来源：A cell-free bacteriophage synthesis system for directed evolution（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
噬菌体依赖宿主增殖的特性长期制约着其规模化制备与定向进化应用。本研究构建了一套基于大肠杆菌无细胞蛋白合成系统的M13噬菌体体外合成平台，通过简化噬菌体基因组、优化DNA模板浓度和复制起点，将噬菌体滴度从105 pfu/ml提升至超过109 pfu/ml，合成速率达到体内方法的2–3倍。研究进一步将荧光激活液滴分选（FADS）与该系统整合，开发了液滴内无细胞噬菌体辅助进化（PAE）方法，成功筛选出能通读T7终止子的T7 RNA聚合酶突变体（Val685Ala）以及色氨酸抑制型tRNA（TrpT）突变体。该系统为M13噬菌体的大规模制备和定向进化技术拓展提供了新平台。
研究背景
噬菌体因其感染并在细菌宿主内复制的能力，在医学治疗、肽类药物筛选、工业食品生产以及目的基因（GOI）定向进化等领域备受关注。然而，噬菌体对宿主的依赖性限制了其规模化应用，尤其在噬菌体辅助进化（PAE）中，噬菌体制备面临巨大挑战。研究者近年来尝试利用无细胞合成系统实现噬菌体的体外高效生产，已涵盖T7、psf-2和phiES15等噬菌体，但对M13噬菌体的关注仍然缺乏。
M13噬菌体属于丝状噬菌体科（Inoviridae），具有独特的生命周期——在病毒复制与宿主存活之间维持精妙平衡。其基因组为共价闭合环状单链DNA（ssDNA），长约6.4 kb，编码少量基因，以滚环方式高效复制并在细菌宿主内组装。M13噬菌体主要由蛋白VIII构成的外壳包裹基因组，蛋白VIII约占外壳蛋白的99%，使M13成为迄今报道的最长噬菌体。这些特性使M13在合成生物学和定向进化领域具有独特价值，但其体外合成与组装仍面临挑战。
研究方法
菌株与质粒
M13KO7-ΔPS-ΔgIII-ΔgVI质粒（addgene #80840）、噬菌粒（phagemid，addgene #80852）以及辅助质粒pJPC12-ΔPS-PRM-B0034-geneVI（addgene #80858）均购自Addgene。RFP-TGA基因由IGE Biotech合成，并构建至pT7-GFP质粒的GFP起始密码子下游，融合为RFP-TGA-GFP基因。基因VI的DNA片段使用引物对gVI-F/R扩增，模板为pJPC12-ΔPS-PRM-B0034-geneVI质粒。tRNA的DNA片段使用引物对tRNA-F/R扩增，模板为大肠杆菌BL21(DE3)基因组。T7 RNAP的DNA片段使用引物对T7-F/R扩增，模板为大肠杆菌BL21(DE3)基因组。辅助质粒中基因VI的无义突变使用引物对AP-F/R扩增，模板为pJPC12-ΔPS-PRM-B0034-geneVI质粒。上述基因均使用Hieff Canace® Plus高保真DNA聚合酶（Yeasen Biotech）及相应引物进行扩增。质粒构建使用Hieff Clone® Plus一步克隆试剂盒（Yeasen Biotech）及相应DNA片段完成。
所用引物序列如下：
- gVI-F: 5'-ttgctaacatactgcgtaataaggagtcttaatcatgccagttcttttgggtattccgttattattgcg-3'
- gVI-R: 5'-cctttcgttttatttgatgcctgggtcttcttatttatcccaatccaaataagaaacg-3'
- phagemid1-F: 5'-cgcaataataacggaatacccaaaagaactggcatgattaagactccttattacgcagtatgttagc-3'
- phagemid1-R: 5'-cgtttcttatttggattgggataaataagaagacccaggcatcaaataaaacgaaagg-3'
- tRNA-F: 5'-tgcgtaataaggagtcttaagaagaccccggtggagcggtagttcagtcggttagaatacc-3'
- tRNA-R: 5'-gcccagtctttcgactgagcctttcgttttatttgatgcctctggcaaggatgccggtagaaggatttac-3'
- T7-F: 5'-atgaacacgattaacatcgctaagaacgac-3'
- T7-R: 5'-ttacgcgaacgcgaagtccgactc-3'
- phagemid2-F: 5'-gtaaatccttctaccggcatccttgccagaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactg-ggc-3'
- phagemid2-R: 5'-caggtattctaaccgactgaactaccgctccaccggggtcttcttaagactccttattacgcagtatgtt-agc-3'
- AP-F: 5'-attgggtaccgggcccacaatgtatcttgtaaagaggagaaatactagatgTGATGAccagttcttttgggta-ttccgttattattgcg-3'
- AP-R: 5'-taataacggaatacccaaaagaactggTCATCAcatctagtatttctcctctttacaagatacattgtgggcc-cggtacccaattcgcc-3'
- GFP-F: 5'-tttgtttaactttaagaaggagatatacatatgTGAagcaaaggtgaagaactgtttaccg-3'
- GFP-R: 5'-cggtaaacagttcttcacctttgctTCAcatatgtatatctccttcttaaagttaaacaaa-3'
【数据】质粒来源：Addgene（#80840、#80852、#80858）；聚合酶：Hieff Canace® Plus High-Fidelity DNA Polymerase（Yeasen Biotech）；克隆试剂盒：Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit（Yeasen Biotech）；引物序列：见上文；RFP-TGA基因合成：IGE Biotech
M13噬菌体滴度测定
携带M13KO7-ΔPS-ΔgIII-ΔgVI的大肠杆菌JM109菌株在2× YT培养基（20 g/l胰蛋白胨、10 g/l酵母提取物、10 g/l氯化钠）中、37°C条件下培养至OD600值为0.4–0.6，培养基含50 mg/l卡那霉素。底层平板使用含1.5%琼脂和50 mg/l卡那霉素的LB琼脂平板。噬菌体样品在无菌LB肉汤中进行系列稀释。在无菌管中，将10 μl稀释后的噬菌体与1 ml细菌宿主培养物混合，室温孵育10分钟以促进噬菌体吸附。含0.7%琼脂和50 mg/l卡那霉素的LB软琼脂在50°C水浴中融化并保持液态。向噬菌体-细菌混合物中加入6 ml预热软琼脂，轻轻但充分搅拌。立即将该混合物倾倒在制备好的LB琼脂平板表面。旋转平板使软琼脂均匀分布。让顶层琼脂在室温下凝固。倒置平板，37°C孵育12小时。孵育后，计数每个平板上的噬菌斑（清晰区域）数量。选择30–300个噬菌斑的平板进行准确计数。噬菌体滴度以每毫升噬菌斑形成单位（pfu/ml）计算，公式为：滴度（pfu/ml）=（噬菌斑数）×（稀释倍数）/（噬菌体样品体积）。
【数据】培养基：2× YT（20 g/l胰蛋白胨、10 g/l酵母提取物、10 g/l氯化钠）；抗生素：50 mg/l卡那霉素；培养温度：37°C；OD600：0.4–0.6；吸附时间：室温10分钟；软琼脂浓度：0.7%；底层琼脂浓度：1.5%；孵育时间：37°C、12小时；计数范围：30–300个噬菌斑；滴度公式：Titer (pfu/ml) = (Number of plaques) × (Dilution factor) / (Volume of phage sample)
无细胞噬菌体合成
携带HP质粒的大肠杆菌JM109细胞在5升生物反应器中培养，配备pO2监测和pH控制。在最佳生长期——对数中期收获培养物，随后洗涤并立即在液氮中快速冷冻。随后在-80°C下储存过夜。次日，将沉淀在冰上小心解冻并重悬。细胞破碎通过溶菌酶处理和超声处理相结合实现，随后进行离心。接着，细胞在37°C下孵育，进行第二次离心。最后，将所得细胞裂解物透析，再进行一轮离心，然后在液氮中快速冷冻，于-80°C储存备用。
噬菌体合成与组装按照先前报道的方法进行。具体而言，储备缓冲液组成如下：6 mM 谷氨酸镁、20 mM 谷氨酸钾、2 mM DTT、各1.5 mM氨基酸、50 mM HEPES、1.5 mM ATP和GTP、0.9 mM CTP和UTP、0.2 mg/ml tRNA、0.26 mM CoA、0.33 mM NAD、0.75 mM cAMP、0.068 mM亚叶酸、1 mM亚精胺、30 mM 3-PGA、3% PEG-8000，pH 8。无细胞反应混合物包含330 μl大肠杆菌粗提物、7 μl PEG-8000、30 μl dNTPs（25 mM）、10 μl ATP（500 mM）、300 μl储备缓冲液、15 μl GamS（150 mM）和100 ng DNA，在30°C下以总体积1 ml进行反应。
【数据】生物反应器：5 l，含pO2监测和pH控制；培养收获期：对数中期；冷冻条件：液氮速冻，-80°C储存过夜；细胞破碎：溶菌酶+超声处理；孵育温度：37°C；储备缓冲液组分：6 mM Mg-glutamate、20 mM K-glutamate、2 mM DTT、1.5 mM每种氨基酸、50 mM HEPES、1.5 mM ATP/GTP、0.9 mM CTP/UTP、0.2 mg/ml tRNA、0.26 mM CoA、0.33 mM NAD、0.75 mM cAMP、0.068 mM folinic acid、1 mM spermidine、30 mM 3-PGA、3% PEG-8000，pH 8；反应体系：330 μl粗提物、7 μl PEG-8000、30 μl dNTPs（25 mM）、10 μl ATP（500 mM）、300 μl储备缓冲液、15 μl GamS（150 mM）、100 ng DNA；总体积：1 ml；反应温度：30°C
突变噬菌体文库构建
T7 RNAP和TrpT基因的突变文库通过易错PCR构建，使用QuickMutation随机突变试剂盒（Beyotime），按照说明书操作。具体而言，对于T7 RNAP基因，靶区域为T7 RNAP蛋白的C末端（600–883），用于扩增片段的引物为T7MUT-F（5'-gaccgatgagaacactggtgaaatctctgag-3'）和T7MUT-R（5'-cgcgaacgcgaagtccgactctaagatgtc-3'）。使用0.5×突变增强子以尽量减少不需要的插入和缺失。对于TrpT基因，使用tRNA-F/R引物扩增整个DNA。使用5×突变增强子以生成尽可能复杂的突变文库。T7 RNAP和TrpT基因的突变文库分别使用Hieff Clone® Plus一步克隆试剂盒（Yeasen Biotech）克隆到M13基因组骨架中。克隆产物用Hieff NGS® DNA Selection Beads（Yeasen Biotech）纯化，然后加入无细胞系统。在30°C孵育过夜后，从上清液中获得噬菌体。滴度测定后通过Sanger测序验证文库中的突变丰度。
【数据】突变试剂盒：QuickMutation Random Mutagenesis Kit（Beyotime）；T7 RNAP靶区域：C末端（600–883）；T7 RNAP突变引物：T7MUT-F/T7MUT-R；T7 RNAP突变增强子浓度：0.5×；TrpT突变引物：tRNA-F/R；TrpT突变增强子浓度：5×；克隆试剂盒：Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit；纯化：Hieff NGS® DNA Selection Beads；孵育条件：30°C过夜
液滴制备与FADS分选
微流控芯片使用聚二甲基硅氧烷（PDMS，Dow Corning Corp.）通过标准软光刻技术制造。在本装置中，dropmaker芯片以4000 Hz频率生成20 pl液滴，通过将无细胞合成系统（5 μl/min）与两股含4 w/w% FluoSurf表面活性剂的HFE7500氟化油（3M）（10 μl/min）进行流聚焦。液滴生成后，通过PTFE管路引导至收集器。这些液滴随后在30°C孵育6小时。在后续阶段，液滴以0.2 μl/min重新上样，并以1 μl/min的HFE7500氟化油（3M）间隔。在此阶段，液滴通过光学装置进行检测和分析，荧光液滴以500 Hz频率使用AC电场脉冲（30 kHz；700–1000 V；0.5 ms）进行分选。最后，分选后的液滴收集在1.5 ml微量离心管中。相比之下，在分析模式下，重新上样模块操作类似，液滴以约1000 Hz频率进行检测和分析。
【数据】芯片材料：PDMS（Dow Corning Corp.）；液滴体积：20 pl；生成频率：4000 Hz；水相流速：5 μl/min；油相：HFE7500氟化油（3M），含4 w/w% FluoSurf表面活性剂；油相流速：10 μl/min；孵育条件：30°C、6小时；重新上样流速：0.2 μl/min；间隔油流速：1 μl/min；分选频率：500 Hz；AC电场脉冲：30 kHz、700–1000 V、0.5 ms；分析模式检测频率：约1000 Hz
下一代测序
进化完成后，通过添加Drop-Surf乳化剂（FluidicLab）提取液滴中的噬菌体，随后在含有HP的大肠杆菌JM109菌株中扩增。从培养上清液中收集噬菌体，并使用噬菌体DNA分离试剂盒（AmyJet Scientific）提取其DNA。使用NanoDrop（ThermoFisher）检测提取的RNA浓度和质量。接下来，使用高保真DNA聚合酶（Yeasen Biotech）和tRNA-F/R引物扩增TrpT基因的DNA片段。噬菌体DNA的投入量为100 ng，PCR循环数为5。PCR产物使用Hieff NGS® DNA Selection Beads（Yeasen Biotech）纯化。
【数据】乳化剂：Drop-Surf emulsifier（FluidicLab）；扩增宿主：E. coli JM109（含HP）；DNA提取试剂盒：Phage DNA Isolation Kit（AmyJet Scientific）；检测仪器：NanoDrop（ThermoFisher）；聚合酶：High Fidelity DNA Polymerase（Yeasen Biotech）；引物：tRNA-F/R；DNA投入量：100 ng；PCR循环数：5；纯化：Hieff NGS® DNA Selection Beads
研究结果
优化无细胞合成系统实现M13噬菌体的快速稳健制备
我们假设无细胞蛋白合成（CFPS）系统可用于体外生成和组装M13噬菌体，因为M13噬菌体仅包含11个基因，相对易于合成。为验证这一假设，我们提取了大肠杆菌JM109的细胞内容物，通过添加噬菌体颗粒或其基因组DNA来合成M13噬菌体（图1A）。结果显示，噬菌体滴度随时间增加，使用基因组DNA获得的滴度高于使用完整颗粒，但两者均低于体内合成。滴度在12小时达到105噬菌斑形成单位（pfu/ml）的平台期（图1B），远低于定向进化应用的需求。
鉴于CFPS系统使用基因组DNA的性能优于完整颗粒，我们确定了批量噬菌体生产的最佳基因组DNA浓度。结果表明，噬菌体合成随DNA投入量增加而增加，在100 ng/μl浓度时达到平台期（图1C）。此外，浓度低于0.1 ng/μl时，CFPS系统中几乎检测不到噬菌体滴度，这确定了定向进化所需的最小基因组投入量（图1C）。这些发现表明M13噬菌体可以在CFPS系统中合成和组装。
为进一步提高体外噬菌体合成效率，我们根据先前报道简化了噬菌体基因组，以减轻不必要基因表达的压力。所得修饰辅助噬菌体（HP）质粒（M13KO7-ΔPS-ΔgIII-ΔgVI）含有卡那霉素抗性基因（KanR）和除基因III（gIII）、基因VI（gVI）及M13包装信号（PS）外几乎所有增殖所需基因，以抑制HP上的噬菌体增殖。HP质粒转化至大肠杆菌JM109中，提前合成由质粒携带的这些噬菌体增殖相关基因。这种噬菌体-质粒杂合体（噬菌粒）组成型表达PS、gIII和gVI。随后，我们提取了含HP的大肠杆菌JM109的细胞内容物，通过添加噬菌粒测定噬菌体产量。结果显示，简化的噬菌粒显著提高了噬菌体的生产速度和产量。滴度在3小时达到108 pfu/ml的平台期，明显快于体内生成（图1D）。这些结果表明，该CFPS系统可以高效生成和组装功能性M13噬菌体。
随后，为最大化宿主细胞中物质资源的利用，我们将pUC19质粒的高拷贝复制起点（ori）pMB1插入HP中，以增加细胞裂解液中噬菌体增殖所需产物的比例。携带pMB1 ori（据报道为最高拷贝数的ori）时，无细胞系统中M13噬菌体的滴度达到超过109 pfu/ml的平台期，仅略低于体内产量（图1E）。此外，无细胞系统中的噬菌体生成速率比体内高2–3倍（图1E）。
【数据】噬菌体滴度（基因组DNA）：105 pfu/ml（12小时平台期）；最佳基因组DNA浓度：100 ng/μl；最小基因组投入量：<0.1 ng/μl（几乎检测不到滴度）；简化噬菌粒滴度：108 pfu/ml（3小时平台期）；含pMB1 ori滴度：>109 pfu/ml；无细胞系统生成速率：体内方法的2–3倍
开发液滴内无细胞PAE方法
尽管我们在无细胞系统中实现了M13噬菌体的快速高效制备，但由于缺乏独立的进化空间，该系统仍不适用于GOI的定向进化——基因组DNA突变应在筛选过程中特异性包装到相应的表型个体中。为实现这一目标，我们在微液滴中利用了M13噬菌体的无细胞合成系统。将GFP基因插入噬菌粒中以可视化噬菌体合成（图2A）。
接下来，我们确定了在液滴中生成M13噬菌体的DNA投入量。根据结果，选择1.5–2.5 ng/ml噬菌粒的最佳浓度与大肠杆菌JM109细胞内容物包埋，以确保10–20%的液滴含有噬菌体产物，避免多克隆干扰（图2B）。鉴于GFP的荧光强度可可视化噬菌体合成，我们利用FADS获取液滴，其内容物有助于M13噬菌体的合成。为测试液滴分选对噬菌体生成的效率，我们将含或不含GFP基因的噬菌粒等量混合，然后将混合物加入无细胞系统制备液滴。约六分之一的液滴表现出GFP荧光，证实含GFP基因的噬菌粒能有效生成荧光蛋白。通过FADS分选时，几乎所有分选出的液滴都表现出绿色荧光，表明这些液滴含有带GFP的噬菌粒（图2C,D）。废弃液滴中未观察到绿色荧光。这些结果表明，FADS有效富集了在噬菌体合成方面具有优势的液滴，并保护噬菌体免受交叉污染。
【数据】最佳噬菌粒浓度：1.5–2.5 ng/ml；含噬菌体液滴比例：10–20%；GFP阳性液滴比例：约1/6；分选后GFP阳性液滴比例：几乎所有
无细胞PAE筛选通读T7终止子的T7 RNAP
由于我们优化的噬菌粒在无细胞M13噬菌体制备和FADS系统中表现良好，我们研究了该系统是否适用于定向进化。为此，我们聚焦于T7 RNAP——一种在定向进化中常用的重要酶，是基因工程和RNA合成中的理想GOI。尽管现有T7 RNAP在许多应用中表现良好，但其延伸性仍受到某些RNA结构（如发夹结构）的阻碍，限制了其在复杂DNA模板上的转录能力。
为解决这一问题，设计了一种特异性报告系统来确定T7 RNAP通读T7终止子的能力（图3A）。在噬菌粒中，基因VI（gVI）和GFP被设计为位于T7启动子（PT7）和终止子（TT7）表达盒下游的传感器。为高效快速地获得尽可能广泛的突变文库，我们使用易错PCR（epPCR）在噬菌粒中构建了T7 RNAP C末端（600–883）的突变文库，该区域包含T7 RNAP的主要活性中心。
M13噬菌体生成和FADS分选后，我们获得了一个T7 RNAP突变体——第685位缬氨酸突变为丙氨酸（Val685Ala），经Sanger测序验证（图3B）。三级结构模型显示，该残基位于非模板链和活性中心附近（图3C）。缬氨酸突变为丙氨酸可能扩大了酶内部通道的范围，从而减少了发夹结构对聚合酶延伸的阻碍。近期研究表明，T7 RNAP C末端附近有一个溶剂难以进入的小空腔，允许插入额外的氨基酸残基。C末端较大的氨基酸残基可能减少RNA产量，这与观察到的现象相似。
【数据】T7 RNAP突变文库靶区域：C末端（600–883）；突变方法：易错PCR（epPCR）；获得突变：Val685Ala；验证方法：Sanger测序；突变位点位置：第685位，非模板链和活性中心附近
无细胞PAE筛选色氨酸抑制型tRNA（TrpT）
（注：原文结果部分对TrpT筛选的详细数据未在节选中完整呈现，以下依据可获得原文内容进行编译。）
我们进一步将该系统应用于TrpT的定向进化。在优化的无细胞噬菌体生产系统中，将TrpT基因构建至噬菌粒中（图4A）。通过NGS数据分析对照组与实验组之间的相关性（图4B），评估突变富集情况。
【数据】TrpT筛选方法：无细胞PAE；分析工具：NGS数据相关性热图（图4B）；具体富集数值：原文未详述
讨论与解读
噬菌体制备技术是噬菌体应用过程中的重要环节。传统技术依赖噬菌体在新鲜宿主菌株中增殖，每次噬菌体制备都需要繁琐的宿主培养和侵染步骤，限制了噬菌体制备效率。近年来，无细胞合成技术已广泛用于蛋白质和RNA制备，在非膜结构（如核糖体、转录复合物等）组装中也发挥重要作用，因其相比传统方法在噬菌体合成方面具有更大潜力。
与其他通过无细胞合成技术生产的噬菌体不同，M13噬菌体的基因组为ssDNA，采用滚环复制模式。目前尚无关于这种复制模式能否在无细胞合成系统中运作的相关报道。此外，M13噬菌体的个体长径比不均匀（1000 nm:7 nm），导致其组装所需蛋白拷贝数不均匀。每个M13噬菌体含有超过2000拷贝的蛋白VIII，但只有少数拷贝的蛋白VII和IX。这些因素可能使M13噬菌体的体外合成和组装具有挑战性。当使用完整M13基因组作为输入时，噬菌体产量远低于胞内水平。这表明尽管滚环复制在无细胞系统中运作良好，但对体外噬菌体合成而言效率仍然不足。
本研究的核心突破在于通过简化基因组和优化复制起点，将无细胞M13噬菌体合成效率提升至接近体内水平，并将该系统与液滴微流控和FADS结合，实现了真正的"基因型-表型"偶联定向进化。值得关注的是，该系统采用ssDNA噬菌体作为进化载体，其滚环复制机制在无细胞环境中的成功运作拓展了无细胞合成平台的应用边界。此外，液滴 compartmentalization 有效解决了无细胞系统中缺乏独立进化空间的核心问题，为连续进化策略提供了新的技术路径。该方法在T7 RNAP和TrpT两个案例中的成功验证，表明其具有一定的通用性。未来的挑战在于如何进一步提升突变文库的复杂度和进化连续性，以及将该系统扩展到更复杂的GOI进化场景。
编译者解读
本研究展示了无细胞合成生物学与定向进化技术的巧妙融合。选择M13丝状噬菌体作为底盘，利用其基因组简单、组装机制独特的优势，通过"基因组精简+复制起点优化"双策略，将体外噬菌体产量从105提升至109 pfu/ml量级——这一数量级跃迁为液滴内单噬菌体进化提供了必要前提。液滴微流控+FADS的整合设计尤为精妙，它解决了无细胞系统缺乏区室化的核心痛点，使基因型与表型的物理偶联成为可能。从应用角度看，该平台不仅为M13噬菌体的大规模制备提供了不依赖宿主的新路径，更为重要的是，它建立了一个可编程的体外定向进化框架——未来或将拓展至更多类型的生物大分子进化。
参考来源
Xu, B. A cell-free bacteriophage synthesis system for directed evolution. Trends in Biotechnology, 2025. DOI: 10.1016/j.tibtech.2024.10.005
DOI: 10.1016/j.tibtech.2024.10.005