来源：Lycopene pathway rewiring by combinatorial co-expression of constituent enzymes in a cell-free protein synthesis system（New Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
代谢途径重构通常依赖设计-构建-测试-学习循环，但传统细胞系统迭代慢、调控复杂。本研究建立了一种基于大肠杆菌粗提物的无细胞蛋白合成平台，以模块化DNA模板浓度作为定量输入，通过五种酶的共表达在体外直接重构番茄红素生物合成途径。结合比色法高通量检测与混合主动学习策略，研究者在有限实验轮次内筛选出高性能乃至简化的途径配置，为代谢途径在进入细胞前的快速原型化提供了实用方案。
研究背景
代谢在所有活细胞中呈现为信息与酶催化反应交织的复杂网络。合成生物学的一个重要方向是对既有代谢途径进行“解连”与“重连”，以提升性能或产生新代谢物。由于代谢高度依赖蛋白质功能，途径重连需要使用异源或合成来源的蛋白质及其表达调控元件。这一过程通常通过设计-构建-测试-学习循环的迭代来实现。无细胞蛋白合成系统因其速度快、对毒性产物积累不敏感、代谢调控较宽松等优势，被提议作为加速设计-构建-测试-学习循环的使能工具，在候选途径最终导入合适宿主或人工细胞系统之前进行原型验证。
无细胞蛋白合成系统原则上分为两类：基于粗细胞裂解液的传统系统与由纯化元件组成的重构系统。纯化系统虽不受代谢调控干扰，但粗裂解液系统中的宿主代谢被部分解连，能在一定程度上模拟细胞环境。本研究采用粗提物系统，以模块化DNA模板为输入，探索五种番茄红素合成酶的共表达策略。
研究方法
DNA模板制备
本研究使用的所有序列见支持信息中的序列信息部分。简言之，所有模板由三个片段组成——基因特异性N片段、目标基因和通用C片段。N片段制备时，首先将引物Ncore.F69与Ncore.R53互为模板退火，随后使用含启动子的正向引物T7WT.F63和含BCD的基因特异性反向引物BCD2_gene.R63进行PCR扩增。目标基因编码区使用指定引物在标准PCR条件下从定制合成基因扩增。反向引物含有GSVSGWRLFKKIS部分序列（HiBiT标签序列以下划线标示），用于与C片段的HiFi DNA组装反应。
四个番茄来源的Idi同源物从使用BLASTP对NCBI非冗余蛋白数据库进行默认参数搜索得到的候选序列中随机选取，最低序列一致性为60%。类似地，针对IspA、CrtE、CrtB和CrtI，以标准组合（大肠杆菌IspA，成团泛菌CrtE、CrtB、CrtI）为参照，各鉴定了5个同源酶序列用于本研究。所选同源物的来源包括：Idi来自非洲栽培稻、茜草、拟南芥；IspA来自肠道沙门氏菌、产气克雷伯菌、农舍布丘菌、萼景天杆菌；CrtE来自皮尔逊卡拉米氏菌、Nissabacter sp. SGAir 0207、杨树盐单胞菌、哈奇兰德斯瓦尼亚菌；CrtB来自Siphoviridae sp.、皮尔逊卡拉米氏菌、Rouxiella chamberiensis、兼性勒克莱尔菌；CrtI来自欧文氏菌9145、兼性勒克莱尔菌、斯图泽假单胞菌、泡囊短波单胞菌。
通用C片段经定制合成克隆至pUC18载体中，使用引物Cfrg.F15和Cfrg.R20扩增。胶纯化的DNA片段使用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒组装，再用引物Amp.F47和M13F进行PCR扩增。所有PCR反应使用nPfu Forte DNA聚合酶（Enzynomics，韩国）。扩增后的线性DNA模板在需要时进行胶纯化，并使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）进行纯化以备无细胞蛋白合成反应使用。纯化后使用配备μ-drop板的SmartSpec Plus分光光度计（Bio-Rad）测量各DNA模板浓度。
【数据】PCR酶：nPfu Forte DNA聚合酶；组装试剂盒：NEBuilder HiFi DNA assembly kit；纯化试剂盒：QIAquick PCR Purification Kit；同源物筛选：BLASTP默认参数，最低序列一致性60%；仪器：SmartSpec Plus分光光度计（Bio-Rad）
无细胞蛋白合成
无细胞蛋白合成反应参照先前报道的方法并作微小修改。典型35 μL反应包含：57 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、1.5 mM ATP和GTP、0.9 mM CTP和UTP、12 mM乙酸镁、90 mM谷氨酸钾、80 mM乙酸铵、1.8 mM二硫苏糖醇、0.13 mM 1,5-甲酰-5,6,7,8-四氢叶酸、60 mM磷酸肌酸、20种蛋白氨基酸各2.5 mM、2%聚乙二醇8000、6.9 mg/mL肌酸激酶、16.7% v/v S12裂解液。BL21star(DE3)细胞的S12裂解液按前述文献方法制备。所有反应在1.7 mL微量离心管中于25°C孵育16小时。
无细胞合成的蛋白质通过Western blot分析，使用抗HiBiT抗体（Promega）作为一抗、辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG抗体（Abcam）作为二抗，蛋白在Tris-tricine缓冲液系统的十二烷基硫酸钠-丙烯酰胺凝胶电泳中分离。使用FastGene Western ECL试剂盒（Nippon Genetics Europe）产生的化学发光信号通过安装Image Lab软件（Bio-Rad）的ChemiDoc XRS+记录和分析。分析可溶组分时，无细胞蛋白合成反应在4°C下以13000 rpm（相当于15928 ×g）离心10分钟。可溶组分的化学发光信号与总无细胞反应比较，以计算溶解度百分比。
【数据】反应体积：35 μL；HEPES-KOH：57 mM（pH 7.5）；ATP/GTP：1.5 mM；CTP/UTP：0.9 mM；乙酸镁：12 mM；谷氨酸钾：90 mM；乙酸铵：80 mM；二硫苏糖醇：1.8 mM；1,5-甲酰-5,6,7,8-四氢叶酸：0.13 mM；磷酸肌酸：60 mM；氨基酸：各2.5 mM；PEG 8000：2%；肌酸激酶：6.9 mg/mL；S12裂解液：16.7% v/v；孵育：25°C，16h；离心：13000 rpm（15928×g），10 min，4°C
利用无细胞合成酶进行番茄红素生物合成
番茄红素生物合成反应（50 μL）使用30 μL无细胞蛋白合成混合物，在含有22.8 mM Tris-HCl（pH 8.0）、4 mM氯化镁、4 mM氯化锰、2 mM ATP、0.8 mM NADP、0.1 mM FAD、0.3 mM IPP、0.3 mM FPP（如注明）和6 mM脂质体的体系中进行。脂质体制备方法见前述文献。反应在30°C、200 rpm振荡条件下孵育4小时。
孵育后，将40 μL番茄红素反应混合物加入96孔板（Corning，产品编号3690）。使用安装目标遮罩（CM-A146）的CM 2600d分光光度计（Konica Minolta）测量每孔的“a”值，并通过SpectraMagic NX软件记录。所有比色测量均在透明96孔板中、环境实验室光照下进行，以减少测量间的时间差——这导致了原始读数的逐日波动。因此，不使用绝对a值来量化途径输出，而是设计了一个相对标度：将无DNA引物样品和0.25 nM标准DNA组合（Sl_idi、Ec_ispA、Pa_crtE、Pa_crtB、Pa_crtI）的读数分别设为0和1。无DNA对照和标准组合样品包含在所有实验组中，使得不同测定板的途径输出可以在该相对标度上呈现和比较。以公式表示，相对番茄红素效价=（目标途径−无DNA对照）/（标准组合−无DNA对照）。
为定量无细胞构建途径合成的番茄红素，部分反应使用甲醇与氯仿的混合物（体积比2:1）进行萃取，方法如前报道。简言之，番茄红素合成反应完成后，50 μL样品在4°C下以12000×g离心10分钟。疏水性番茄红素与其他不溶性组分一起沉淀为颗粒，随后在间歇振荡下溶于甲醇:氯仿中5分钟。短暂离心后，将上清转移至新管中，真空干燥至橙红色残渣。该残渣进一步通过分光光度法或高效液相色谱分析。分光光度分析时，残渣重新溶于200 μL十二烷中，短暂离心后取120 μL溶液转移至96孔板，使用SmartSpec Plus分光光度计（Bio-Rad）在472 nm处测量吸光度。番茄红素效价根据Beer-Lambert定律确定，假设番茄红素在十二烷中472 nm处的摩尔消光系数为186,000 M⁻¹cm⁻¹。考虑光程（0.702 cm，按制造商手册）和番茄红素分子量（536 g/mol），使用以下公式计算提取物中番茄红素浓度（mg/L）：A₄₇₂/(186 mM⁻¹cm⁻¹) × 536 g/mol / 0.702 cm。
为鉴定反应中产生的番茄红素，提取残渣重新溶于丙酮，按前述方法通过HPLC分析。Zorbax SB-C18（Agilent Technologies）为固定相，乙腈与甲醇的1:1（v/v）混合物为流动相，流动相中含9 μM三乙胺，等度洗脱。柱温保持在50°C，检测波长为472 nm。市售番茄红素（Merck，75051）溶于丙酮后用分光光度计定量，用作标准品。
【数据】反应体积：50 μL；Tris-HCl：22.8 mM（pH 8.0）；MgCl₂：4 mM；MnCl₂：4 mM；ATP：2 mM；NADP：0.8 mM；FAD：0.1 mM；IPP：0.3 mM；FPP：0.3 mM；脂质体：6 mM；孵育：30°C，4h，200 rpm；离心：12000×g，10min，4°C；检测波长：472 nm；消光系数：186,000 M⁻¹cm⁻¹；光程：0.702 cm；分子量：536 g/mol；HPLC柱温：50°C
HAL评分的公式化
HAL评分的公式化旨在使具有高HAL评分的输入组合在主动学习过程中对训练人工智能模型集成更有信息量。如下所示，该公式同时考虑了距离基和不确定性基的查询策略。
研究结果
以DNA模板为输入设计和构建无细胞番茄红素途径
本研究选择以异戊烯基焦磷酸（IPP）为起始原料构建番茄红素合成途径作为概念验证，因为IPP在大肠杆菌中可通过内源MEP途径或非内源甲羟戊酸/异戊烯醇利用途径天然合成。如图1A所示，从IPP到番茄红素的典型途径包含5种酶：异戊烯基焦磷酸:二甲基烯丙基焦磷酸异构酶（Idi）、法尼基焦磷酸合酶（IspA）、香叶基香叶基焦磷酸合酶（GGPPS；CrtE）、八氢番茄红素合酶（PSY；CrtB）和八氢番茄红素脱饱和酶（PDS；CrtI）。
我们此前已构建了一个体外番茄红素合成系统，利用无细胞合成的4种酶（IspA、CrtE、CrtB和CrtI），实现了从香叶基焦磷酸（GPP）和IPP出发的途径的初步优化，采用了混合搭配策略。在该工作中，我们单独或组合地增加或减少特定酶的浓度，以观察改变酶比例对途径性能（番茄红素效价）的影响。将一种同源酶替换为另一种同源酶也同样被用于证明代谢途径的混合搭配优化是可行的。类似地，纯化的关键酶（CrtE、CrtB和CrtI）或含有过表达酶的裂解液以不同比例组合，用于优化从法尼基焦磷酸（FPP）和IPP合成番茄红素的途径。
尽管这些方法直观且易于设计和执行，但混合裂解液无法描述这些酶的表达模式，尤其是当它们需要共表达时。作为替代方案，我们在单一无细胞反应中同时表达5种酶，通过混合DNA模板而非纯化酶或富含酶的裂解液来构建多个独特途径。这也可以称为无细胞途径表达。模块化模板制备策略被设计为以DNA为输入，以最少的工作量实现代谢途径的多样化（图1B）。模板由四个部分组成：T7启动子、基于双顺反子设计的核糖体结合位点（BCD）、目标基因以及C端标签序列后的T7终止子。所有部分设计为顺序重叠，可组装成完整片段。该设计还允许通过组合更换启动子或BCD来调节转录或翻译强度——即使对单一基因种类也是如此。这在概念上实现了“一个模板对应一个基因，具有可变（且可能确定的）表达水平”。然而，使用后一种设计进行多条途径的原型化需要构建太多模板，即使在完全体外使用PCR和Gibson型组装进行模板制备，也需要大量工作。因此，本研究固定启动子和BCD为野生型T7启动子和BCD2——已知它们具有可靠的强表达性能；转而通过改变模板量来调节每个蛋白质的无细胞表达水平。
我们首先探究DNA模板浓度是否可作为简单定量手段来调节CFPS系统中的蛋白质合成水平。以超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）为测试案例，以一系列输入浓度从PCR扩增模板表达sfGFP，并随时间监测其合成（图2A）。在本CFPS系统中，0.5 nM模板使sfGFP产量达到饱和，而1 nM模板进一步提高了初始表达速率——这预计会强烈影响多基因共表达时对共享转录-翻译资源的竞争。由于0.1 nM模板在6小时后产生的sfGFP表达量约为最大值的50%，0.1至1 nM之间的模板剂量可用于覆盖实际的表达强度动态范围。基于这些结果，我们任意定义了五个离散的DNA输入水平（0、0.1、0.25、0.5和1 nM），分别代表零、低、中、高和非常高的表达水平，并将其作为后续组合共表达实验的标准化输入。
将此校准扩展到途径酶，我们以相同的五个模板剂量引发CFPS反应表达Pa_CrtE、Pa_CrtB和Pa_CrtI，所得表达水平定性随输入模板浓度变化（图2B）。基于这些结果，我们通过在CFPS系统中共表达所有组成酶来构建番茄红素途径，以DNA模板及其剂量作为设计变量。
使用比色法相对定量番茄红素以测试途径性能
在确定DNA模板浓度可以受控方式调节表达水平后，我们接下来探究这一输入手段是否可直接用于从共表达的途径酶构建功能性番茄红素模块。为验证这一概念，我们在单一CFPS反应中共表达了三个基因Pa_crtE、Pa_crtB和Pa_crtI，并添加IPP和FPP作为底物，以重构从FPP出发的下游番茄红素途径（图1A）。该crt基因组合此前已被证明在大肠杆菌中比来自菠萝泛菌的相应基因在有无idi共表达的情况下表现更稳健，因此可作为进一步修饰的良好参考点。
在此条件下，反应混合物变为橙红色，而无DNA的CFPS对照因FAD保持黄色（图3A）。氯仿:甲醇萃取后进行光谱分析，确认了特征性的番茄红素吸收光谱，与先前报道一致。HPLC进一步确认了系统中番茄红素的成功合成，其保留时间与标准品相同（图3B）。这些结果表明，从混合DNA模板的组合共表达足以在体外组装功能性多酶途径，无需单独表达的酶。
然而，基于萃取的定量工作流程涉及多个操作步骤（离心、倾析、溶剂蒸发和重新溶解），不适合筛选大量条件。由于番茄红素合成反应的必要组分脂质体引起光散射，直接光谱法无法应用。根据经验，比色法受浊度影响较小，可在L×a×b色彩空间中报告样品颜色——其中正“a”值表示样品比空白更红。因此，我们评估了比色测量的“a”值是否可作为番茄红素效价的相对代理指标而无须萃取。将番茄红素生产样品用无DNA对照进行系列稀释，结果显示“a”值与稀释因子之间存在线性关系（图S2）。然而，a值受多个因素显著影响，包括脂质体和CFPS组分批次、实验室光照条件以及实验者技能，这使得难以使用绝对a值作为度量标准。
基于这些结果，我们定义了一个相对番茄红素标度：将无DNA对照设为0，将由Sl_idi、Ec_ispA、Pa_crtE、Pa_crtB和Pa_crtI各0.25 nM构建的“标准途径”设为1。标准途径中的同源物根据先前大肠杆菌番茄红素合成研究的报道选择。使用300 μM IPP测得的标准途径效价为0.11 mg/L，显著低于先前使用GPP和IPP（7.72 mg/L）或FPP和IPP（14.06 mg/L）的结果。需要指出的是，前述工作构建的番茄红素途径仅包含4种酶或使用纯化酶/富酶裂解液，而非5酶共表达系统。
DNA模板剂量和酶同源物对番茄红素产量的影响
在建立相对定量方法后，我们系统考察了DNA模板剂量对番茄红素产量的影响。在IPP和FPP同时存在的情况下，对Idi、IspA、CrtE、CrtB和CrtI的不同同源物分别改变DNA输入水平，结果显示番茄红素产量对酶同一性和模板剂量均高度敏感（图4A）。标准组合中，各酶的最近剂量并非一致——某些酶在低剂量时表现最佳，而另一些则需要高剂量。这一现象反映了资源竞争、裂解液中的内源酶活性以及蛋白质溶解度等多重因素的共同作用。
在仅提供IPP而不提供外源FPP的条件下，部分同源物组合仍能产生番茄红素，表明大肠杆菌裂解液中的内源FPP合成活性足以支撑途径通量（图4B）。然而，不同同源物在此条件下的表现差异更为显著，提示内源代谢物供给对异源途径的支撑能力有限。单因素逐一替换实验揭示了基本设计规则，例如在特定底物条件下某些步骤的冗余性，以及过表达某些酶（如Hp_CrtE和La_CrtI）的负面影响。但同时也凸显了实验设计相对于实际共表达设计空间的偏倚——逐一替换仅覆盖了极小部分组合空间。
混合主动学习提高替代模型在番茄红素数据上的性能
鉴于组合设计空间巨大，传统单因素实验难以全面探索，我们开发了混合主动学习工作流，将基于距离和基于不确定性的查询策略相结合，以高效探索组合空间。以标准组合和若干高性能组合作为初始标记数据，HAL策略在每轮主动学习中选择信息量最大的候选组合进行实验验证，并将其纳入训练集更新替代模型。
如图6A所示，与基于METIS的策略相比，HAL策略在主动学习轮次（R0–R5）中表现出更快的R²收敛速度。经过6轮主动学习后，HAL训练的替代模型对番茄红素效价的预测R²达到0.86，而METIS策略仅为0.71。这一结果表明，HAL策略能够从有限的标记数据中更有效地学习途径设计空间的结构，从而指导后续的逆向设计。
HAL引导的逆向设计与局部优化
利用HAL训练的替代模型，我们进行了逆向设计——以目标产量区间为约束，从模型预测中筛选候选DNA组合。将预测值与实测值对比，结果显示模型预测与实验测量之间存在良好的一致性（图7A）。在模型推荐的高性能组合中，组合25表现尤为突出，其番茄红素效价达到标准组合的3.2倍。值得注意的是，HAL推荐的若干高性能组合采用了简化的途径配置——例如省略了Idi或IspA的表达，表明在特定底物供给条件下，部分酶步骤并非必需。
局部优化实验进一步验证了HAL引导的精细调整能力。在HAL推荐的高性能组合基础上，对个别酶的模板剂量进行微调，部分调整进一步提升了番茄红素产量。这些结果表明，无细胞共表达结合HAL可以作为代谢途径设计和完善的实用平台，在途径导入细胞之前实现快速优化。
讨论与解读
本研究建立了一个基于大肠杆菌粗提物的无细胞蛋白合成平台，以模块化DNA模板为定量输入，实现番茄红素途径五种组成酶的组合共表达。通过校准模板浓度-表达关系并采用比色法作为相对输出指标，研究证明了途径性能对每个模板的同一性和剂量均高度敏感，反映了资源竞争、裂解液中的内源酶活性和表达酶的溶解度约束——这些效应无法通过传统的分步表达酶混合搭配策略捕获。DNA模板浓度由此成为简单的过程变量，比色法番茄红素读数成为适配中等通量的输出指标，使途径原型化可以被视为无细胞合成“面包板”上的输入-输出映射问题。
结构化的单因素实验揭示了关键定性规则，如特定底物条件下某些步骤的冗余性以及过表达某些酶（如Hp_CrtE和La_CrtI）的负面影响，但同时也凸显了实验设计相对于实际不可行的大规模共表达设计空间的偏倚。为此开发的HAL工作流结合了基于距离和基于不确定性的查询策略，从有偏的标记数据出发高效探索庞大组合空间。HAL在收敛速度和最终模型性能上均优于对照策略，其推荐的简化途径配置表明，无细胞共表达与主动学习的结合可以在途径导入细胞之前实现快速的设计-构建-测试-学习迭代。
编译者解读
该研究的核心价值在于将途径工程从“先表达后混合”推进到“模板共表达即途径构建”的范式——DNA模板浓度成为唯一的输入变量，这大大简化了设计-构建-测试-学习循环的构建环节。结合比色法高通量读数和主动学习算法，研究展示了在有限实验预算内探索巨大组合空间的可行性。值得注意的是，HAL推荐的简化途径配置（省略部分酶）提示了代谢途径中可能存在的“多余”步骤——这种在传统细胞系统中难以发现的冗余性，正是无细胞系统的独特洞察力所在。未来若能将此平台扩展至更复杂途径并提升通量，有望成为细胞途径重构前的标准筛选工具。
DOI: 10.1016/j.nbt.2026.07.001