其余23个基因——原位于六个质粒（pBP130、pBP144、pZF230、pZF247A、pZF247B和pZF247C）上——被整合至大肠杆菌BAP1染色体。为实现这些基因表达框（20.6 kb、14.4 kb、11.7 kb、3.6 kb、2.8 kb和3.1 kb）从质粒到染色体的精确高效转移，本研究开发了基于CRISPR-Cas9的染色体整合策略，利用可复用靶位点工具包完成整合。
对于质粒携带的大DNA片段（>10 kb），采用基于可复用靶位点的两步染色体整合策略。第一步，将靶片段两端的约1 kb序列作为同源臂整合至染色体，为后续整合做准备。在此之前，通过重叠PCR将Cas9靶位点（N20-NGG，即20 nt前间隔序列和前间隔序列邻近基序）插入序列中部，作为下一步的切割位点。第二步，用两种限制性内切酶从质粒上切下含有目标基因表达框的大DNA片段，作为供体DNA整合至先前引入的靶位点。
对于分布在多个质粒上、需要在染色体内无缝组装成单个大表达框的小DNA片段（<5 kb），采用迭代染色体整合策略，重复利用一组靶位点（最少两个）。第一步，将含有表达框启动子的片段整合至染色体，并在其3′末端引入Cas9靶位点（N20-NGG）以便后续整合。第二步，在上一轮引入的靶位点处整合另一个小DNA片段，然后在其末端插入另一个Cas9靶位点（N20-NGG）用于下一轮整合。该迭代过程重复进行，直至所有小DNA片段均在染色体内组装完成且不引入额外序列。
通过上述策略，红霉素A生物合成所需的其余23个基因表达框被精确整合至大肠杆菌BAP1染色体，获得重组菌株大肠杆菌sZG9。摇瓶发酵sZG9，红霉素A产量为1.06 mg/L，比生产率为0.09 mg/L/OD600，略高于基于质粒的大肠杆菌BAP1红霉素A产量。在sZG9发酵液中，6-dEB几乎检测不到，而EB和MEB显著积累。在红霉素A、B、C、D四种组分中，红霉素A丰度最高，其次为B，D和C含量较低。由此获得了首个能够无质粒生产红霉素A的大肠杆菌菌株sZG9。
【数据】整合基因数：23个；整合片段大小：20.6 kb、14.4 kb、11.7 kb、3.6 kb、2.8 kb、3.1 kb；红霉素A产量：1.06 mg/L；比生产率：0.09 mg/L/OD600
3.2 系统性敲除消耗糖单元的支路途径增强红霉素A生产
EB和MEB的显著积累表明，sZG9菌株红霉素生物合成的主要瓶颈是糖基化能力有限。已有研究表明，消除竞争糖单元的支路途径可增加其可用性，从而提高红霉素产量。基于上述发现，从sZG9中依次敲除zwf、yihX、gcd、galU、wecED、vioAB和rfbC基因，获得sZG11（sZG9Δzwf）、sZG85（sZG11ΔyihXΔgcdΔgalU）和sZG98（sZG85ΔwecEDΔvioABΔrfbC）。
sZG11菌株红霉素A产量为1.51 mg/L，比生产率为0.13 mg/L/OD600，较sZG9分别提高42.45%和44.44%。sZG85的红霉素A产量和比生产率较sZG11略有下降，分别为1.38 mg/L和0.12 mg/L/OD600。sZG98达到2.27 mg/L红霉素A和0.19 mg/L/OD600比生产率，较sZG85分别提高64.49%和58.33%。sZG11（OD600 = 11.73）、sZG85（OD600 = 11.51）和sZG98（OD600 = 12.03）的生物量水平与sZG9（OD600 = 11.45）相当，表明细胞生长无显著差异。上述数据表明，阻断糖单元生物合成途径中的支路途径可显著提高红霉素产量。因此，选择sZG98进行后续优化。
【数据】sZG11产量：1.51 mg/L（较sZG9提高42.45%）；比生产率：0.13 mg/L/OD600（提高44.44%）；sZG85产量：1.38 mg/L；比生产率：0.12 mg/L/OD600；sZG98产量：2.27 mg/L（较sZG85提高64.49%）；比生产率：0.19 mg/L/OD600（提高58.33%）；OD600：sZG9为11.45、sZG11为11.73、sZG85为11.51、sZG98为12.03
3.3 磷酸葡萄糖变位酶负调控位点突变增强红霉素A生产
磷酸葡萄糖变位酶（PGM）是红霉素生物合成所需糖单元生物合成途径中的关键酶。在集胞藻中，PGM1丝氨酸47的磷酸化负调控其催化活性，含有该残基的结构域在不同物种中高度保守。序列比对分析显示，大肠杆菌PGM含有类似的保守结构域，对应丝氨酸位于第45位。研究推测将丝氨酸45替换以消除其磷酸化潜力将有利于红霉素A生产。利用可复用靶位点，对PGM第45位实施了饱和突变。
突变菌株sZG105（PGM Ser45Ala）、sZG107（PGM Ser45Asn）、sZG109（PGM Ser45Cys）和sZG112（PGM Ser45Gly）与sZG98相比红霉素A生物合成增强，而其他突变菌株产量显著降低。其中sZG107获得最高红霉素A产量和比生产率，分别达到5.53 mg/L和0.69 mg/L/OD600，较sZG98分别提高143.61%和263.16%。但sZG107的生长（OD600 = 7.98）受到明显损害。上述结果表明，解除糖单元生物合成途径中关键酶PGM的负调控可显著提高红霉素产量。据此，选择sZG107进行后续优化。
【数据】sZG107产量：5.53 mg/L（较sZG98提高143.61%）；比生产率：0.69 mg/L/OD600（提高263.16%）；OD600：7.98
3.4 丙酰辅酶A合成酶负调控位点突变增强红霉素生产
丙酰辅酶A合成酶（PrpE）催化丙酸摄取后的第一个胞内反应，其活性直接影响6-dEB合成前体丙酰辅酶A的胞内库容。体内研究表明，在肠道沙门氏菌中，PrpE的赖氨酸592可被Pat酶介导乙酰化或丙酰化，其中丙酰化导致PrpE活性降低约70%。值得注意的是，第592位赖氨酸在肠道沙门氏菌和大肠杆菌中保守。基于该保守性，研究推测消除赖氨酸592的丙酰化可能增强红霉素A生物合成。为此，对PrpE的赖氨酸592进行了饱和突变。
工程突变菌株大肠杆菌sZG135（PrpE K592N）的红霉素A产量为9.80 mg/L，比生产率为0.78 mg/L/OD600，较sZG107分别提高77.22%和13.04%，较亲本菌株sZG9提高8.25倍。
【数据】sZG135产量：9.80 mg/L；比生产率：0.78 mg/L/OD600；较sZG107提高77.22%（产量）和13.04%（比生产率）；较sZG9提高8.25倍
讨论与解读
红霉素前体6-dEB在大肠杆菌中成功合成已有二十余年，其产量在最初验证后不久即超过1 g/L。然而，基于质粒的大肠杆菌异源表达红霉素生物合成一直处于低产水平，最高报道红霉素A产量仅为3 L生物反应器中的4 mg/L。此外，质粒稳定性始终是一个持续性挑战。本研究为克服红霉素生物合成中的质粒稳定性限制，开发了基于可复用靶位点的DNA整合策略。含23个红霉素生物合成基因的四个表达框（总长约56.2 kb）成功整合至大肠杆菌BAP1染色体，构建了首个无需质粒即可生产红霉素A的大肠杆菌菌株sZG9。可复用靶位点来源于已敲除的内源大肠杆菌序列、其他物种或合成序列。针对大片段（>10 kb）和小片段（<5 kb）分别采用两步法和迭代法整合策略。
编译者解读：本研究的技术亮点在于可复用靶位点工具包的巧妙设计——通过在同源臂中部预设Cas9切割位点，实现了多轮大片段整合而无需额外筛选标记，为复杂多基因途径的染色体整合提供了通用方案。从合成生物学应用角度看，将红霉素A产量从1.06 mg/L提升至9.80 mg/L的策略组合（敲除竞争途径+解除负调控位点）展示了"消除代谢瓶颈"的系统思维。不过，sZG107生长受损提示负调控解除可能带来代谢负担，未来需在生长与产量之间寻求平衡。该底盘菌株为后续红霉素A生物合成的代谢工程优化奠定了坚实基础。
参考来源
Feng, Z. (2026). Reusable target-site toolkit for large-fragment (56.2 kilobases) chromosomal integration to enhance erythromycin biosynthesis in Escherichia coli. Bioresource Technology. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133917
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133917