来源：Nucleic acid detection via protein readout through Cas-controlled gating of cell-free protein synthesis（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
CRISPR-Cas系统的附带切割活性已被广泛用于核酸检测，但传统荧光报告基团读出方式受限于背景信号和检测维度。本研究提出CRIVER平台，将Cas13a/Cas12a的靶标识别转化为可编程的蛋白质输出信号。通过化学修饰的核酸前体实现位点选择性切割，该平台可在单一工作流程中同时完成属水平和种水平鉴定，对炭疽芽孢杆菌16S rRNA检测限达10 fM，对双链DNA靶标检测限达0.1 pM。
研究背景
病原体核酸检测对于传染病控制、食品安全监测和生物防御至关重要。虽然PCR和等温扩增方法具有优异灵敏度，但通常需要专业仪器或多步骤操作，增加了检测复杂性和成本。基于CRISPR的核酸检测利用Cas核酸酶的附带切割活性，DETECTR和SHERLOCK等平台采用荧光-淬灭基团标记的短核酸报告子将切割事件转化为荧光信号。然而，荧光报告方式在多重检测和信号放大方面存在局限。本研究旨在建立一种将CRISPR靶标识别与无细胞蛋白合成偶联的模块化平台，通过蛋白质输出实现灵敏的双通道核酸检测。
研究方法
2.1 实验材料
ATP、GTP、UTP、CTP、磷酸肌酸、肌酸激酶及大肠杆菌MRE600总tRNA混合物购自Roche Applied Science。修饰寡核苷酸和PCR引物由Macrogen合成。双链DNA片段、crRNA及来源于Lachnospiraceae bacterium ND2006的Cas12蛋白购自Integrated DNA Technologies。本研究所用寡核苷酸序列（包括触发DNA、报告子和前体构建体）列于表S1。Leptotrichia wadei Cas13a蛋白购自BPS Bioscience。Phusion U Hot Start DNA聚合酶和SYBR Gold核酸凝胶染料购自Thermo Fisher Scientific。大肠杆菌DNA聚合酶I（Pol I）、尿嘧啶特异性切除试剂（USER）、T4多核苷酸激酶（T4 PNK）及TOPcloner PCR克隆试剂盒购自Enzynomics。dNTP混合物购自New England Biolabs。Nano-Glo荧光素酶（NLuc）检测试剂盒、RiboMAX大规模RNA生产系统-T7及PCR纯化试剂盒购自Promega。NucleoSpin质粒试剂盒和RNeasy RNA纯化试剂盒分别购自Macherey-Nagel和Qiagen。96孔微板购自SPL Life Sciences。枯草芽孢杆菌菌株购自韩国典型菌种保藏中心（KCTC，编号KCTC1034）。其余试剂购自Sigma-Aldrich，未经进一步纯化直接使用。
【数据】试剂来源：Roche、Macrogen、IDT、BPS Bioscience、Thermo Fisher、Enzynomics、NEB、Promega、Macherey-Nagel、Qiagen、SPL、KCTC、Sigma-Aldrich；菌株：B. subtilis KCTC1034
2.2 无细胞蛋白合成模板DNA的制备
不完整表达盒的设计原理是：触发DNA与位于单链T7启动子上游的触发结合位点（TBS）退火后，启动体外蛋白合成。编码sfGFP、NanoLuc或mCherry的报告基因表达盒通过将各报告基因插入T7启动子缺失的pK7骨架（pK7/dT7P-sfGFP、pK7/dT7P-NLuc和pK7/dT7P-mCherry）构建。不完整表达盒采用USER辅助单链暴露工作流程制备。具体而言，PCR扩增使用含dU残基的正向引物，dU位置设计为选择性去除TBS和T7启动子区域的（+）链。USER处理产生单链、可触发访问的区域，同时保留表达盒的其余部分。USER处理的PCR产物用PCR纯化试剂盒纯化，−20°C保存备用。
【数据】模板制备方法：USER辅助单链暴露；储存温度：−20°C；报告基因：sfGFP、NanoLuc、mCherry
2.3 靶标核酸的制备
靶标ssRNA。 包含T7启动子的合成双链DNA片段对应炭疽芽孢杆菌（AB592486.1）、苏云金芽孢杆菌（NR_043403.1）、枯草芽孢杆菌（MH145363.1）、大肠杆菌BL21(DE3)（AM946981.2）、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032（NR_041817.1）和Vibrio natrigens Vmax（NZ_CP185778.1）的16S rRNA序列，以gBlocks形式获得。RNA使用RiboMAX大规模RNA生产系统-T7转录。转录后，反应物用DNase I处理（每μg DNA 1 U，37°C，15分钟），RNA用RNeasy试剂盒纯化。RNA浓度通过紫外-可见分光光度计测定A260确定。
靶标dsDNA。 对应炭疽芽孢杆菌capB基因和志贺毒素相关ecf1基因的合成dsDNA片段以gBlocks形式获得，按照制造商说明书用TOPcloner克隆至pTOP载体。质粒通过热激转化（42°C，60秒）导入化学感受态大肠杆菌DH5α，在Luria–Bertani（LB）培养基中37°C恢复1小时，涂布于含氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB琼脂平板。菌落通过菌落PCR筛选并经Sanger测序验证。确认的克隆在含氨苄青霉素的LB中培养，质粒用NucleoSpin质粒试剂盒纯化。DNA浓度经分光光度法测定，作为后续测定的dsDNA靶标。
【数据】DNase I处理：1 U/μg DNA，37°C，15min；热激转化：42°C，60s；恢复培养：37°C，1h；氨苄青霉素浓度：100 μg/mL；靶标基因：capB、ecf1
2.4 荧光-淬灭基团（FQ）报告基因测定
Cas核酸酶-crRNA复合物的附带切割活性使用标准FQ报告子评估。除非另有说明，反应体系（10 μL）含25 nM Cas核酸酶、100 nM对应crRNA和10 nM靶标RNA或dsDNA，缓冲液为1×核酸酶特异性反应缓冲液（Cas12a：40 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、10 mM NaCl、2 mM亚精胺，pH 7.5；Cas13a：20 mM HEPES、5 mM MgCl₂、50 mM KCl、0.1 mg/mL BSA，pH 7.0）。FQ报告子为5′-FAM和3′-BHQ标记的短寡核苷酸，Cas13a测定使用poly-U序列，Cas12a测定使用AT富集基序。Cas13a和Cas12a的crRNA分别使用ADAPT和CHOPCHOP设计。候选crRNA在核酸酶特异性约束下设计（Cas12a：5′-TTTV-3′ PAM邻近间隔序列），并筛选以最小化与非靶标序列的潜在交叉反应。每个靶标的多个候选crRNA在匹配条件下用FQ报告子测定进行实验筛选，正文中使用的crRNA根据信噪比和可重复性选择。所有crRNA的间隔序列和结合序列列于表S5。Cas12a直接重复序列遵循Alt-R L.b. Cas12a设计，Cas13a直接重复序列为5′-gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac-3′。反应在37°C孵育，去淬灭荧光在CFX96仪器上实时监测，采集间隔30秒。切割性能从荧光曲线的初始10分钟斜率评估。
【数据】反应体积：10 μL；Cas核酸酶浓度：25 nM；crRNA浓度：100 nM；靶标浓度：10 nM；Cas12a缓冲液：40 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、10 mM NaCl、2 mM亚精胺，pH 7.5；Cas13a缓冲液：20 mM HEPES、5 mM MgCl₂、50 mM KCl、0.1 mg/mL BSA，pH 7.0；温度：37°C；监测间隔：30s；评估窗口：初始10min
2.5 CRIVER测定
CRIVER测定分两个连续阶段进行：（i）通过Cas-crRNA复合物的附带切割产生触发子；（ii）在无细胞表达系统中进行触发子依赖性报告蛋白合成。
触发子产生。 反应体系（10 μL）含25 nM Cas核酸酶（Cas13a或Cas12a）、100 nM对应crRNA、50 nM各前体、靶标RNA或dsDNA及1×核酸酶特异性反应缓冲液。对于Cas13a-based反应，额外添加0.5 U/μL T4 PNK以确保磷酸化依赖性引物能力。触发子产生反应在37°C孵育30分钟。
报告蛋白合成。 切割后，取3 μL处理后的反应液转移至15 μL无细胞表达混合物中，该混合物含57 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、1.2 mM ATP、0.85 mM各CTP/GTP/UTP、2 mM DL-二硫苏糖醇、0.17 mg/mL大肠杆菌总tRNA混合物（MRE600）、0.64 mM cAMP、90 mM谷氨酸钾、80 mM乙酸铵、12 mM乙酸镁、34 μg/mL l-5-甲酰-5,6,7,8-四氢叶酸、1.5 mM各20种氨基酸、67 mM磷酸肌酸、3.2 μg/mL肌酸激酶、0.2 U/μL大肠杆菌DNA聚合酶I、0.25 mM dNTPs、26%（v/v）由大肠杆菌BL21Star(DE3)菌株制备的S12提取物，以及2 nM编码sfGFP、NanoLuc或mCherry的不完整表达盒（T7启动子上游含单链TBS）。反应在37°C孵育30分钟。对于分离报告步骤的实验，合成触发DNA或前体DNA直接添加以替代已处理的触发子产生反应。
Dual-CRIVER测定。 Cas13a-和Cas12a-based触发子产生反应分别如上进行，然后合并为单个报告反应，其中包含两个不完整表达盒（各2 nM），每个表达盒带有与其对应前体匹配的TBS。
【数据】触发产生：Cas核酸酶25 nM、crRNA 100 nM、前体50 nM、37°C、30min；T4 PNK：0.5 U/μL；报告合成：3 μL切割产物+15 μL无细胞体系；HEPES-KOH 57 mM pH 7.5、ATP 1.2 mM、CTP/GTP/UTP各0.85 mM、DTT 2 mM、tRNA 0.17 mg/mL、cAMP 0.64 mM、谷氨酸钾90 mM、乙酸铵80 mM、乙酸镁12 mM、亚叶酸34 μg/mL、氨基酸各1.5 mM、磷酸肌酸67 mM、肌酸激酶3.2 μg/mL、Pol I 0.2 U/μL、dNTPs 0.25 mM、S12提取物26%、表达盒2 nM；孵育：37°C、30min
2.6 裂解液基质中样品的CRIVER测定
苏云金芽孢杆菌和大肠杆菌BL21(DE3)菌株在LB培养基中37°C过夜培养。取50 μL各过夜培养物接种至5 mL新鲜LB培养基，培养至OD600 = 1.0，然后进行10⁶倍系列稀释。
【数据】培养温度：37°C；接种量：50 μL/5 mL；收获OD600：1.0；稀释倍数：10⁶倍系列稀释
研究结果
3.1 利用Cas13a将16S rRNA识别转化为蛋白质输出
我们首先利用Cas13a附带切割产生DNA触发子，该触发子与部分单链表达盒退火，从而实现对16S rRNA检测的蛋白质读出。如前所述，这种表达盒可作为生物执行器，在存在互补DNA触发子时启动无细胞蛋白合成。在该表达盒中，包含T7启动子的5′区域为单链，因此模板本身不会被T7 RNA聚合酶转录。加入DNA触发子后，触发子与单链启动子突出端（TBS）退火，无细胞反应中的内源DNA聚合酶以触发子为引物延伸，表达盒转化为双链模板，从而能够进行转录及后续编码蛋白的翻译。我们将CRISPR靶标识别、Cas13a核酸酶活性和无细胞合成介导的程序化蛋白质生产整合为模块化识别-蛋白质工作流程，命名为CRIVER（Cas-regulated in vitro expression of reporters），并使用炭疽芽孢杆菌的核酸标记物进行评估。
我们首先使用标准RNA FQ报告子筛选针对炭疽芽孢杆菌16S rRNA多个位点的crRNA。所有crRNA均产生时间依赖性信号，但多个crRNA也表现出靶标非依赖性附带活性，产生较高背景。我们选择crRNA3用于最小背景和相当的靶标切割，并优化了crRNA和Cas13a浓度。
在标准FQ条件下建立高效Cas13a附带切割后，我们进一步探究其是否能够支持蛋白质读出的触发子产生。前期工作表明，激活的Cas13a可以处理DNA触发子-RNA-DNA杂交体，使RNA片段被切割后留下能够引导下游光-up RNA适配体转录的DNA链。基于此逻辑，我们最初制备了DNAtrigger–RNA–DNA前体，其RNA片段将被Cas13a切割，产生的DNA触发子预期在后续无细胞反应中门控sfGFP表达。然而，无论是否存在靶标，均出现强烈的sfGFP荧光。由于无细胞反应使用粗制S12提取物，我们推断外切酶活性从前体上修剪了RNA-DNA尾部，产生可作为引物的DNA 3′-末端。为减轻这种靶标非依赖性加工，我们在前体3′-末端掺入硫代磷酸酯（PS）键（DNAtrigger-RNA-PSDNA）。该修饰阻止了核酸水解修剪，并在无靶标时消除了背景表达。在这种DNAtrigger–RNA–PSDNA构型中，DNA触发子的释放仅在含靶标的Cas13a反应中发生，而无靶标RNA时背景表达显著抑制。我们仅在存在靶标16S rRNA时成功检测到强sfGFP荧光。
使用优化的DNAtrigger–RNA–PSDNA前体作为Cas13a底物，CRIVER仅在16S rRNA存在时产生报告蛋白。我们进一步优化平台，包括优化T4多核苷酸激酶（将2′,3′-环磷酸末端转化为3′-羟基）和前体浓度以最大化信噪比。为增强切割效率，RNA片段采用串联U序列。Cas13a激活时，串联U RNA片段被高效切割，释放启动报告蛋白合成的DNA触发子。U片段长度变化实验表明，在我们的条件下，三个尿苷（rU3）在最小背景下提供最高信号。
使用优化的DNAtrigger–rU3–PSDNA前体，以NanoLuc荧光素酶作为报告子时，16S rRNA的检测限达到10 fM。值得注意的是，在FQ测定中产生高背景的crRNA（如crRNA2和crRNA4）与DNAtrigger–RNA–PSDNA前体配对时，在CRIVER测定中未产生显著背景，同时保持相当的靶标信号。这表明CRIVER比传统FQ测定更能耐受crRNA依赖性、靶标非依赖性附带活性，可能是因为我们前体中的短RNA片段（不到典型6–8 nt FQ报告子长度的一半）不易受到弱靶标非依赖性Cas13a活性的影响。
我们随后将优化条件应用于检测多种微生物的16S rRNA靶标。对每种生物，最初设计三个crRNA并使用FQ报告子检查信噪比。使用这些crRNA，CRIVER以高特异性准确检测了相应的16S rRNA序列。以大肠杆菌为例，尽管所有测试的crRNA在FQ测定中均表现出显著高背景，但CRIVER测定能够以显著降低的背景检测靶标16S rRNA，产生高信噪比。这一结果再次证明CRIVER平台可以在统一测定框架内轻松适应多种微生物属的区分。
尽管16S rRNA的某些区域具有足够的差异以实现种水平区分——如炭疽芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌之间——但这种分辨率在属内成员间并不普遍。基于16S rRNA的系统发育分析显示，枯草芽孢杆菌与炭疽芽孢杆菌之间的进化距离显著较大（约93.19%同一性），而炭疽芽孢杆菌与苏云金芽孢杆菌几乎相同（约99.69%同一性），这与它们的高序列同源性一致。因此，虽然可以轻松设计crRNA选择性靶向枯草芽孢杆菌，但16S rRNA内不存在可区分炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的靶向区域。尽管高变结构域理论上可提供种特异性特征，但这种变异在未表征的现场分离株中通常极小或不可预测，使得理性引导选择困难。因此，在复杂或未知样本中进行可靠的物种鉴定时，需要采用额外的种水平生物标志物，而非仅依赖16S rRNA。
【数据】最佳crRNA：crRNA3；最佳U片段长度：rU3；16S rRNA检测限：10 fM（NanoLuc报告子）；B. subtilis与B. anthracis 16S rRNA同一性：≈93.19%；B. anthracis与B. thuringiensis 16S rRNA同一性：≈99.69%
3.2 通过化学编程报告子赋予Cas12a附带切割位点选择性
在利用RNA通道建立16S rRNA属水平检测后，我们接下来通过编程Cas12a附带切割的位点选择性，使CRIVER适配种特异性基因组标记物。与选择性降解RNA、因此可以通过含RNA前体以最少序列工程释放DNA触发子的Cas13a不同，Cas12a对ssDNA报告子表现出无差别的反式切割活性。为避免随机消化并产生确定性触发子，我们设计了化学编程报告子，将Cas12a切割限制在预定位点。
前期工作表明，附带活性对天然磷酸二酯（PO）键的ssDNA高度允许，但对带有某些骨架或糖修饰的底物显著降低。特别是，PS键和修饰核苷（如锁核酸（LNA）或2′-O-甲氧乙基（2′MOE））抑制Cas12a切割，这一效应归因于RuvC活性位点与可切割磷酸二酯键的结合受损。使用序列相同的FQ报告子，PS修饰的FQ报告子未产生可检测的荧光信号，证实PS修饰有效阻断Cas12a切割。
基于这一观察，我们设计了化学编程ssDNA前体，其中短PO片段嵌入PS修饰骨架中。前体总长度为36 nt，包含22 nt的触发子序列和14 nt的间隔序列，两侧为PS修饰区域。Cas12a切割PO岛内的特定磷酸二酯键，释放具有3′-羟基的22 nt触发子片段。通过将Cas12a触发子产生与NanoLuc报告的无细胞表达偶联，CRIVER能够以高灵敏度检测双链DNA靶标。使用炭疽芽孢杆菌capB基因作为模型靶标，CRIVER在存在靶标dsDNA时产生强NanoLuc信号，而无靶标时背景极低。
【数据】前体长度：36 nt（22 nt触发子+14 nt间隔序列）；PS修饰阻断Cas12a切割；Cas12a检测dsDNA靶标
3.3 Dual-CRIVER实现同时属水平检测和种水平区分
为同时实现属水平和种水平鉴定，我们建立了Dual-CRIVER工作流程。Cas13a和Cas12a触发子产生反应分别进行，然后合并为单个报告反应，其中包含两个不完整表达盒，分别编码sfGFP和NanoLuc（或mCherry），各带与其对应前体匹配的TBS。Cas13a通道检测16S rRNA（属水平标记），Cas12a通道检测种特异性基因组标记（如炭疽芽孢杆菌的capB或大肠杆菌的ecf1）。
在缓冲液条件下，Dual-CRIVER能够同时检测16S rRNA和dsDNA靶标。当仅存在16S rRNA时，仅sfGFP表达；当仅存在dsDNA时，仅NanoLuc表达；当两者均存在时，两种报告蛋白均表达。使用炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌裂解液验证了Dual-CRIVER区分致病菌株与非致病近缘菌株的能力。在含有炭疽芽孢杆菌裂解液（含16S rRNA和capB基因）的样本中，sfGFP和NanoLuc均产生信号；而在含有苏云金芽孢杆菌裂解液（仅含16S rRNA，不含capB）的样本中，仅sfGFP产生信号。同样，使用含或不含志贺毒素相关ecf1基因的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，Dual-CRIVER仅通过sfGFP信号区分ecf1阴性菌株，而通过sfGFP和mCherry双信号识别ecf1阳性菌株。
【数据】Dual-CRIVER双通道：Cas13a（16S rRNA）+Cas12a（capB/ecf1）；报告蛋白：sfGFP（属水平）+NanoLuc/mCherry（种水平）；裂解液验证：B. anthracis、B. thuringiensis、E. coli BL21(DE3)±ecf1
讨论与解读
CRIVER平台的核心优势在于将CRISPR靶标识别转化为蛋白质输出，突破了传统荧光报告子的局限。通过化学编程前体——在PS修饰骨架中嵌入短PO片段——实现了对Cas12a无差别附带切割的位点选择性控制，这是本研究的突出创新点。Cas13a通道采用DNAtrigger–RNA–PSDNA前体，利用PS修饰阻止外切酶修剪产生的非特异性背景，同时保持靶标依赖性触发子释放。Dual-CRIVER格式实现了单管反应中属水平和种水平标志物的同时检测，对致病菌株与非致病近缘菌株的直接区分能力在裂解液基质中得到验证。
编译者解读： 从合成生物学应用角度看，CRIVER的模块化设计值得关注——将核酸识别与蛋白质输出解耦，意味着报告蛋白的种类可以按需替换，为多指标联检提供了灵活架构。PS修饰策略巧妙解决了Cas12a切割随机性的问题，这一化学编程思路可推广至其他Cas效应蛋白。但需指出，当前检测依赖无细胞提取物，成本与稳定性仍是实际应用的门槛；此外，对临床或环境样本的复杂基质耐受性尚需更多验证。未来若能与核酸扩增技术整合，或将进一步拓展其灵敏度边界。
参考来源
Park, Y.J. (2026). Nucleic acid detection via protein readout through Cas-controlled gating of cell-free protein synthesis. Biosensors and Bioelectronics. DOI: 10.1016/j.bios.2026.118514
DOI: 10.1016/j.bios.2026.118514