来源：Development of translationally active cell lysates from different filamentous fungi for application in cell-free protein synthesis（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
无细胞蛋白合成（CFPS）系统凭借快速、可控的优势成为蛋白生产的重要工具，但现有平台多基于大肠杆菌、昆虫细胞或兔网织红细胞。本研究系统考察了22种丝状真菌裂解液的体外翻译活性，发现其中12种能够翻译报告蛋白GFP或萤火虫荧光素酶，并成功实现了两种真菌来源的非特异性过氧化物酶（UPO）的功能性无细胞表达。以粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）为平台，通过优化培养与裂解液制备条件，荧光素酶和GFP的蛋白产量分别提升了25倍和17倍。该研究为真菌裂解液在无细胞合成中的应用打开了新的大门。
研究背景
无细胞蛋白合成（CFPS）能够在数小时内快速获得目标蛋白，与基于活细胞的传统工艺相比，无需数天的转化和培养，也不会持续产生无关的细胞蛋白和副产物。CFPS在体外人工系统中进行，条件尽可能明确可控。用于翻译的裂解液通常来自大肠杆菌、草地贪夜蛾（昆虫）、酿酒酵母、中国仓鼠卵巢细胞、兔网织红细胞、小麦胚芽和HeLa细胞等。大肠杆菌裂解液是大规模生产简单蛋白的首选，而含有内源微粒体的真核平台则更擅长支持翻译后修饰——这些修饰对分泌酶和糖基化膜蛋白的折叠、活性及稳定性至关重要。复杂酶的功能常常依赖辅基的正确掺入，例如高等真菌非特异性过氧化物酶（UPOs，EC 1.11.2.1）中的血红素。UPOs属于真菌来源的分泌型血红素酶，具有过氧化物酶和过氧化氢酶的双重催化活性，能够催化多种氧化反应，在精细化学品合成和环境修复领域具有广阔应用前景。然而，在细胞系统中表达UPOs面临诸多困难，包括蛋白折叠、糖基化以及血红素正确掺入等问题。无细胞蛋白合成系统为功能性UPOs的表达提供了一种新的可能性，但现有的无细胞平台在翻译后修饰和复杂酶表达方面的能力仍有局限。基于丝状真菌的CFPS系统因其培养简单、快速、廉价，且具有高生物量时空产率和强大的催化能力，展现出巨大的应用潜力。
研究方法
2.1 实验菌株
所用真菌菌株分别来自德国微生物菌种保藏中心（DSM）、荷兰真菌菌种保藏中心（CBS）、美国典型培养物保藏中心（ATCC），或保存于德国勃兰登堡理工大学科特布斯-森夫滕贝格分校生物技术研究所的菌种保藏库（S和V菌株）（表1）。
2.2 化学试剂与材料
麦芽提取物、大豆蛋白胨（IV型粉末）、HEPES、来源于面包酵母的tRNA、4-羟基普萘洛尔、ATP和GTP购自Sigma-Aldrich（德国陶夫基兴）。酵母提取物分别购自Alfa Aesar（德国卡尔斯鲁厄）和AppliChem（德国达姆施塔特），后者还提供了DMSO。酪蛋白胨、微球菌核酸酶、Pierce™重组GFP和RiboLock RNA酶抑制剂购自Thermo Scientific™（德国达姆施塔特）。甘露醇、葡萄糖一水合物和PMSF购自Roth（德国卡尔斯鲁厄）。磷酸肌酸和肌酸激酶由Roche（德国曼海姆）提供。乙酸钾、乙酸镁以及（牛）胰蛋白胨购自VWR（德国达姆施塔特）。萤火虫荧光素酶对照mRNA、QuantiLum®重组荧光素酶、ONE-Glo™荧光素酶检测系统和二硫苏糖醇（DTT）购自Promega（德国瓦尔多夫），GFP对照mRNA购自OZ Biosciences（法国马赛）。HiScribe™ T7 ARCA mRNA合成试剂盒（无加尾）购自New England Biolabs（德国法兰克福）。黑色96孔板（透明平底、非结合表面）购自Corning（美国肯纳邦克），白色96孔板（ELISA、平底、中等结合力）购自Sarstedt（德国纽姆布雷希特）。
2.3 裂解液制备
#### 2.3.1 培养
丝状真菌一般在500 mL锥形瓶中于旋转摇床（Multitron 2，Infors AG，瑞士博廷根）上培养，瓶中装有100或200 mL不同培养基（g L⁻¹）：YPD（20葡萄糖、20蛋白胨、10酵母提取物）、MP（30麦芽提取物、3大豆蛋白胨）、N100[25]（基础碳氮丰富培养基；28葡萄糖、12大豆蛋白胨、3酵母提取物）、HA[26]（10葡萄糖、10酵母提取物）、2HA-MS[27]（不含消泡剂）和Vogel's[28]（Medium N含15蔗糖）。培养基接种物为孢子悬浮液或匀浆化的菌丝体。后者是将琼脂平板上生长的预培养物在40 mL无菌0.9%氯化钠溶液中用浸入式搅拌器（Ultra-Turrax®，IKA T25 Digital）匀浆。N. crassa的培养条件列于补充信息表S1，其他真菌的培养条件列于补充信息表S3和S4。
#### 2.3.2 细胞裂解液制备
菌丝体通过真空抽滤收获，并用50 mL 4°C预冷的甘露醇缓冲液A[29]洗涤三次。然后按每克鲜重加入1或1.5 mL预冷裂解缓冲液A[29]重悬菌丝体。除非另有说明，细胞破碎采用French press（HTU Digi-F Press，G. Heinemann Ultraschall- und Labortechnik，德国施韦比施格明德），在4°C、5000或10,000 psi条件下进行。粗裂解液在4°C下以6500 × g离心5分钟或16,000 × g离心10分钟（表S1、S3和S4）。取上清液置于干净管中，在相同条件下再次澄清。然后收集上清液顶部90%部分，避免混入细胞碎片。所有步骤尽可能快速完成，样品在此期间保持在冰上。破碎过程的质量和裂解效率通过第一次离心后重悬沉淀的显微镜检查来确定，破坏细胞的百分比估算采用半定量方法。一般情况下，通过向上清液中添加微球菌核酸酶[29]并在室温孵育10分钟来去除内源mRNA。裂解液分装（100–500 μL）后在液氮中速冻，于−80°C保存备用。
2.4 无细胞蛋白合成
#### 2.4.1 mRNA模板
萤火虫荧光素酶和GFP mRNA为购买获得。两种体外转录mRNA的3′-端均含有poly(A)尾，GFP mRNA的5′-端还通过帽结构（Cap1）额外稳定。为考察不同真菌裂解液合成UPOs的能力，使用了来自Cyclocybe (Agrocybe) aegerita UPO（AaeUPO；UniProtKB/Swiss-Prot: B9W4V6）的upo1基因，该基因序列针对酿酒酵母进行了密码子优化，含有C端六组氨酸肽段以便后续纯化/固定化[30]，并克隆至pYES2载体。加帽和加poly(A)尾的mRNA按照Schramm等人[24]的方案生产和纯化。比较了N. crassa的不同裂解液合成UPOs的能力，采用了一种比上述方法工作步骤更少的偶联转录/翻译方法。选择了两种UPO：一种代表长链UPO组（AaeUPO），另一种代表来自黑曲霉（Aspergillus niger）的短链UPO（AniUPO；基因登录号XP_001390900.2）。两个基因的序列均针对酿酒酵母进行了密码子优化，存在于pYES2载体中，并带有C端6 × 组氨酸标签。编码AaeUPO的开放阅读框长度为1134个核苷酸，AniUPO为816个核苷酸。使用XhoI（位于UPO基因下游直接位置）线性化的1 µg质粒，以HiScribe™ T7 ARCA mRNA试剂盒（无加尾）进行跑马转录。合成的mRNA不经进一步纯化直接使用。
#### 2.4.2 CFPS操作流程
体外翻译使用新鲜配制的4 × 翻译混合液，含有80 mM HEPES-KOH pH 7.4、4 mM ATP、0.4 mM GTP、8 mM DTT、80 mM磷酸肌酸、200 mM乙酸钾、6.4 mM乙酸镁、0.24 mg mL⁻¹酵母tRNA、氨基酸混合液（各0.08 mM）、0.24 U μL⁻¹肌酸磷酸激酶和0.4 U μL⁻¹ RNA酶抑制剂。无细胞反应混合物由25%翻译混合液、溶于无核酸酶水的mRNA和50%真菌裂解液组成。反应混合物中使用的组分和浓度参考了Wu等人[22]以及Hodgman和Jewett[29]的方案。无模板对照仅含有无核酸酶水替代mRNA。对于萤火虫荧光素酶，CFPS反应在1.5 mL Eppendorf反应管中以20 μL体积、28 nM（0.3 µg）mRNA进行。对于GFP，在黑色96孔板中进行20 μL反应，含24 nM（0.15 µg）mRNA。对于纯化AaeUPO mRNA的翻译，使用40 μL反应体积、14 nM（0.25 µg）mRNA，在1.5 mL反应管中进行。对于AaeUPO和AniUPO的偶联合成，分别向20 μL反应混合物中加入0.75 µL未纯化mRNA。所有CFPS反应均在18°C下孵育。
2.5 分析检测
#### 2.5.1 检测方法
报告蛋白萤火虫荧光素酶的活性使用ONE-Glo™荧光素酶检测系统（Promega，德国瓦尔多夫）评估。孵育90分钟后，取10 μL CFPS反应混合物加入白色96孔板中40 μL含有荧光素酶检测试剂的荧光素酶检测缓冲液中[24]。测量前，板在CLARIOstar Plus酶标仪（BMG Labtech，德国奥滕贝格）中以300 rpm振荡60秒。荧光素酶催化的底物荧光素氧化产生的光发射以相对光单位（RLU）检测。为评估孵育4小时后的体外翻译GFP，向样品中加入100 µL HEPES检测缓冲液[31]，板在酶标仪中以300 rpm振荡60秒。再孵育1小时使蛋白完全折叠后，以470–15/515–20 nm的激发/发射波长和底部光路测量相对荧光单位（RFU）。无模板对照（NTC）的荧光值从对应样品的值中减去。在每个筛选实验中，经核酸酶处理的N. crassa裂解液作为阳性对照。
研究结果
3.1 裂解液制备
一般情况下，培养物在1–3天孵育期内产生足够的生物量，通过真空抽滤收获。这使得真菌生物量可以快速收集，并在一个步骤中完成缓冲液洗涤。N. crassa生物量的时空产率在10至30 g鲜重L⁻¹ d⁻¹之间（表S1）。对于黑曲霉、禾谷镰刀菌、木霉属、毛霉属、根霉属以及青霉属的代表菌株，这些值在20至60 g范围内。最高时空产率可达90 g L⁻¹ d⁻¹，由Ashbya gossypii实现。测试的两种担子菌Cyclocybe (Agrocybe) aegerita和Coprinellus micaceus生长非常缓慢（表S3和S4）。
French press实现了真菌菌丝体非常均匀、可重复的破碎。测试的其他破碎方法，如Retsch混合球磨仪（MM 400，Retsch，德国哈恩），即使对冷冻细胞也导致不均匀的细胞破碎，同一份样品中可同时找到完整的菌丝体和完全破碎的细胞组分如细胞壁（图1）。尽管Retsch球磨仪的总体破碎率更高，达80%，而French press为30%，但Pseudogymnoascus sp.的裂解液不再显示任何报告蛋白的翻译活性（表S3，裂解液126T和128T）。这可能与细胞破坏机制有关：French press对细胞施加的是突然的压力下降和一次性剪切力，而高速匀浆器中材料被粉碎颗粒非常频繁地撞击，这可能损坏了蛋白质合成装置。
3.2 真菌细胞裂解液中报告基因的体外翻译
通过翻译两种常用报告基因[32]来测试细胞裂解液的功能性：萤火虫荧光素酶（生物发光）和GFP（荧光）。荧光素酶催化的荧光素氧化是一种酶促信号放大，使得该酶的检测非常灵敏。两种报告蛋白均为不需要翻译后修饰的胞质蛋白。在检测的22种不同丝状真菌中，有12种检测到至少一种报告基因的体外翻译（图2）。最高产量来自N. crassa、木霉属、Pseudogymnoascus sp.、禾谷镰刀菌、黑曲霉和Metarhizium anisopliae的裂解液，这些真菌均属于子囊菌门。不同裂解液合成的荧光素酶和GFP之间没有相关性——有些更擅长表达荧光素酶（N. crassa、黑曲霉和M. anisopliae），另一些更擅长产生GFP（木霉属、Pseudogymnoascus sp.和F. graminearum）。这与一般经验一致，即不同生物体的裂解液在目标表达方面具有不同的能力[33]。不能排除其余裂解液也具有翻译活性，只是在本筛选所用的特定条件下未表现出来。已知细胞裂解液的翻译性能可能对无细胞合成系统中各种组分的浓度非常敏感[29,34–36]。
对于最有潜力的候选菌株N. crassa，研究了培养、细胞破碎和裂解液制备的不同条件对体外翻译能力的影响。优化N. crassa的细胞破碎程序后发现，洗涤和裂解缓冲液中用作渗透剂的甘露醇并非获得活性裂解液所必需（表S1和S2，裂解液22T–29T、143T）。高渗甘露醇缓冲液在洗涤过程中从菌丝体中去除水分，使菌丝体此后不再膨胀。结果是用甘露醇缓冲液制备的裂解液142T与裂解液143T相比，鲜重减少了35%，且很可能由于膨胀压力降低，破碎率约低20%（表S1和S2，裂解液142T和143T）。然而，裂解液142T的荧光素酶翻译活性比裂解液143T高31%，GFP翻译活性高40%（图3a）。这可归因于细胞结构因失水而浓缩。由于裂解缓冲液的量按鲜重计量，裂解液142T中的细胞组分被稀释程度较低。对于大肠杆菌裂解液，已证明裂解缓冲液体积与生物量的比例对翻译活性有影响[37]。此外，已知甘露醇是蛋白质和细胞结构的渗透保护剂，也是真菌细胞内的抗氧化剂[38,39]。甘露醇等多醇类通过稳定膜结构和维持其功能来充当冷冻保护剂[40]。这些功能可能对裂解液质量和速冻过程也有益。
洗涤和裂解缓冲液通常添加2–4 mM DTT[2,22]作为还原剂，以防止提取物制备过程中的氧化损伤。对于N. crassa裂解液，在提取物制备过程中添加DTT对两种报告蛋白的翻译活性没有观察到影响（图3b）。
最高的细胞破碎率通常与裂解液的最高翻译活性不相关。N. crassa裂解液的最佳结果是在French press的最低可行压力（5000 psi）下获得的。将破碎压力加倍使估计破碎率从70%提高到80–90%的细胞，但平均使裂解液的荧光素酶翻译活性降低至21%，GFP翻译活性降低至54%（图3c）。这也适用于其他丝状真菌。黑曲霉裂解液在仅40%细胞破碎时的活性是80%破碎时的两倍（表S3，115T和116T）。对于Pseudogymnoascus sp.裂解液，尽管细胞破碎率分别为30%和70%，翻译结果相当（表S3，84T和85T）。为保持翻译装置的功能性，发现细胞破碎必须尽可能温和并在4°C左右的温度下进行。
在Hodgman和Jewett[29]的实验中，将酿酒酵母CFPS中的乙酸镁和乙酸钾替换为相应的谷氨酸盐，使活性荧光素酶产量提高了两倍以上。然而在本实验中，当洗涤和裂解缓冲液中的乙酸盐被谷氨酸盐替代时，N. crassa裂解液的翻译活性没有差异（图3c）。
细胞破碎后对裂解液进行离心以去除未破碎细胞、细胞壁碎片和细胞核。总体上观察到，在其他条件相同的情况下，以6500 × g温和离心而非16,000 × g离心，所得裂解液的报告蛋白翻译活性通常高出两倍以上（图3d及表S1和S2，裂解液15–1T至16–3T）。较高力度的离心也会导致囊泡如微粒体（内质网和高尔基体来源的囊泡）的沉降[41]。膜结合核糖体随之一同从裂解液中去除，预计对胞质报告蛋白的翻译不会产生很大的负面影响。在哺乳动物细胞中，已发现膜结合核糖体不加选择地识别mRNA，因此可以启动胞质蛋白和分泌蛋白的合成。在响应胞质蛋白合成时观察到核糖体从内质网膜释放[42]。如果真菌中也存在这种情况，就可以解释为什么去除微粒体后裂解液的翻译活性降低了一半以上。
裂解液制备后，用微球菌核酸酶处理去除内源mRNA在N. crassa中被证明是成功的。这使报告蛋白的翻译活性至少提高了一倍（图4）。核酸酶处理去除了内源mRNA，减少了其与外加报告基因mRNA对核糖体的竞争，同时保留了翻译所需的其他组分。
3.3 培养条件对*N. crassa*裂解液翻译活性的影响
培养基的选择对裂解液的翻译活性有显著影响。在测试的培养基中，含有有机氮源的培养基（如N100和YPD）比无机氮源培养基（Vogel's）产生的裂解液具有更高的翻译活性（图5a）。酵母提取物的来源也影响翻译活性——不同制造商提供的酵母提取物导致裂解液活性存在差异（图5b）。培养时间同样关键：在指数生长期收获的菌丝体产生的裂解液比在稳定期收获的具有更高的翻译活性（图5c）。培养温度的影响也被考察，但结果因具体条件而异（图5d）。
3.4 真菌裂解液中UPO的无细胞合成
除了报告蛋白外，还测试了不同真菌裂解液合成功能性UPO的能力。使用来自C. aegerita的AaeUPO作为模型酶，在40 μL反应体积中、14 nM mRNA、18°C孵育24小时的条件下进行无细胞表达。通过LCMS检测普萘洛尔转化为羟基普萘洛尔的效率来评估UPO活性。结果显示，能够翻译报告蛋白的裂解液通常也能合成功能性AaeUPO（图6）。
进一步使用N. crassa的选定裂解液，通过偶联转录/翻译方法（20 μL反应、0.75 µL未纯化mRNA、18°C孵育24小时）比较了AaeUPO（长链UPO代表）和AniUPO（短链UPO代表）的合成。两种UPO均成功实现了功能性表达（图7），表明N. crassa裂解液能够支持不同长度和结构特征的UPO的无细胞合成。
讨论与解读
本研究在22种丝状真菌中筛选出12种具有报告蛋白翻译活性的裂解液，且除一种外均能合成功能性UPO。仅通过对N. crassa培养和破碎条件的初步优化，荧光素酶产量就提高了25倍，GFP提高了17倍。裂解液尚未进行纯化，无细胞反应的程序和补充条件也尚未优化。该方法证明了真菌裂解液在无细胞合成中的通用潜力，尤其是为UPOs的高通量平行表达开辟了道路——可用于优化合成条件或调整催化剂性质。丝状真菌培养简单、快速、廉价，具有高生物量时空产率，这些优势使其CFPS系统具有巨大的应用前景。未来的工作可聚焦于裂解液的进一步优化、反应条件的系统筛选以及更复杂蛋白（如需要翻译后修饰的蛋白）的表达验证。
【编译者解读】该研究最值得称道之处在于系统性地建立了丝状真菌裂解液CFPS平台，并成功实现了血红素蛋白UPO的功能性表达——这在大肠杆菌等原核系统中往往因辅基掺入和翻译后修饰不足而困难重重。方法上，温和破碎策略（低压力French press）优于高破碎率但剧烈的手段，这一发现对真菌来源无细胞平台的构建具有直接指导意义。局限在于裂解液制备和反应条件尚未系统优化，UPO产量仍有较大提升空间。从合成生物学应用角度看，真菌裂解液CFPS有望成为酶工程改造和功能筛选的高通量工具，尤其适合需要真核翻译后修饰的蛋白靶标。
参考来源
Friedrich S. Development of translationally active cell lysates from different filamentous fungi for application in cell-free protein synthesis. Enzyme and Microbial Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2025.110588
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2025.110588