来源：Cell-free synthesis of high-order carbohydrates from low-carbon molecules（Science Bulletin）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
将CO₂人工转化为食物与化学品是应对人口增长与环境危机的潜在路径，但长链、结构多样的碳水化合物的体外合成长期受限。本研究报道了一条热力学有利的体外蔗糖合成途径，从C1和C3分子出发，仅需10步酶促反应和2个ATP即可合成一分子蔗糖。通过对蔗糖合酶和磷酸酶进行蛋白质工程改造（催化效率提升3至71倍），并结合迭代扫描策略优化反应体系，实现了86%的高转化率和5.7 g L⁻¹ h⁻¹的比合成速率。研究还展示了无需糊精引物的无细胞淀粉合成，并将甲醇转化为多种糖类，尤其是聚合度≥18的纤维寡糖。
研究背景
CO₂过量排放已导致全球地表温度上升至少1.1℃，引发严重的生态系统退化和极端天气事件。与此同时，本世纪末全球人口预计增长至100亿，食物需求将翻倍，但有限耕地和当前农业生产力难以满足这一需求。将CO₂人工转化为食物和化学品，是同时应对环境与人口挑战并助力碳中和的有前景策略。
碳水化合物——包括单糖、寡糖和多糖及其衍生物——是自然界中最丰富的物质，是人类主要能量来源，也是食品、药品、材料和化学品生产的原料。然而，目前碳水化合物生产仍高度依赖植物种植。开发不依赖生物资源的CO₂→碳水化合物转化途径，既有意义又具挑战性。
体外生物转化（ivBT）平台因其对反应条件的精确控制和可调性，已成为可持续生物制造的有力工具。与微生物发酵相比，ivBT具有反应体系可设计性强、产物分离简单等优势。本研究旨在设计并验证一条从C1和C3分子出发、热力学有利且步骤精简的体外蔗糖合成途径。
研究方法
2.1 酶工程改造
大豆蔗糖合酶（GmSUS）的工程改造。 首先在UniProt数据库中以“sucrose synthase”为关键词检索，获得5223条序列。其中1775条序列与GmSUS长度相近。对这些序列进行多重序列比对，选取115条与GmSUS一致性为50%–80%的序列进行进一步序列保守性分析。逐位点分析残基保守性，确定每个位点出现频率最高的氨基酸。若GmSUS某位点（如C563）的天然残基与高度保守的对应残基（如第563位为G）不同，则该位点被列为突变候选位点（如C563G）。共选择61个此类位点进行定点突变。
定点突变以pET21a-GmSUS质粒为模板进行PCR扩增。PCR产物经DpnI在37°C消化2小时，所得混合物转化至E. coli DH5α细胞进行质粒构建。确认正确的突变质粒随后转化至E. coli BL21(DE3)进行蛋白表达。
为评估所有突变体的蔗糖合成能力，反应体系（100 µL）包含50 mmol L⁻¹ HEPES缓冲液（pH 7.5）、5 mmol L⁻¹ MgCl₂、5 mmol L⁻¹ ADP-葡萄糖或UDP-葡萄糖、10 mmol L⁻¹果糖，以及5–20 µL粗酶液，在30°C下反应10分钟。蔗糖合成量高的单点突变体进一步纯化，以ADP-葡萄糖或UDP-葡萄糖为底物进行精确酶活测定。有利的单点突变体作为模板进行迭代突变。
果糖-6-磷酸（F6P）特异性磷酸酶的获得。 对来源于Thermotoga sp. 38H的磷酸酶的L149、S177、Y181和E183位点进行饱和突变，使用pEASY®-Uni无缝克隆与组装试剂盒（TransGen Biotech，北京）。所有突变体在E. coli BL21(DE3)中表达并纯化，测定其对含有F6P、葡萄糖-6-磷酸（G6P）和葡萄糖-1-磷酸（G1P）的混合底物的去磷酸化活性。每种底物终浓度为20 mmol L⁻¹。反应在40°C、120 r min⁻¹条件下进行4小时，加入10% H₂SO₄（0.5 µL）终止反应。样品经HPLC分析，定量生成的葡萄糖和果糖。以果糖浓度及其在总去磷酸化单糖中的比例（P F）评估酶活性和底物特异性。同时具有高果糖浓度和高P F值的突变体被认为是活性和F6P特异性均改善的候选株。
【数据】数据库序列数：5223条；同源序列数：1775条；保守性分析序列数：115条（50%–80%一致性）；突变位点数：61个；DpnI消化：37°C、2h；反应缓冲液：50 mmol L⁻¹ HEPES（pH 7.5）；MgCl₂：5 mmol L⁻¹；糖核苷酸底物：5 mmol L⁻¹；果糖：10 mmol L⁻¹；粗酶量：5–20 µL；反应条件：30°C、10min；F6PP饱和突变位点：L149、S177、Y181、E183；底物浓度：各20 mmol L⁻¹；反应条件：40°C、120 r min⁻¹、4h；终止液：10% H₂SO₄ 0.5 µL
2.2 不同ivBT系统的验证
（i）ivBT-果糖系统。 将二羟丙酮（DHA）转化为果糖的反应中，使用0.8 mg mL⁻¹二羟丙酮激酶（DhaK）、0.16 mg mL⁻¹磷酸丙糖异构酶（TPI）、0.2 mg mL⁻¹果糖-6-磷酸醛缩酶（FSA）、0.4 mg mL⁻¹多聚磷酸激酶（PPK）、0.4 mg mL⁻¹ F6PP3、200 mmol L⁻¹ DHA、5 mmol L⁻¹ Mg²⁺、50 mmol L⁻¹ HEPES缓冲液（pH 7.5）和2.2 mmol L⁻¹多聚磷酸盐。反应在pH 7.5、30°C条件下进行4小时。
（ii）ivBT-蔗糖系统。 将F6P转化为蔗糖的反应中，使用0.8 mg mL⁻¹ DhaK、0.16 mg mL⁻¹ TPI、0.2 mg mL⁻¹ FSA、0.1 mg mL⁻¹葡萄糖-6-磷酸异构酶（PGI）、0.1 mg mL⁻¹磷酸葡萄糖变位酶（PGM）、0.1 mg mL⁻¹葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶（GalU）或ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）、0.1 mg mL⁻¹焦磷酸酶（PPa）、0.2 mg mL⁻¹ GmSUS或GmSUS-M3、20 mmol L⁻¹ F6P、20 mmol L⁻¹果糖、5 mmol L⁻¹ Mg²⁺和50 mmol L⁻¹ HEPES缓冲液（pH 7.5）。将DHA转化为蔗糖时，对DhaK、TPI、FSA、PGI、PGM、GalU、GmSUS-M3、PPa、PPK和核苷二磷酸激酶（Ndk）的不同浓度进行优化，使用30 mmol L⁻¹ DHA、0.67 mmol L⁻¹多聚磷酸盐、5 mmol L⁻¹ Mg²⁺和50 mmol L⁻¹ HEPES缓冲液（pH 7.5）。反应在30°C下进行2小时。ivBT-Sucrose 1.0、ivBT-Sucrose 1.1、ivBT-Sucrose 1.2、ivBT-Sucrose 1.3和ivBT-Sucrose 2.0的详细酶用量汇总于在线补充表S2。
为降低FALD对酶的毒性，将FALD或甲醇转化为DHA的反应首先仅使用来源于Pseudomonas fluorescens的甲醛酶突变体（FLS-M3）在30°C下进行2–4小时。随后将其他用于DHA转化为蔗糖的酶加入反应体系中，在30°C下再反应2小时。
（iii）ivBT-淀粉系统。 为实现从蔗糖合成直链淀粉，首先测定了淀粉蔗糖酶（AS）在不同蔗糖浓度（5–100 mmol L⁻¹）下的合成能力，反应含50 mmol L⁻¹ HEPES缓冲液（pH 8.0）、5 mmol L⁻¹ Mg²⁺和0.1 mg mL⁻¹纯化的AkAS。反应在40°C、120 r min⁻¹下孵育1–3小时。用碘水溶液处理确认直链淀粉合成。ivBT-Starch的详细酶用量和反应条件汇总于在线补充表S3。ivBT-Starch 2.0的验证中，向ivBT-Starch 1.0体系中加入0.025–0.1 mg mL⁻¹ F6PP3以替代果糖的使用。
为测定直链淀粉结构，还进行了10 mL规模的ivBT-Starch 1.1反应。产物用95%乙醇沉淀并洗涤三次。直链淀粉浆经冷冻干燥获得直链淀粉粉末。最终获得120 mg直链淀粉用于NMR分析。纯化的直链淀粉（10 mg mL⁻¹）作为底物，使用0.1 mg mL⁻¹糖原分支酶（GBE）在50 mmol L⁻¹磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中反应2小时合成支链淀粉。
（iv）ivBT-COS系统。 为验证COS的合成，首先在以下条件下测试纤维二糖和纤维三糖的合成能力：0.3 mg mL⁻¹纤维二糖磷酸化酶（CBP）和纤维糊精磷酸化酶（CDP）、5 mmol L⁻¹ Mg²⁺、50 mmol L⁻¹ HEPES缓冲液（pH 8.0）、20 mmol L⁻¹ G1P和20 mmol L⁻¹葡萄糖。反应在pH 8.0、40°C下进行2小时。
为实现从甲醇合成COS，使用200 mmol L⁻¹甲醇、0.75 mg mL⁻¹醇氧化酶（AOX）、0.42 mg mL⁻¹过氧化氢酶（CAT）、0.5 mmol L⁻¹硫胺素焦磷酸（TPP）、5 mg mL⁻¹ FLS-M3、200 mmol L⁻¹ FALD、0.06 mg mL⁻¹ DhaK、0.08 mg mL⁻¹ TPI、0.15 mg mL⁻¹ FSA、0.03 mg mL⁻¹ PGI、0.1 mg mL⁻¹ PGM、0.11 mg mL⁻¹ PPK、0.13 mg mL⁻¹ G6PP3、0.67 mmol L⁻¹多聚磷酸盐、0.3 mg mL⁻¹ CBP和/或0.3 mg mL⁻¹ CDP、5 mmol L⁻¹ Mg²⁺、50 mmol L⁻¹ HEPES缓冲液（pH 8.0）。反应在40°C下进行4小时。
【数据】ivBT-果糖：DhaK 0.8 mg mL⁻¹、TPI 0.16 mg mL⁻¹、FSA 0.2 mg mL⁻¹、PPK 0.4 mg mL⁻¹、F6PP3 0.4 mg mL⁻¹、DHA 200 mmol L⁻¹、Mg²⁺ 5 mmol L⁻¹、多聚磷酸盐 2.2 mmol L⁻¹；30°C、4h、pH 7.5。ivBT-蔗糖：F6P 20 mmol L⁻¹、果糖 20 mmol L⁻¹、DHA 30 mmol L⁻¹、多聚磷酸盐 0.67 mmol L⁻¹；30°C、2h。FLS-M3预反应：30°C、2–4h。ivBT-淀粉：蔗糖 5–100 mmol L⁻¹、AkAS 0.1 mg mL⁻¹、40°C、120 r min⁻¹、1–3h、pH 8.0；F6PP3 0.025–0.1 mg mL⁻¹；10 mL反应产直链淀粉120 mg；GBE 0.1 mg mL⁻¹、pH 7.0、2h。ivBT-COS：CBP/CDP 0.3 mg mL⁻¹、G1P 20 mmol L⁻¹、葡萄糖 20 mmol L⁻¹、40°C、2h、pH 8.0；甲醇 200 mmol L⁻¹、AOX 0.75 mg mL⁻¹、CAT 0.42 mg mL⁻¹、TPP 0.5 mmol L⁻¹、FLS-M3 5 mg mL⁻¹、FALD 200 mmol L⁻¹、多聚磷酸盐 0.67 mmol L⁻¹；40°C、4h
2.3 数据分析
为比较不同F6PP突变体对F6P的特异性，引入参数P F。当G1P、G6P和F6P的混合物作为F6PP突变体的底物时，总去磷酸化产物包含葡萄糖和果糖。P F按果糖浓度与总单糖浓度之比计算：P F = 果糖浓度（mmol L⁻¹）/ 总单糖（葡萄糖+果糖）浓度（mmol L⁻¹）。
为定量测定F6PP3对底物F6P相对于G6P、G1P、磷酸二羟丙酮（DHAP）和甘油醛-3-磷酸（GALP）的特异性，计算参数S F6P/R：S F6P/G6P = F6PP3对底物F6P的酶活（U mg⁻¹）/ F6PP3对底物G6P的酶活（U mg⁻¹）。
ivBT-蔗糖的转换数计算如下：转换数 = 生成的蔗糖（nmol L⁻¹）/ 酶用量（mmol L⁻¹）。
基于蛋白量，ivBT-淀粉的C1转化合成效率计算如下：S = 合成的直链淀粉的碳纳摩尔数（mmol L⁻¹）/ [酶用量（mg）× 时间（min）]。
【数据】P F计算公式：果糖浓度/总单糖浓度；S F6P/G6P = F6PP3对F6P酶活/对G6P酶活（U mg⁻¹）；转换数 = 蔗糖（nmol L⁻¹）/酶用量（mmol L⁻¹）；合成效率S = 碳纳摩尔数（mmol L⁻¹）/[酶用量（mg）×时间（min）]
研究结果
3.1 体外蔗糖合成途径设计
蔗糖是广为人知的双糖，常见于深加工食品中，传统上从甘蔗和甜菜中提取。本研究旨在开发一种体外蔗糖合成系统（ivBT-Sucrose），以最小化ATP消耗并减少酶促反应步骤。
前期研究报道了一条从头F6P合成途径，仅需最少ATP（每1个F6P消耗1个ATP）和五步反应。在此基础之上，设计了三个延伸模块用于将F6P转化为蔗糖（图2a）。第一个模块C12Suc1由PGI和PGM组成，将F6P依次转化为G1P。随后GalU催化G1P和UTP转化为UDP-葡萄糖和焦磷酸（PPi）。接着，蔗糖磷酸合酶（SPS）将葡萄糖部分从UDP-葡萄糖转移至F6P，形成蔗糖-6-磷酸，最终由蔗糖磷酸磷酸酶（SPP）去磷酸化生成蔗糖。第二个模块C12Suc2由PGI、PGM、GalU和SUS组成。在此构型中，SUS通过将葡萄糖部分从UDP-葡萄糖转移至果糖来催化蔗糖的形成。第三个模块C12Suc3与C12Suc2结构相似，但以AGP替代GalU，AGP催化G1P和ATP生成ADP-葡萄糖和PPi。随后SUS利用ADP-葡萄糖生成蔗糖。
热力学分析显示，标准条件下从甲醇合成F6P的整体吉布斯自由能变化（ΔG°）为−813.5 kJ mol⁻¹，经C12Suc1、C12Suc2和C12Suc3模块从F6P合成蔗糖的计算整体ΔG°分别为−11.9、−11.9和−12.3 kJ mol⁻¹（图2b）。因此，从甲醇合成蔗糖的总ΔG°为−1638.9 kJ mol⁻¹，表明所设计的途径在热力学上是有利的。总之，所设计的从甲醇合成蔗糖的生物合成途径包含10个酶促步骤，每生产一分子蔗糖仅需2个ATP（图2）。
为确保辅因子高效再生，系统中整合了两种辅助酶：PPK（利用多聚磷酸盐作为能量供体从ADP再生ATP）和Ndk（催化UDP和ATP转化为UTP和ADP）。其他酶包括CAT（将H₂O₂分解为H₂O）和PPa（将副产物PPi分解为游离磷酸盐）。这些酶用于将反应平衡向蔗糖合成方向拉动。总体而言，通过该体外途径合成一分子蔗糖消耗12当量甲醇、6当量分子氧和2个磷酸键当量，同时生成2个无机磷酸分子作为副产物（图2）。
【数据】F6P合成ΔG°：−813.5 kJ mol⁻¹（从甲醇）；C12Suc1/C12Suc2/C12Suc3模块ΔG°：−11.9/−11.9/−12.3 kJ mol⁻¹；总ΔG°：−1638.9 kJ mol⁻¹；酶促步骤：10步；ATP消耗：2 ATP/蔗糖；甲醇消耗：12当量；O₂消耗：6当量
3.2 C12Suc模块的工程改造用于蔗糖合成
为实现从C1底物生物合成蔗糖，开发高效的C12Suc模块以将中间体F6P转化为蔗糖至关重要。在C12Suc1中，来源于天然产蔗糖生物Synechocystis sp. PCC6803的SPS和SPP基因被合成并在E. coli BL21(DE3)中异源表达。然而，两种酶均未观察到可溶性表达。因此，研究重点转向替代方案C12Suc2和C12Suc3模块，其中关键酶为SUS。
在自然界中，SUS催化蔗糖可逆裂解为果糖和UDP-葡萄糖，该酶已被广泛用于体外生产甜菊糖苷和罗汉果苷。本研究中，利用SUS的逆向转糖基化活性——将葡萄糖从UDP-葡萄糖或ADP-葡萄糖转移至果糖——来实现蔗糖的形成。
为筛选合适的SUS候选酶，从不同生物中过表达了多种SUS，并评估了它们对ADP-葡萄糖/GDP-葡萄糖和果糖的催化活性。所有测试的SUS均表现出对ADP-葡萄糖和GDP-葡萄糖的合成能力，其中来源于大豆（Glycine max）的SUS（GmSUS）表现出最高的比活性6.7 U mg⁻¹（图3a、b）。
在两个模块中，C12Suc3更受青睐，因为它在热力学上更有利且避免了依赖Ndk的UTP再生。然而，所有测试的SUS对ADP-葡萄糖的催化活性均显著低于对UDP-葡萄糖的活性。为获得催化效率提高的SUS，选择GmSUS进行深度工程改造。
基于祖先序列重建方法的酶工程已被证明能有效提高酶活性、底物特异性、热稳定性和区域选择性。本研究将此策略应用于GmSUS的工程改造。从UniProt数据库中共检索到1775条与GmSUS长度相似的蔗糖合酶序列。经序列比对后，选取115条与GmSUS一致性为50%–80%的序列进行进一步分析。随后进行逐残基保守性分析以确定可变位点。基于此分析，选择GmSUS中的61个残基进行定点突变，每个位点突变为该位点出现频率更高的氨基酸。
在这些单点变体中，L98V、A104E、Y390F和C563G四个突变体在使用ADP-葡萄糖和UDP-葡萄糖作为底物时均表现出改善的蔗糖合成能力。值得注意的是，C563G突变体对两种底物均表现出最高的催化活性。随后将有利的单点突变体组合，获得组合突变体L98V/A104E/C563G，命名为GmSUS-M3。与野生型相比，GmSUS-M3对两种糖核苷酸的比活性均提高了3倍（图3c）。
此外，为测定从F6P和果糖合成蔗糖的能力，使用工程突变体GmSUS-M3以及来自E. coli的其他酶（PGI、PGM、GalU、AGP、Ndk和PPa）构建了C12Suc2和C12Suc3模块。值得注意的是，将野生型GmSUS替换为GmSUS-M3确实使C12Suc2和C12Suc3的蔗糖产量提高了43%–70%（图3d）。C12Suc2中的蔗糖浓度高于C12Suc3，这可能是由于GmSUS-M3对UDP-葡萄糖的催化效率高于ADP-葡萄糖。
为进一步增强C12Suc2模块中的ATP再生，引入了来源于结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的PPK（MtPPK）。这显著将蔗糖转化率从44%提高至72%（图3e）。这些结果验证了工程化的C12Suc2和C12Suc3模块在高效体外蔗糖生物合成中的可行性和有效性。
【数据】GmSUS最高比活性：6.7 U mg⁻¹；突变位点数：61个；有利单点突变：L98V、A104E、Y390F、C563G；组合突变体：GmSUS-M3（L98V/A104E/C563G）；比活性提高：3倍；蔗糖产量增加：43%–70%；转化率提升：44%→72%（引入MtPPK后）
3.3 F6PP的酶工程改造
C12Suc2和C12Suc3模块需要果糖作为前体，果糖可通过F6P酶促去磷酸化获得。然而，来源于卤酸脱卤酶超家族的天然磷酸酶通常表现出广泛的底物混杂性，这限制了它们对F6P的效率和特异性。因此，开发一种对F6P具有高催化活性和特异性的磷酸酶是优化途径的关键步骤。
为此，使用聚焦理性迭代位点特异性突变（FRISM）方法对来源于Thermotoga sp. 38H的候选磷酸酶（Ts38HPase）进行工程改造。Ts38HPase与F6P的分子对接揭示，四个氨基酸（L149、S177、Y181和E183）位于F6P糖环周围（图4a）。因此，对这些位点进行饱和突变，并使用含有G1P、G6P和F6P的混合底物测定法筛选所得突变体。定量了果糖浓度及其在总去磷酸化单糖产物中的比例（P F）。具有高果糖浓度和高P F值的突变体被认为具有改善的F6P催化活性和特异性。
【数据】饱和突变位点：L149、S177、Y181、E183；底物：F6P/G6P/G1P混合物（各20 mmol L⁻¹）；筛选指标：果糖浓度和P F值
3.4 从C1和C3分子体外合成蔗糖的验证
（此节原文节选未完整提供，以下为可获得的忠实翻译内容）
基于上述模块验证和酶工程成果，研究者进一步组装了完整的ivBT-蔗糖系统，以C1（甲醛/甲醇）和C3（DHA）分子为底物进行蔗糖合成。通过迭代扫描和系统滴定策略对反应体系进行了优化（图5a），并对从DHA合成蔗糖（图5b）、从200 mmol L⁻¹ FALD合成蔗糖（图5c）以及从200 mmol L⁻¹甲醇合成蔗糖（图5d）进行了验证。
【数据】FALD浓度：200 mmol L⁻¹；甲醇浓度：200 mmol L⁻¹；反应温度：30°C
3.5 体外淀粉合成
在成功实现体外蔗糖合成的基础上，研究者进一步探索了从蔗糖出发合成直链淀粉的可行性。图6a展示了ivBT-淀粉合成的路线图。图6b和6c分别展示了ivBT-淀粉中从G1P到淀粉的每一步反应及整体反应的标准吉布斯自由能变化。
【数据】原文未详述具体数值
3.6 从甲醇体外合成纤维寡糖（COS）
图7a展示了从甲醇合成COS的设计途径。图7b显示了不同COS的最终浓度。数据显示为平均值±标准差（n = 3次独立实验）。
【数据】n = 3次独立实验；数据表示为平均值±SD
讨论与解读
近期研究聚焦于工程改造光合微生物和甲醇甲基营养酵母，通过卡尔文-本森-巴沙姆（CBB）循环或木酮糖单磷酸循环（XuMP）从CO₂或C1分子合成蔗糖。每合成一分子蔗糖，CBB途径需要24个NADPH、37个ATP和20步反应，而XuMP途径需要13个ATP和18步反应。本工作中，从甲醇合成蔗糖的设计路线仅涉及10步反应，每合成一分子蔗糖仅消耗2个ATP——显著低于天然XuMP循环和CBB循环的能耗。
在构建和验证所设计的ivBT系统过程中，需要解决一些难题：（i）候选酶的催化性能（如活性、稳定性和特异性）有时与设计系统不匹配；（ii）候选酶有其各自适宜的反应条件，将所有酶简单地混合在一个反应器中会面临不相容问题，导致产量和转化率低下。为应对这些挑战，研究者使用祖先序列重建和结构引导的FRISM方法对SUS和F6PP两种关键酶进行了工程改造，使其催化效率提高了3至70倍。同时，利用迭代扫描策略系统优化了ivBT系统的反应条件，将转化率从59%提高至86%。
编译者解读
本研究展示了无细胞合成生物学在碳水化合物制造中的巨大潜力。从方法学角度看，将祖先序列重建与FRISM策略分别应用于蔗糖合酶和磷酸酶的改造，体现了"序列信息挖掘+结构理性设计"的互补思路，3至71倍的催化效率提升充分说明酶工程在途径构建中的核心地位。从应用价值看，10步反应、2个ATP/蔗糖的能耗远低于天然CBB和XuMP途径，这一热力学优势使体外合成路线具备了工业放大的可能性。然而，多酶一锅法的长期稳定性、辅因子再生效率以及高浓度底物下酶的耐受性仍是实际应用中的瓶颈。该平台向纤维寡糖等聚合物的延伸，为绿色生物制造开辟了值得期待的新方向。
参考来源
Wang Y. Cell-free synthesis of high-order carbohydrates from low-carbon molecules. Science Bulletin, 2025. DOI: 10.1016/j.scib.2025.04.069
DOI: 10.1016/j.scib.2025.04.069