来源：One-pot synthesis of β-alanine from 1,3-diaminopropane using two-enzyme cascade in cell-free biotransformation（Journal of Bioscience and Bioengineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
β-丙氨酸是合成泛酸、肌肽等生物活性分子的重要前体，工业需求持续增长。本研究构建了一条全新的无细胞双酶级联催化路径，以1,3-二氨基丙烷（DAP）为底物，通过二胺氧化酶（DAO）与3-氨基丙醛脱氢酶（APALDH）两步氧化反应一锅合成β-丙氨酸，并引入过氧化氢酶与NADH氧化酶分别清除副产物H₂O₂和再生辅因子NAD⁺。研究从真核来源DAO验证概念出发，进一步从节杆菌属（Arthrobacter pascens）中筛选到更高比活力的原核DAO，并通过补料分批策略将转化率提升约7.5倍，为β-丙氨酸的生物合成提供了新思路。
研究背景
β-丙氨酸作为唯一β型氨基酸，广泛应用于医药、食品和化工领域。传统化学合成法存在条件苛刻、污染严重等问题，生物催化法因其温和高效受到关注。然而，从廉价底物出发、通过简洁酶级联高效合成β-丙氨酸的路径仍属空白。1,3-二氨基丙烷（DAP）作为一种3碳二胺，理论上可通过两步氧化生成β-丙氨酸，但关键在于：目前尚未有原核来源的DAO对DAP具有特异性。本研究旨在筛选高效酶元件、优化反应条件，建立一条可行的无细胞双酶级联一锅合成路径。
研究方法
材料与试剂
DAP购自东京化学实验室（Tokyo, Japan）。腐胺二盐酸盐、β-丙氨酸、过氧化氢酶、3-APAL二乙基缩醛及猪肾来源DAO（DAOpk）购自Sigma Aldrich（St. Louis, MO, USA）。β-NAD、β-NADH、培养基及缓冲液组分购自HiMedia Laboratories（Thane, India）。高效液相色谱（HPLC）级化学品购自Merck（Mumbai, India）。其他化学品购自Sisco Research Laboratories（Mumbai, India）。3-APAL通过将3-APAL二乙基缩醛在1.5 N HCl中、60 °C水解10 min合成，水解样品调节pH至7.0后使用。
菌株与质粒构建
本研究所用菌株与质粒列于表S1。E. coli DH5α作为克隆宿主，E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RP作为重组蛋白表达宿主。天然Arthrobacter pascens菌株作为DAOAp酶表达宿主。携带T7启动子的pETDuet-1载体用于APALDH和NOX表达。编码APALDH和NOX的基因由GenScript（Piscataway, NJ, USA）人工合成。
DAOAp酶在野生型A. pascens中的表达
天然A. pascens细胞从冷冻甘油储备液中接种至3 mL营养肉汤（NB），于30 °C、180 rpm过夜培养。取1%过夜培养物（预接种物）接种至150 mL新鲜NB培养基，于30 °C、180 rpm培养30 h。随后将培养物与等体积含0.15%（w/v）腐胺二盐酸盐（4C胺）或DAP（3C胺）作为诱导剂的20 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）混合。与不含诱导剂的等体积缓冲液混合的培养物作为对照。培养物于30 °C、180 rpm孵育24 h。细胞经8000 rpm、4 °C离心10 min收集，沉淀保存于−80 °C深冻冰箱。
APALDH和NOX酶在重组E. coli中的表达
携带pETDuet-1-APALDH和pETDuet-1-NOX质粒的重组E. coli细胞分别接种于3 mL葡萄糖-酵母提取物培养基，于37 °C、180 rpm过夜培养。将1%预接种物接种至300 mL葡萄糖-酵母提取物培养基。当600 nm光密度（OD600）达到0.6–0.8时，细胞在47 °C热激25 min，随后加入0.5 M山梨醇。接着用0.5 mM异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，诱导后于20 °C孵育16 h。细胞沉淀经8000 rpm、4 °C离心10 min收集，保存于−80 °C深冻冰箱。
细胞裂解与酶分离
DAOAp和NOX细胞沉淀悬浮于100 mM Tris–HCl（pH 9.0），APALDH细胞沉淀悬浮于100 mM sodium bicine。细胞用超声破碎仪裂解，10 s脉冲、30 s间歇，40%振幅，共20 min。超声液经12,000 rpm、4 °C离心10 min。上清液用SDS-PAGE分析酶的可溶表达。电泳使用15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，ImageJ软件用于比较细胞裂解液中的可溶蛋白表达。
酶活测定
DAOAp酶活采用与APALDH偶联的间接测定法。APALDH每分钟生成的NADH量对应DAO酶产生的3-APAL量。标准测定混合液含100 mM Tris–HCl缓冲液（pH 9.0）、5 mM DAP、50 μl APALDH粗裂解液（1.0 U）、15 mM NAD⁺及50 μl稀释的DAOAp酶。反应动力学记录10 min，每分钟生成的NADH在340 nm定量。1单位（U）DAO定义为每分钟产生1 μmol 3-APAL的酶量。由于本研究鉴定了DAOAp酶，还考察了温度（4–70 °C）和pH（pH 3–11）对DAOAp活性的影响。DAOpk酶活测定方法与DAOAp类似，但使用100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）和100 mM DAP。1单位DAOpk定义为每小时产生1 μmol 3-APAL的酶量。APALDH活性按Tanaka等描述的辅因子法测定，1单位APALDH定义为每分钟产生1 μmol NADH的酶量，分别在100 mM sodium bicine缓冲液（pH 9.0）和100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中独立测定。NADH氧化酶活性按de Felipe和Hugenholtz所述方法测定，测定混合液含100 mM Tris–HCl缓冲液（pH 9.0）、0.3 mM NADH和50 μl稀释的NOX酶裂解液，1单位NADH氧化酶定义为每分钟产生1 μmol NAD⁺的酶量。与APALDH类似，NOX活性也在100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中定量。过氧化氢酶活性按Hadwan方法测定，测定混合液含100 mM Tris–HCl缓冲液（pH 9.0）、10 mM H₂O₂和50 μl稀释的商业过氧化氢酶。1单位过氧化氢酶定义为每分钟分解1 μmol H₂O₂的酶量。总蛋白含量用Bradford法测定，酶比活力定义为每毫克总蛋白的酶单位数（U/mg）。
【数据】诱导剂浓度：0.15%（w/v）；培养温度：30 °C；转速：180 rpm；诱导时间：24h；热激条件：47 °C、25 min；IPTG浓度：0.5 mM；诱导后温度：20 °C、16 h；超声条件：10s脉冲/30s间歇、40%振幅、20 min；DAO底物浓度：5 mM DAP；NAD⁺浓度：15 mM；NOX测定NADH浓度：0.3 mM；过氧化氢酶测定H₂O₂浓度：10 mM
使用DAOpk、APALDH、NOX和过氧化氢酶将DAP批量酶促生物转化为β-丙氨酸
为建立从DAP一锅合成β-丙氨酸的概念验证，在1.5 mL小瓶中进行100 mM DAP的批式转化，反应体积1 mL，包含DAOpk（0.12 U；2.4 mg）、APALDH（1.32 U；0.3 mg）、NOX（2.5 U；0.1 mg）和过氧化氢酶（100 U；0.05 mg），溶于100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）并含2 mM NAD⁺。反应通过加入底物DAP启动，转化混合物在37 °C、120 rpm孵育42 h。定期取样，样品在70 °C热灭活以终止反应。样品经13,000 rpm、37 °C离心10 min，上清液用HPLC分析β-丙氨酸产量。
【数据】底物浓度：100 mM DAP；反应体积：1 mL；酶量：DAOpk 0.12 U、APALDH 1.32 U、NOX 2.5 U、过氧化氢酶100 U；NAD⁺：2 mM；温度：37 °C；转速：120 rpm；时间：42 h；灭活温度：70 °C；离心：13,000 rpm、10 min
扰动分析
为鉴定转化过程中的限速酶，在100 mM Tris–HCl缓冲液（pH 9.0）中进行5 mM DAP的批式酶促转化，通过单独扰动DAOAp、APALDH、NOX和过氧化氢酶浓度（以不同比例组合），并添加2 mM NAD⁺。每次转化5 h后的β-丙氨酸产量用HPLC定量。分析酶浓度变化对β-丙氨酸产量的影响，考察每种酶对β-丙氨酸生产的作用。
【数据】底物浓度：5 mM DAP；缓冲液：100 mM Tris–HCl（pH 9.0）；NAD⁺：2 mM；反应时间：5 h
酶抑制研究
DAOAp、APALDH、NOX和过氧化氢酶对途径代谢物（包括底物DAP、产物β-丙氨酸、中间体3-APAL及副产物H₂O₂和NH₄Cl）的抑制研究分别在各自的酶活测定体系中进行。酶活测定时加入不同浓度的途径代谢物，分别考察每种酶受各代谢物的影响。抑制剂浓度范围为2至1200 mM。
【数据】抑制剂浓度范围：2–1200 mM
使用DAOAp、APALDH、NOX和过氧化氢酶将DAP批量酶促生物转化为β-丙氨酸
在50 mL三颈圆底烧瓶中进行5 mM DAP的批式转化，反应体积15 mL，包含DAOAp（0.3 U；7.5 mg）、APALDH（3.0 U；0.7 mg）、NOX（9.0 U；0.4 mg）和过氧化氢酶（200 U；0.1 mg），溶于100 mM Tris–HCl缓冲液（pH 9.0），并添加2 mM NAD⁺。反应
【数据】底物浓度：5 mM DAP；反应体积：15 mL；酶量：DAOAp 0.3 U、APALDH 3.0 U、NOX 9.0 U、过氧化氢酶200 U；缓冲液：100 mM Tris–HCl（pH 9.0）；NAD⁺：2 mM
研究结果
本研究涵盖了提高所设计途径中β-丙氨酸生产率的关键要素，包括筛选对底物具有特异性且在合适pH、温度和缓冲液中具有活性的高效酶；在重组E. coli中实现酶的高可溶表达；优化酶浓度及其比例；研究每种酶在不同底物、产物和副产物浓度下的抑制模式。
筛选用于开发β-丙氨酸生产双酶级联的酶
招募高效酶是开发酶促生物转化过程的首要条件。研究筛选了具有高效动力学特性的酶，如高底物特异性、高比活力、不产生有害副产物且易于获取。对3C底物DAP具有特异性的DAO仅在真核来源中有报道。原核DAO据报道具有从4C到10C二胺的宽底物特异性，但不作用于3C二胺。相反，报道指出存在转氨酶在胺受体存在下催化3C二胺的胺基转移。因此，为建立初步概念验证，选择了商业可得的猪肾来源真核DAOpk，并在实验室内验证其具有3C DAP特异性。DAOpk的比活力非常低，约为0.002 U/mg；因此有必要筛选更高效的DAO，优选原核来源以便操作。本研究发现了一种来自A. pascens的对3C二胺DAP具有特异性的DAO（DAOAp），并通过实验证明该酶是氧化酶而非转氨酶，因为它在无胺受体条件下催化3C DAP的氧化脱氨。商业牛肝来源过氧化氢酶因其高Kcat/Km值（1.4 × 10⁶）被选中。APALDH酶从文献中鉴定，该酶从DAP培养的节杆菌属细胞中纯化，对3-APAL具有特异性，Km低至3 μM。NOX酶从文献中鉴定，分离自有氧培养的乳酸乳球菌细胞，产生安全副产物水。所筛选酶的详细信息及其动力学数据列于表1。
【数据】DAOpk比活力：0.002 U/mg；过氧化氢酶Kcat/Km：1.4 × 10⁶；APALDH的Km：3 μM
DAOAp、APALDH和NOX酶的蛋白表达与比活力测定
天然A. pascens（DAOAp）的蛋白表达谱（包括0.15%腐胺诱导和对照（无诱导剂）裂解液）通过SDS-PAGE分析比较（图S1A）。总体而言，0.15%腐胺诱导培养物的蛋白表达高于对照。尽管0.15%腐胺诱导培养物中某些蛋白表达水平升高，但无法确认DAO的存在。对商业DAOpk和DAOAp（包括对照、0.15%腐胺诱导和0.15% DAP诱导培养物）的酶活进行了定量。商业DAOpk虽为纯化形式，但比活力极低，约为0.002 U/mg。0.15%腐胺诱导的DAOAp培养物对DAP的比活力高于对照和0.15% DAP诱导培养物，其比活力为0.04 U/mg，从而确认了存在对3C底物DAP特异的DAO。因此，0.15%腐胺诱导的DAOAp培养物裂解液可作为DAO酶来源。0.15% DAP诱导的DAOAp培养物活性低于对照培养物。此外，当DAP用作诱导剂时，对细菌生长有害，本研究不采用此法。重组APALDH和NOX培养物裂解液用SDS-PAGE分析可溶蛋白表达。ImageJ分析估计APALDH和NOX的可溶部分分别为66%和55%。此外，APALDH和NOX酶在总可溶蛋白部分中的浓度分别约为68 mg/L和49 mg/L培养物。通过组合策略——包括热激、渗透剂添加和诱导后低温（20 °C）孵育——实现了重组蛋白在E. coli中可溶表达的提高。过表达的APALDH和NOX酶比活力分别为4.57和26 U/mg。APALDH和NOX的催化效率（Kcat/Km）分别计算为60.3 × 10² s⁻¹ mM⁻¹和72.2 × 10² s⁻¹ mM⁻¹。APALDH和NOX酶的粗裂解液比其纯化形式更稳定。商业过氧化氢酶活性预测定为2000 U/mg。本研究使用的所有酶比活力汇总于表S2。APALDH、NOX和过氧化氢酶活性在pH 7.0和9.0下分别针对DAOpk和DAOAp进行定量，两种pH下酶活性几乎相等。所有酶活测定均在转化温度37 °C下进行。
【数据】DAOAp比活力：0.04 U/mg；APALDH可溶部分：66%；NOX可溶部分：55%；APALDH浓度：68 mg/L；NOX浓度：49 mg/L；APALDH比活力：4.57 U/mg；NOX比活力：26 U/mg；APALDH Kcat/Km：60.3 × 10² s⁻¹ mM⁻¹；NOX Kcat/Km：72.2 × 10² s⁻¹ mM⁻¹；过氧化氢酶活性：2000 U/mg
使用DAOpk、APALDH、NOX和过氧化氢酶建立从DAP生产β-丙氨酸的概念验证
为证明通过所开发的双酶级联合成β-丙氨酸，使用DAOpk、APALDH、NOX和过氧化氢酶进行了100 mM DAP的批式转化。该转化在41 h内产生12.2 mM（1.1 g/L）β-丙氨酸（图2）。约12.2%的转化率，产物形成速率为0.3 mM/h。因此，β-丙氨酸通过所设计的双酶级联一锅合成成功生产。然而，生产速率低于预期的7.2 mM/h（基于DAOpk活性）。这可能归因于转化系统中代谢物对酶的抑制。此外，由于DAOpk比活力较低（0.002 U/mg），为提高反应速率，后续生物转化研究将使用比活力更高的DAOAp（0.04 U/mg）。转化样品还送LC-MS分析，β-丙氨酸的产生得到定性确认。
【数据】底物浓度：100 mM DAP；β-丙氨酸产量：12.2 mM（1.1 g/L）；时间：41 h；转化率：12.2%；产物形成速率：0.3 mM/h；预期速率：7.2 mM/h
温度和pH对DAOAp酶活的影响
由于DAOAp酶为本研究新鉴定，无既有文献报道，故考察了温度和pH对其活性的影响。温度效应在标准测定条件下研究，酶在不同温度（4–70 °C）下孵育1 h。类似地，pH效应在标准测定条件下使用pH 3至11的各种缓冲液考察。DAOAp的最适温度和pH分别为37 °C和9.0（图3）。
【数据】温度范围：4–70 °C；pH范围：3–11；最适温度：37 °C；最适pH：9.0
扰动分析
基于扰动分析优化了生物转化的酶浓度和比例。每次扰动转化中改变的酶浓度列于表S3。酶单位以U/mL表示。分析每次扰动中酶浓度变化及其对β-丙氨酸生产率的影响。β-丙氨酸生产率在扰动P2中最高（DAOAp增加），其次是扰动P4（NOX增加）。由于DAOAp的增加对β-丙氨酸生产率影响最显著，确定DAOAp是β-丙氨酸生产的限速酶。基于上述扰动研究，还确定了DAP到β-丙氨酸酶促生物转化的酶比例。DAOAp:APALDH比例固定为1:10，因为进一步增加至1:100并未改善β-丙氨酸产量。APALDH比例设定高于DAOAp，以防止中间体积累。
【数据】DAOAp:APALDH比例：1:10（1:100未改善产量）
讨论与解读
本研究开发了从DAP一锅合成β-丙氨酸的双酶级联无细胞生物转化工艺，并证明了其可行性。研究讨论了影响生产率的关键因素，包括途径热力学、高效酶利用、酶浓度与比例的优化以防止中间体积累，以及实现高生产率所面临的调控挑战。该途径设计具有较高的总体热力学可行性（ΔG = −706.6 ± 41.7 kJ/mol），可实现近乎完全的转化。为使工艺更具成本效益，关键原料DAP可通过廉价的1,3-二氯丙烷经氨解反应合成。由于无副产物形成，配合更廉价的产品纯化技术，该工艺将比现有β-丙氨酸生产策略更高效。对3C二胺DAP特异的DAO仅在真核生物中发现，因此路径最初以真核DAOpk、过氧化氢酶及原核APALDH和NOX构建，并成功建立了概念验证。进一步工作中，本研究鉴定到比活力更高的DAOAp以提高反应速率并缩短转化时间。DAO:APALDH:NOX:过氧化氢酶的酶比例优化为1:10:30:667。
编译者解读
本研究最值得称道之处在于从原核生物中发掘了首个对3C二胺DAP特异的DAO酶，打破了"原核DAO不作用于3C底物"的既有认知，为二胺类底物的酶催化转化提供了新酶元件。无细胞体系虽增加了酶成本，但规避了细胞膜传质障碍和代谢干扰，配合补料分批策略将转化率提升7.5倍，展示了过程工程在酶级联中的关键作用。局限在于DAOAp比活力仍偏低（0.04 U/mg），酶用量较大；未来若通过定向进化或酶工程提升其催化效率，该路径的工业应用潜力将进一步释放。
参考来源
Shanmugasundaram S. One-pot synthesis of β-alanine from 1,3-diaminopropane using two-enzyme cascade in cell-free biotransformation. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2026. DOI: 10.1016/j.jbiosc.2025.10.013
DOI: 10.1016/j.jbiosc.2025.10.013