来源：Biogenic synthesis of silver nanoparticles using cell-free extracts of thermotolerant bacteria: Antioxidant and antibacterial properties（Electronic Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
银纳米颗粒（AgNPs）的绿色合成是纳米生物技术领域的研究热点。本研究利用三种耐热菌株——Bacillus haynesii CamB6、Pseudomonas alcaligenes Med1和Staphylococcus sp. BSP3的无细胞提取物，成功生物合成了三种银纳米颗粒（AgNP1、AgNP2、AgNP3）。通过UV-Vis、FTIR、TEM、DLS等多种手段表征发现，AgNP2和AgNP3粒径更小、胶体稳定性更强、生物活性更优。其中AgNP2表现最为突出：DPPH自由基清除率达65.18%（5 mg mL⁻¹），对P. putida的最低细菌存活率仅0.74%（1 mg mL⁻¹），抗菌效果超越第三代头孢菌素头孢噻肟。
研究背景
纳米技术已在医疗保健、环境科学和材料工程等领域带来显著进步。在各种纳米颗粒中，银纳米颗粒因其独特的理化性质——包括抗菌、抗氧化和催化活性——而备受关注。这些特性使AgNPs在药物递送系统、伤口敷料、生物传感器以及对抗抗菌素耐药性等方面不可或缺。
传统AgNPs合成常涉及高能耗的物理和化学方法，产生有害副产物，引发环境担忧。绿色合成方法利用植物、真菌和细菌等生物系统，成本低廉且环境可持续。然而，系统比较耐热菌提取物对纳米颗粒稳定性和生物功能影响的研究仍然有限。多数前期工作聚焦于植物或嗜温菌来源的纳米颗粒，往往缺乏详细的理化-生物学关联分析。本研究利用已知具有生物活性化合物生产能力的耐热菌株，填补了这一空白。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
三株耐热菌株——B. haynesii CamB6、P. alcaligenes Med1和Staphylococcus sp. BSP3——由研究团队此前从智利Maule地区温泉环境中分离，分别来自Campanario（35°56′23″ S 70°36′22″ W）、Medano（35°57′33″S 70°77′85″W）和San Pedro温泉（35°08′ 12″ S, 70°28′ 36″ W）。菌株在营养肉汤（NB，HiMedia，印度）中培养，P. alcaligenes和Staphylococcus sp.的最适生长温度为37°C，B. haynesii为50°C。需氧条件下，150 rpm连续振荡培养24 h。
【数据】培养基：营养肉汤（NB）；温度：37°C（P. alcaligenes、Staphylococcus sp.）/50°C（B. haynesii）；转速：150 rpm；时间：24h；培养条件：需氧
2.2 细菌无细胞提取物的制备
培养至稳定期后，细菌培养物在4°C下以5000 rpm离心15 min（Orto Alresa SKU ECE110，西班牙）分离细胞。上清液经0.22 µm膜过滤器过滤，确保去除残留细胞和碎片。所得无细胞提取物储存于4°C，直至用于纳米颗粒合成。
【数据】离心转速：5000 rpm；时间：15 min；温度：4°C；滤膜孔径：0.22 µm；储存温度：4°C
2.3 AgNPs的生物合成
以细菌无细胞提取物为底物、硝酸银（AgNO₃，HiMedia，印度）为前体进行AgNPs生物合成。配制10 mM AgNO₃水溶液，在无菌条件下与细菌无细胞提取物按1:1（v/v）混合。各反应混合物分别制备，于30°C（Labwit ZWY-2102C，澳大利亚）避光、150 rpm连续振荡孵育48 h。通过观察颜色从淡黄色变为棕色监测AgNPs合成，表明纳米颗粒形成。这些AgNPs用于评估银离子浓度和稳定性的影响。随后，胶体AgNP悬浮液经离心（8000 rpm，15 min，4°C）、洗涤、冻干，供后续使用。
【数据】AgNO₃浓度：10 mM；混合比例：1:1（v/v）；孵育温度：30°C；转速：150 rpm；时间：48h；条件：避光；离心：8000 rpm，15 min，4°C
2.4 AgNPs的表征
#### 2.4.1 光谱分析
使用紫外-可见分光光度计（Shimadzu UV-1800，日本）在300–500 nm波长范围扫描反应混合物，确认AgNPs的形成。观察到AgNPs特征性表面等离子体共振（SPR）峰，表明纳米颗粒合成成功。以蒸馏水为参照进行基线校正。所有研究均设三次重复。使用配备ATR附件（ATR 550 S，Jasco）的Jasco光谱仪（FT-IR 4600）获取生物合成AgNPs的傅里叶变换红外（FTIR）光谱。将100 µL胶体AgNPs悬浮液小心沉积在ATR晶体上，确保均匀覆盖以进行准确分析。光谱记录范围为400–4000 cm⁻¹。
【数据】UV-Vis扫描范围：300–500 nm；FTIR波数范围：400–4000 cm⁻¹；样品量：100 µL；重复次数：3次
#### 2.4.2 透射电子显微镜（TEM）分析
使用透射电子显微镜（TEM）（JEOL JSM 1200EX-II，日本）分析合成AgNPs的尺寸和形态。将冻干AgNPs重新悬浮于蒸馏水中制备悬浮液。取一滴悬浮液置于预涂碳膜的铜电子显微镜网格上，风干过夜后观察。拍摄高分辨率图像以评估AgNPs的粒径分布、形状均匀性和表面形态。从多个视野计算平均尺寸。所有研究均设三次重复。
【数据】仪器：JEOL JSM 1200EX-II；制样：铜网+碳膜，风干过夜；重复次数：3次
#### 2.4.3 动态光散射（DLS）
使用配备背散射检测（173°）的DLS分析仪（Malvern Zetasizer Nano ZS，英国）测量合成AgNPs的粒径分布、多分散指数（PDI）和zeta电位。测量在25°C下进行，散射角173°，使用一次性比色皿进行粒径和zeta电位分析（DTS1070，Malvern，英国）。每个样品测量三次，报告平均值和标准偏差以确保可重复性和准确性。
【数据】温度：25°C；散射角：173°；重复次数：3次
2.5 AgNPs的抗氧化活性
#### 2.5.1 DPPH自由基清除活性
按照Shimada等方法[40]稍作修改测定2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）的自由基清除活性（RSA）。将不同浓度的200 µL NPs水溶液（0.5、1、2和5 mg mL⁻¹）与20 µL（0.2 mM）DPPH乙醇溶液混合。混合物在30°C避光放置1 h，随后5000 rpm离心10 min。使用微孔板读数仪（Allsheng，Flex A-200，中国）在517 nm处测量上清液吸光度。使用[公式1]计算DPPH清除活性：(A-B)/A × 100，其中A为对照上清液吸光度，B为样品吸光度。
【数据】NPs浓度：0.5、1、2、5 mg mL⁻¹；DPPH浓度：0.2 mM；孵育温度：30°C；时间：1h；避光；离心：5000 rpm，10 min；检测波长：517 nm
#### 2.5.2 过氧化氢清除活性
采用Ruch等方法[41]的修改版本评估AgNPs的H₂O₂清除活性。在96孔微孔板中，将50 µL AgNP样品与120 µL磷酸盐缓冲液（0.1 mM，pH 7.4）和30 µL H₂O₂溶液混合。混合物在30°C避光孵育10 min。阳性对照和阴性对照分别使用100 µL 10 mM AgNO₃水溶液和100 µL NB培养基。此外，使用不含H₂O₂的样品测量基线吸光度。孵育后，使用紫外-可见微孔板读数仪（Allsheng，FlexA-200，中国）在约230 nm处测量吸光度。使用[公式2]计算抗氧化活性：(1-(A1-A2)/A0) × 100，其中A0为对照吸光度，A1为反应样品吸光度，A2为不含H₂O₂的样品吸光度。
【数据】样品量：50 µL；磷酸盐缓冲液：120 µL，0.1 mM，pH 7.4；H₂O₂溶液：30 µL；孵育温度：30°C；时间：10 min；避光；检测波长：约230 nm
2.6 AgNPs的抗菌活性
#### 2.6.1 琼脂孔扩散法
参照Chavez-Esquivel等方法[42]稍作修改，使用革兰氏阴性Pseudomonas putida（ATCC 12633）和革兰氏阳性Bacillus cereus（ATCC 14579）进行定性琼脂孔扩散实验。制备Mueller-Hinton琼脂（MH，HiMedia，印度）平板，每板接种100 µL新鲜细菌悬浮液（OD₅₉₀ = 0.1，约1 × 10⁸ CFU mL⁻¹），用无菌L形涂布器均匀涂布。接种物干燥后，用无菌打孔器在琼脂中打孔，每板三个孔。制备不含孔的对照板。AgNP样品分别以100 µL、200 µL和300 µL的体积加入孔中。使用20 µL第三代头孢菌素抗生素头孢噻肟作为阳性对照，因其对革兰氏阴性和部分革兰氏阳性菌具有广谱活性。使用20 µL AgNO₃（AgNPs的前体盐）作为阴性对照，以区分离子银与纳米颗粒形式的作用。实验重复三次。平板密封后在30°C孵育16 h（BJPX-Wichita，中国）。通过测量孔周围抑菌圈直径确定生长抑制。
【数据】菌株：P. putida ATCC 12633、B. cereus ATCC 14579；接种量：100 µL，OD₅₉₀=0.1（约1×10⁸ CFU mL⁻¹）；样品体积：100/200/300 µL；阳性对照：20 µL头孢噻肟；阴性对照：20 µL AgNO₃；孵育温度：30°C；时间：16h；重复次数：3次
#### 2.6.2 细菌细胞活力测定
为定量表达生物合成AgNPs的抗菌性能，评估了经AgNPs处理的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞的活力。在NB培养基中制备新鲜过夜稳定期（约1 × 10⁸ CFU mL⁻¹）P. putida和B. cereus培养物。将10 mL无菌LB培养基加入无菌Falcon管（50 mL）中，加入500 µL各细菌悬浮液。以四个终浓度向管中加入AgNPs：0.5 mg mL⁻¹、1 mg mL⁻¹、5 mg mL⁻¹和10 mg mL⁻¹。每种浓度对两种菌株均设三次重复。
【数据】菌株浓度：约1×10⁸ CFU mL⁻¹；LB培养基：10 mL；细菌悬浮液：500 µL；AgNPs终浓度：0.5、1、5、10 mg mL⁻¹；重复次数：3次
研究结果
3.1 AgNPs的表征
#### 3.1.1 光谱分析
使用UV-Vis光谱确认生物合成AgNPs的形成——这是分析纳米颗粒光学性质的标准技术。使用紫外-可见微孔板读数仪（FlexA-200，中国）在300–500 nm波长范围记录光谱。三种AgNP样品均在约450 nm处呈现特征性表面等离子体共振（SPR）峰（图S1），表明AgNPs成功形成，与此前报道一致。该区域吸收峰的出现对应于SPR现象的波长，证实了纳米颗粒合成[44,45]。
有趣的是，三种不同细菌菌株无细胞上清液合成的AgNPs之间观察到SPR峰强度的差异。Staphylococcus sp. BSP3合成的AgNP3的SPR峰强度最高，其次是P. alcaligenes Med1合成的AgNP2，B. haynesii CamB6合成的AgNP1强度最低。峰强度的差异表明纳米颗粒浓度、尺寸分布或稳定效率存在菌株间差异，与此前关于这些因素对AgNPs表面等离子体共振性质影响的研究一致[3,22]。
SPR峰附近的吸光度值接近0.8 A.U.。Gusrizal等[46]曾报道类似SPR峰吸光度值——他们使用间羟基苯甲酸在pH 11下以1.0 × 10⁻³ M和1.0 × 10⁻² M浓度还原AgNO₃，但AgNO₃浓度低66倍和50倍。这可能是因为培养基中银离子（Ag⁺）可用性较低——据报道这些离子会与培养基中的氯离子（Cl⁻）和磷酸根离子（PO₄³⁻）形成络合物。被包裹在这些高度不溶性（pKS = 9.8）络合物中的银对细菌膜和细胞壁的结合能力也极为有限[47,48]。此外，羟基苯甲酸（特别是4-羟基苯甲酸，4-HBA）是某些细菌通过莽草酸途径天然产生的，该途径通过将磷酸烯醇丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸转化为分支酸，是合成苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸的关键代谢途径[49,50]。
反应混合物从淡黄色变为红棕色的颜色变化进一步验证了Ag⁺还原为元素银（Ag⁰）。不含纳米颗粒的对照样品未出现SPR峰，确认观察到的吸收峰明确归因于生物合成的AgNPs。
生物合成银纳米颗粒（AgNP1、AgNP2和AgNP3）的FTIR光谱揭示了细菌无细胞上清液的不同官能团，可能参与还原、稳定化和封端过程（图1）。细菌上清液中羟基、酰胺、多糖和其他生物分子基团的存在，为细菌菌株特性在决定纳米颗粒稳定性和性质中的作用提供了见解。
在AgNPs中，约3410–3420 cm⁻¹处的OH/NH伸缩振动归因于羟基和胺基，表明存在醇、酚和蛋白质。此前已有报道羟基在还原银离子和稳定纳米颗粒中发挥关键作用[9,11,22]。约1630–1640 cm⁻¹处的C=O伸缩振动可能表明蛋白质或酰胺中的羰基作为封端剂，与Karthik等[51]和Sidhu等[52]的报道一致。约1060–1100 cm⁻¹处的C-O伸缩振动表明可能存在多糖，以C-O伸缩振动为代表，已知能在纳米颗粒周围形成空间位阻[9]。AgNP2在约1380 cm⁻¹处的CH/NO弯曲振动可能归因于增强纳米颗粒稳定性的次级代谢物或硝酸盐，如Ravindran等[13]所报道。最后，AgNP3在约620 cm⁻¹处的芳香族/卤化物变形表明细菌产生了独特的芳香族或卤化物基团，提示细菌菌株特异性生物分子相互作用增强了绿色纳米颗粒的稳定化[22]。
这些发现强调了细菌产生的生物分子（如羟基、酰胺和多糖基团）在AgNPs绿色合成中的还原、稳定化和封端过程中的重要作用。AgNP1、AgNP2和AgNP3之间官能团组成的差异强调了细菌菌株特异性生化特征对纳米颗粒性质（包括尺寸、稳定性和分散性）的影响。值得注意的是，AgNP3中芳香族或卤化物基团的独特贡献提示可能存在增强的稳定化机制，可能带来优异的胶体稳定性和功能性。
【数据】SPR峰位置：约450 nm；SPR吸光度：约0.8 A.U.；FTIR峰位：OH/NH约3410–3420 cm⁻¹；C=O约1630–1640 cm⁻¹；C-O约1060–1100 cm⁻¹；CH/NO约1380 cm⁻¹（AgNP2）；芳香族/卤化物约620 cm⁻¹（AgNP3）
#### 3.1.2 透射电子显微镜（TEM）分析
使用TEM（JEOL JSM 1200EX-II，日本）进一步分析生物合成AgNPs的尺寸、形态和分布。TEM图像显示纳米颗粒主要为球形，尺寸分布相对均匀（图2A–C）。基于TEM图像内手动标注测量确定平均粒径：Staphylococcus sp. BSP3 AgNP3：平均尺寸 = 8.40 ± 5.21 nm；P. alcaligenes Med1 AgNP2：平均尺寸 = 10.78 ± 6.40 nm；B. haynesii CamB6 AgNP1：平均尺寸 = 20.82 ± 12.56 nm。
使用Staphylococcus sp. BSP3无细胞上清液合成的AgNP3粒径最小，也表现出最高的SPR峰强度，将纳米颗粒尺寸与光学性质相关联。相比之下，B. haynesii CamB6产生的AgNP1颗粒较大，与UV-Vis分析中观察到的较低SPR强度一致。TEM图像证实纳米颗粒相对单分散，聚集极少，表明细菌无细胞上清液中的生物分子有效稳定了纳米颗粒。
进一步详细研究不同细菌无细胞上清液合成NPs的形态后发现，AgNP1具有球形颗粒以及明显的三角形和棒状NPs。AgNP2主要为球形，但偶尔观察到不规则形状。AgNP3主要为球形。值得强调的是，使用Staphylococcus sp. BSP3合成的AgNP3表现出最均匀的尺寸分布和形状，这可能解释了UV-Vis分析中观察到的较高SPR峰强度。关于异质性，AgNP1在形状和尺寸上表现出最大变异性，观察到球形、三角形和棒状颗粒。清晰光滑的表面形态表明还原和封端过程均匀[13]。
这些发现强调了细菌菌株特性对合成AgNPs尺寸和形态的影响，直接影响其物理和生物学性质。此前，Saeed等[53]报道了利用土壤来源的大肠杆菌、Exiguobacterium aurantiacum和Brevundimonas diminuta生物合成AgNPs，尺寸范围为5至50 nm，表明不同细菌菌株可能影响AgNPs的合成和特性。
【数据】AgNP3平均粒径：8.40 ± 5.21 nm；AgNP2平均粒径：10.78 ± 6.40 nm；AgNP1平均粒径：20.82 ± 12.56 nm；形态：AgNP1球形+三角形+棒状；AgNP2主要为球形+少量不规则；AgNP3主要为球形
#### 3.1.3 动态光散射（DLS）
对生物合成的AgNPs进行了粒径分布、多分散指数（PDI）和zeta电位分析。DLS测量结果与TEM观察到的尺寸趋势一致，进一步证实了不同细菌菌株合成的纳米颗粒在胶体性质上的差异。zeta电位分析提供了关于纳米颗粒表面电荷和胶体稳定性的关键信息，较高的表面电荷通常与增强的胶体稳定性相关。这些表征结果共同表明，菌株选择对纳米颗粒的物理化学性质具有决定性影响。
【数据】原文未详述DLS具体数值
讨论与解读
本研究利用三株耐热菌株的无细胞提取物成功生物合成了具有抗氧化和抗菌活性的银纳米颗粒。表征结果显示，AgNP2粒径最小、胶体稳定性最高、球形形态最均匀。FTIR光谱证实了羟基和酰胺等官能团的存在，支持细菌生物分子（如蛋白质、酚类和多糖）参与纳米颗粒的还原和稳定化。生物学评价表明，三种AgNPs均表现出抗氧化活性，其中AgNP2和AgNP3的自由基清除能力更强。在抗菌实验中，AgNP2和AgNP3显著降低了细菌活力，对P. putida和B. cereus的效果均优于头孢噻肟。AgNP2抗菌活性最高，可能归因于其较小的粒径、均匀的形状和较高的表面电荷，这些因素共同增强了与细菌膜的相互作用并促进ROS介导的损伤。本研究证明耐热菌株为合成具有良好抗氧化和抗菌性能的生物活性AgNPs提供了稳健且环保的平台。然而，缺乏对哺乳动物细胞的细胞毒性评估仍是本研究的局限。
编译者解读
本研究的方法选择颇具巧思——利用耐热菌的无细胞提取物而非活细胞进行纳米合成，既规避了细胞代谢的复杂性干扰，又保留了菌株特异性生物分子的还原与封端能力。三种菌株平行对比的设计让"菌株决定纳米颗粒命运"这一核心论点有了直接证据链。AgNP2在粒径、稳定性和生物活性上的全面优势，提示合成生物学中"菌株筛选-产物性能"的关联值得更系统挖掘。不过，DLS数据在原文中未给出具体数值，且缺乏哺乳细胞毒性数据，距离实际生物医学应用仍有距离。后续若能将菌株代谢组与纳米颗粒性能做关联分析，将更具预测价值。
参考来源
Banerjee A, Herrera-Vargas I, Flores ME, et al. Biogenic synthesis of silver nanoparticles using cell-free extracts of thermotolerant bacteria: Antioxidant and antibacterial properties. Electronic Journal of Biotechnology 2026:79. DOI: 10.1016/j.ejbt.2025.100698.
DOI: 10.1016/j.ejbt.2025.100698