来源：Construction and optimization of a cell-free metabolic engineering system for lycopene synthesis（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
番茄红素是一种具有抗氧化、抗炎和抗衰老特性的天然红色类胡萝卜素，广泛应用于医药和食品领域。本研究从耐辐射奇球菌（Deinococcus wulumuqiensis R12）中挖掘三种关键酶——香叶基香叶基焦磷酸合酶（GGPPS）、八氢番茄红素合酶（PSY）和八氢番茄红素脱氢酶（PDS），通过生物信息学分析、异源可溶表达，构建并优化了基于纯化酶和粗细胞提取物的无细胞代谢工程（CFME）合成系统，最终在24小时内实现14.06 mg/L的番茄红素产量，并验证了该系统在快速酶筛选和体内合成验证中的应用潜力。
研究背景
番茄红素是由植物和微生物合成的天然红色类胡萝卜素，因其抗氧化、抗炎和抗衰老等特性，被广泛用于药物制剂和食品添加剂等领域。番茄红素的生物合成是一个多酶级联反应过程，其直接代谢前体异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）主要通过2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径和甲羟戊酸（MVA）途径生成。MEP途径主要存在于原核生物中，由丙酮酸与3-磷酸甘油醛（G3P）缩合启动；MVA途径则主要存在于真核生物中，以乙酰辅酶A为基本底物。这些类异戊二烯前体经连续缩合反应，依次由法尼基焦磷酸合酶（ISPA）、GGPPS、PSY和PDS催化延伸，最终生成番茄红素（图1）。
与植物提取和化学合成方法相比，微生物发酵技术已成为番茄红素生物生产越来越有前景的策略。然而，传统的体内代谢工程面临代谢通量调控复杂、产物毒性累积、优化周期长等瓶颈。无细胞代谢工程系统通过体外组装多酶级联反应，绕开了细胞生长的限制，为复杂化合物的快速合成与路径优化提供了新平台。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养基
本研究所用菌株和质粒列于表S1。E. coli DH5α用于克隆和质粒增殖；E. coli BL21(DE3)用于重组蛋白表达和制备无细胞系统所需的粗细胞提取物。Deinococcus radiodurans R1（R1）和Deinococcus wulumuqiensis R12（R12）在TGY液体培养基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物3 g/L、葡萄糖1 g/L，pH 7.2）中、28°C、180 rpm条件下培养24–48小时，直至培养物变为深红色。重组E. coli菌株在液体LB培养基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）中、37°C、180 rpm培养14–16小时，或在含适当抗生素的2×YT培养基（胰蛋白胨16 g/L、酵母提取物10 g/L、NaCl 5 g/L）中、30°C、180 rpm培养24小时。当培养物OD600达到0.6–0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.1 mM，然后在28°C、160 rpm条件下表达4–6小时，或在16°C下过夜表达。
【数据】菌株：E. coli DH5α、BL21(DE3)、R1、R12；培养基：TGY（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物3 g/L、葡萄糖1 g/L，pH 7.2）、LB（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）、2×YT（胰蛋白胨16 g/L、酵母提取物10 g/L、NaCl 5 g/L）；温度：28°C/37°C/30°C/16°C；转速：180 rpm/160 rpm；时间：24–48 h/14–16 h/24 h/4–6 h/过夜；OD600：0.6–0.8；IPTG浓度：0.1 mM
2.2 R12来源GGPPS/PSY/PDS的生物信息学分析
使用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）和ExPASy ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）分析GGPPS、PSY和PDS的氨基酸组成和理化性质。使用SignalP-5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）和TMHMM（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）预测信号肽和跨膜结构。使用NetPhos3.1服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析GGPPS、PSY和PDS的磷酸化水平。使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）预测二级结构。使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）和I-TASSER（https://zhanggroup.org/I-TASSER/）预测三级结构。使用NCBI的Blastp和ClustalX 2.1进行多序列比对。使用MEGA 7.0以邻接法（Neighbor-Joining）和1000次bootstrap重复构建所选氨基酸序列的系统发育树。使用MEME（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）分析蛋白质的保守基序，使用NCBI保守结构域数据库（CDD）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析蛋白质的结构域。
【数据】分析工具：ProtParam、ExPASy ProtScale、SignalP-5.0、TMHMM、NetPhos3.1、SOPMA、SWISS-MODEL、I-TASSER、Blastp、ClustalX 2.1、MEGA 7.0、MEME、NCBI CDD；系统发育树构建方法：Neighbor-Joining，1000次bootstrap重复
2.3 DNA操作与质粒构建
从先前构建的质粒pET-IE1B1中分别扩增R12来源的crtE、crtB和crtI编码序列[29]。R1来源的crtB基因从R1基因组DNA中扩增，而来自Pantoea ananatis、Pantoea agglomerans和Thermus thermophilus的同源基因经密码子优化后由Genewiz（Genewiz Biotech Co. Ltd, China）合成。为进行体内功能验证，通过共转化pET22b-ETheBI和pRSFDuet-EtheB构建了重组菌株L1。所有用于克隆的引物列于表S2。
【数据】模板质粒：pET-IE1B1；体内验证质粒：pET22b-ETheBI、pRSFDuet-EtheB；基因来源：R12、R1、Pantoea ananatis、Pantoea agglomerans、Thermus thermophilus
2.4 粗细胞提取物的制备与蛋白纯化
诱导后，通过离心（8000 × g，4°C，10 min）收集细胞，并用冷的20 mM Tris-HCl（pH 8.0）洗涤三次。弃去上清液，将湿细胞沉淀重悬于1 mL 20 mM Tris-HCl（pH 8.0）中，进行超声破碎（210 W，开2 s/关6 s，10 min，JY92-IIN，Scientz，中国）。裂解液离心（12000 × g，4°C，10 min）三次以去除碎片。所有制备好的粗细胞提取物在液氮中速冻，并在−80°C下保存直至使用。使用镍-NTA柱从粗细胞提取物中纯化带有6×His标签的重组酶。使用Nanodrop分光光度计（ND-1000 UV，NanoDrop Technologies，美国）以牛血清白蛋白为标准测定蛋白浓度。粗细胞提取物中的酶浓度和纯化酶的纯度通过SDS-PAGE确认。
【数据】离心条件：8000 × g（4°C，10 min）、12000 × g（4°C，10 min）；缓冲液：20 mM Tris-HCl（pH 8.0）；超声条件：210 W，开2 s/关6 s，10 min；保存条件：液氮速冻，−80°C；纯化方法：镍-NTA柱；蛋白定量：Nanodrop分光光度计，BSA标准
2.5 酶活性检测
酶活性定量参照Beck等人先前的研究方法[32]。将纯化的GGPPS加入PSY和PDS富集的粗细胞提取物混合物中，在30°C下孵育24小时。以PSY+PDS粗提物混合物作为阴性对照。同样，将纯化的PSY加入GGPPS和PDS粗提物混合物中（以GGPPS+PDS粗提物混合物为对照）。将纯化的PDS加入GGPPS和PSY粗提物混合物中（以GGPPS+PSY粗提物混合物为对照）。监测所有反应的显色变化以指示番茄红素的积累，酶活性通过分光光度法测定。
【数据】反应温度：30°C；反应时间：24 h；对照设置：PSY+PDS、GGPPS+PDS、GGPPS+PSY粗提物混合物
2.6 CFME反应
基于纯化酶的200 μL CFME系统包含：50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、MgCl₂（8 mM）、0.1%（w/v）Triton X-100、DTT（1 mM）、ATP（10 mM）、NAD（5 mM）、底物（60 μM，IPP:FPP=1:1）、GGPPS、PSY和PDS各1 mg/L。反应在30°C避光条件下进行。
基于粗细胞提取物的200 μL CFME系统包含：醋酸镁（8 mM）、醋酸铵（10 mM）、醋酸钾（134 mM）、磷酸氢二钾缓冲液（10 mM，pH 7.2）、Bis-Tris（100 mM）、NAD（1 mM）、ATP（1 mM）、CoA（1 mM）、底物（10 μM，IPP:FPP=1:1）和酶富集粗提取物。初始总蛋白浓度为35 mg/mL，GGPPS:PSY:PDS的酶比例为1:1:1。粗细胞提取物中GGPPS、PSY和PDS的浓度通过Image J软件对SDS-PAGE凝胶进行光密度测定确定。反应在30°C避光条件下进行。
【数据】纯化酶系统：Tris-HCl 50 mM（pH 8.0）、MgCl₂ 8 mM、Triton X-100 0.1%（w/v）、DTT 1 mM、ATP 10 mM、NAD 5 mM、底物60 μM（IPP:FPP=1:1）、各酶1 mg/L；粗提物系统：醋酸镁8 mM、醋酸铵10 mM、醋酸钾134 mM、磷酸氢二钾10 mM（pH 7.2）、Bis-Tris 100 mM、NAD 1 mM、ATP 1 mM、CoA 1 mM、底物10 μM（IPP:FPP=1:1）、总蛋白35 mg/mL、酶比例1:1:1；反应条件：30°C避光
2.7 番茄红素的提取与检测
反应结束后，将混合物离心（12000 × g，4°C，5 min），向沉淀中加入200 μL浓度为1 g/L的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）丙酮溶液进行番茄红素提取。同时，将上清液离心，根据先前研究[29]通过HPLC测定番茄红素滴度。所有实验数据代表三次独立实验的平均值±标准差。
【数据】离心条件：12000 × g，4°C，5 min；提取液：1 g/L BHT丙酮溶液200 μL；检测方法：HPLC；重复次数：3次独立实验
研究结果
3.1 GGPPS、PSY和PDS的生物信息学分析
GGPPS、PSY和PDS的预测理化性质汇总于表S3。为探究不同细菌/真菌来源GGPPS/PSY/PDS氨基酸序列的差异，选取SwissProt和PDB数据库中经实验验证蛋白功能的酶氨基酸序列进行blast比对（表1）。比较序列分析显示，R12与其最近的系统发育亲缘种之间的序列保守性有限（所有情况下序列相似性<50%）。具体而言，R12的GGPPS/PSY/PDS与Thermus thermophilus HB8、Thermus thermophilus HB27和Paracoccus sp. N81106的序列相似性最高（分别为50%、47.78%和45.08%）。系统发育树证实了这些进化关系（图S1），表明R12的关键酶与其各自菌株的同源物具有最近的进化关系。
同源建模分别选择Thermus thermophilus来源的GGPPS（PDB:1WMW）、Enterococcus hirae ATCC 9790来源的PSY（PDB:5ivs）和Nonlabens dokdonensis DSW-6来源的γ-番茄红素脱氢酶（PDB:4REP）作为结构模板。所有预测模型均通过Verify 3D、ERRAT和ProQ算法进行了严格验证。评估分数（Verify 3D > 92%，ERRAT > 85%，ProQ > 5.0）表明模型质量可靠，具有正确的立体化学性质（图S2）。
对来自八个不同物种的GGPPS进行MEME分析，预测了三个保守基序（图S3），分别位于第68–85位（基序1）、86–119位（基序2）和202–214位（基序3）。NCBI CDD分析显示，基序1–2和基序3为富含天冬氨酸的区域，对镁离子配位至关重要，其中基序1–2促进Mg²⁺依赖性DMAPP/GPP/FPP结合，基序3介导Mg²⁺-IPP相互作用（表2）。同样，鉴定出PSY的三个保守基序（图S4和表2），基序1中含有包含底物-Mg²⁺结合位点（DXXXD）的富含天冬氨酸区域。此外，基序3含有两个不同的催化签名序列DDIVD和DVGED，与先前结果一致[33]。对于PDS，分析将NAD⁺结合位点定位到第21–85位残基（图S5）。基于上述预测结果，GGPPS和PSY可能需要Mg²⁺来激活催化位点，而PDS在催化过程中需要NAD⁺的参与。
多序列比对和系统发育树分析表明，与Deinococcus wulumuqiensis R12来源的GGPPS、PSY和PDS相似的蛋白序列很少，且所有序列一致性均低于50%。这表明对这些酶的研究报道很少，数据库中仅公开了它们来自不同来源的序列。这些关键酶的序列、结构及其系统发育关系尚未得到深入研究，导致对这三种关键酶的性质、结构和催化机制缺乏了解[3]。源自极端微生物属Deinococcus，这些新鉴定的酶可作为生产番茄红素等类胡萝卜素的新型生物催化元件[30,34,35]。此外，本研究通过生物信息学分析获得的三种关键类胡萝卜素生物合成酶的理化性质、保守结构域和系统发育关系，将为其结构和催化机制的研究提供参考。鉴定出的结构特征，特别是辅因子结合区域和底物相互作用基序，也为蛋白表达、纯化及后续无细胞代谢工程系统的构建提供了关键指导。
【数据】序列相似性：GGPPS vs T. thermophilus HB8为50%，PSY vs T. thermophilus HB27为47.78%，PDS vs Paracoccus sp. N81106为45.08%；模型验证分数：Verify 3D > 92%，ERRAT > 85%，ProQ > 5.0；保守基序位置：GGPPS基序1（68–85位）、基序2（86–119位）、基序3（202–214位）；PDS NAD⁺结合位点：第21–85位残基
3.2 GGPPS、PSY和PDS在重组*E. coli*菌株中的可溶表达
诱导和蛋白表达后，异源GGPPS和PDS在超声破碎和离心后的上清液中呈现 predominant 可溶表达，而PSY主要以包涵体形式存在于沉淀中，上清液中未见显著可溶表达（图S6）。鉴于PSY在番茄红素生物合成中的关键催化作用以及CFME系统对可溶蛋白的严格要求，我们开始系统优化表达参数，包括筛选替代表达载体、宿主和基因来源以实现PSY的可溶表达。
基于文献报道和上述多序列比较，选取了来自Deinococcus radiodurans R1（R1）、Pantoea ananatis（Pa）[11]、Pantoea agglomerans（Pag）[10]和Thermus thermophilus（The）[36]的crtB基因。将这些基因克隆到不同的表达质粒中，包括pET22b、pET28a、pGEX-6P、pTrc99a和pUC19，并分别转化到E. coli DH5α、BL21(DE3)、Rosetta(DE3)和MG1655中，共生成26个重组菌株（图S7）。重组蛋白表达（表S4）显示，仅当Thermus thermophilus来源的crtB基因在E. coli BL21(DE3)中表达时，才产生大量可溶性目标蛋白（图S6d）。
PSY催化类胡萝卜素生物合成途径中的限速步骤[37]，主要在植物物种中被表征和表达，在原核宿主中实现功能性表达的成功案例有限[38,39]。尽管对诱导参数（诱导浓度、诱导温度和时间）进行了详尽优化，所有PSY同源物均未能在重组菌株的上清液中以可溶蛋白形式表达，而是在沉淀中形成无活性的包涵体（图S6和图S7），这与Iwata-Reuyl等人先前的报道一致[40]。PSY可溶表达受限可能源于其不稳定性和较高的蛋白周转率。此外，已知许多PSY同源物需要伴侣蛋白来维持其在质体内的稳定性和类胡萝卜素合成功能[41,42]。矛盾的是，尽管单独高水平过表达crtB不可能，但在E. coli和其他宿主中与其他关键基因共表达时，我们和他人先前的研究实现了番茄红素的产生[6,9,10,31]。
我们实现PSY可溶表达的努力包括将来自R12和其他细菌的crtB基因克隆到具有不同启动子、核糖体结合位点和质粒拷贝数的多种表达载体中。通过对14种表达载体和26种不同宿主-载体组合中的五个crtB直系同源物进行系统筛选（图S7），成功在BL21(DE3)中实现了Thermus thermophilus来源的crtB基因（ThecrtB）的可溶表达。这归因于Thermus thermophilus来源的PSY与R12来源的PSY具有最高的氨基酸序列一致性，并且在系统发育树中被归入同一分支，进化关系接近。
【数据】重组菌株数量：26个；表达载体：pET22b、pET28a、pGEX-6P、pTrc99a、pUC19；宿主菌：DH5α、BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、MG1655；可溶表达成功组合：ThecrtB/BL21(DE3)；crtB直系同源物数量：5个；载体配置：14种；宿主-载体组合：26种
3.3 纯化GGPPS、PSY和PDS的酶活性测定
基于纯化酶的CFME系统主要用于体外代谢途径的组装和潜在途径的探索。因此，单个纯化酶的活性是整个CFME系统成功的关键因素。重组细胞裂解获得粗提物，带标签的酶在镍-NTA柱上纯化（图S8）。如图S9所示，三个反应体系在30°C反应24小时后均表现出显著的显色变化，证实纯化酶保持了天然催化活性。这一生化验证证明了来自R12的GGPPS和PDS以及来自T. thermophilus的PSY的功能完整性，确立了它们在无细胞系统中模块化组装番茄红素合成途径的适用性。
目前没有针对这三种关键酶（GGPPS、PSY和PDS）的标准化活性测定方法。先前，这些活性是通过……
【数据】反应条件：30°C，24 h；纯化方法：镍-NTA柱；检测方法：显色反应观察
3.4 基于纯化酶的CFME系统优化
（图2展示了基于纯化酶和基于细胞粗提取物的CFME系统示意图。）
图3展示了基于纯化酶的CFME系统的优化过程。（A）反应时间优化；（B）底物浓度优化；（C）Tris-HCl缓冲液浓度优化；（D）Tris-HCl缓冲液pH优化；（E）Mg²⁺浓度优化；（F）其他参数优化。
【数据】原文未详述具体优化参数数值
3.5 基于粗细胞提取物的CFME系统优化
图4展示了基于粗细胞提取物的CFME系统优化。（A）酶浓度优化；（B）底物浓度优化；（C）反应温度和颜色变化；（D）酶比例和颜色变化；（E）其他参数优化。
【数据】原文未详述具体优化参数数值
3.6 优化前后番茄红素滴度比较
图5比较了优化前后的番茄红素滴度。基于纯化酶的CFME系统在优化后实现了10.74 mg/L的番茄红素产量，而基于粗细胞提取物的CFME系统在优化后实现了14.06 mg/L的产量。
【数据】纯化酶系统产量：10.74 mg/L；粗提物系统产量：14.06 mg/L；反应时间：24 h
讨论与解读
本研究对三种关键酶GGPPS、PSY和PDS进行了生物信息学分析和克隆。通过筛选PSY的来源，成功构建了能够大量可溶表达关键酶的重组菌株——GGPPS和PDS来自R12，PSY来自Thermus thermophilus。随后，通过混合三种纯化酶或混合含有三种表达酶的粗提取物，在无细胞系统中分别成功合成了番茄红素，产量分别为10.74 mg/L和14.06 mg/L。
虽然目前为番茄红素合成设计的CFME系统仍处于实验室阶段，但它更适合于体内代谢工程的模拟和优化。为后续尝试放大现有系统以及进一步改进和增强该系统，提出了以下潜在解决方案：首先，整合工程化异戊烯醇利用途径（IUP）可通过增加内源物质IPP和DMAPP的合成来规避前体限制。其次，将无细胞蛋白合成（CFPS）与现有CFME工作流程耦联，可消除重组菌株构建阶段。直接从线性DNA模板或PCR产物进行原位酶生产，可实现简化的标准化流程，将设计-构建-测试周期从数周压缩至数天。最后，通过支架技术对多酶进行空间组织……
编译者解读
本研究展示了无细胞代谢工程在类胡萝卜素合成中的独特价值——将复杂的多酶级联反应从细胞环境的干扰中解放出来，使各步骤可独立调控和优化。研究团队面对PSY可溶表达这一长期瓶颈，通过系统的宿主-载体筛选策略找到了来自Thermus thermophilus的功能替代酶，这一思路对合成生物学中"酶元件适配"问题具有方法论启示。CFME平台在快速酶筛选方面的应用潜力尤为突出——无需反复构建菌株即可测试不同酶组合，大幅缩短了设计-构建-测试循环周期。但需注意，目前14.06 mg/L的产量与工业需求仍有距离，前体供给和辅因子再生仍是限制无细胞系统放大生产的关键瓶颈。
参考来源
Chen, S. (2025). Construction and optimization of a cell-free metabolic engineering system for lycopene synthesis. Biochemical Engineering Journal, 2025. DOI: 10.1016/j.bej.2025.109849
DOI: 10.1016/j.bej.2025.109849