来源：A cell-free platform for the high-efficiency synthesis and screening of PET hydrolase（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
PET塑料的酶法回收依赖高性能PET水解酶，但传统筛选流程涉及质粒重组、细胞培养、蛋白纯化与HPLC分析，周期长达5天且成本高昂。本研究构建了一个微孔板兼容的无细胞系统（CFS）平台，将线性DNA模板介导的体外表达、H1标签/FlAsH-EDT2荧光原位定量与p-NPA比色活性检测集于一体。在3种天然PETase及16个变体上的验证表明，吸光度与荧光比值与酶比活力正相关，筛选周期缩短至24小时以内，成本降低60%。
研究背景
PET凭借优良的机械性能、热稳定性和化学耐受性，广泛用于纺织、食品包装和生物医学领域，但大量消耗也带来资源枯竭与环境污染。酶法回收利用微生物水解酶（如IsPETase、LCC、TfCut2）将PET废物解聚为低聚物或单体，再聚合为再生PET。然而，PETase降解活性偏低制约了工业化进程。理性设计与AI驱动的酶工程结合高通量筛选成为改造PETase的有效策略。传统筛选流程需经历质粒重组、转化与克隆挑选、细胞培养与诱导表达、细胞裂解等繁琐步骤，效率低下。无细胞系统天然支持线性DNA模板的转录翻译，且无需蛋白纯化即可直接定量与测活，为加速PETase筛选提供了新可能。
研究方法
2.1 线性DNA模板的构建
含H1标签的重组质粒（pET28a-H1）由实验室前期构建。使用引物pET28a-H1-F/R对质粒进行线性化，通过PCR扩增在PETase基因和载体两端引入15 bp同源臂。随后，利用PrimeSTAR® Max DNA聚合酶（Takara Bio，Cat# R045Q）通过Gibson assembly将PETase基因克隆至pET28a-H1。用于CFS表达的线性DNA模板（表S2）以重组质粒为模板，使用引物pET28a-n-F/R（n = 0∼250 bp）和Taq Max DNA聚合酶（Novozymes，Cat# P213–01）扩增获得。PCR条件为：95°C初始变性3 min；35个循环的变性（95°C，30 s）、退火（59°C，30 s）和延伸（72°C，98 s）；最后72°C延伸5 min。扩增产物使用CW2301M凝胶/PCR提取试剂盒（CoWin Biosciences）纯化，但该步骤非必需。所有寡核苷酸引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，列于表S1。
【数据】同源臂长度：15 bp；PCR循环数：35；变性温度/时间：95°C/30s；退火温度/时间：59°C/30s；延伸温度/时间：72°C/98s；初始变性：95°C/3min；最终延伸：72°C/5min
2.2 细胞裂解液的制备
大肠杆菌BL21(DE3)菌株在20 mL 2×YT + P培养基（16 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl、40 mM K2HPO4和22 mM KH2PO4）中，37°C、250 rpm振荡培养14–16小时。取4 mL过夜培养物转接至2 L挡板摇瓶中的400 mL新鲜2×YT + P培养基，相同条件下培养至OD600为0.7–0.8。加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mM诱导T7 RNA聚合酶表达，37°C继续培养2小时（OD600达到3–3.5）。细胞在5500g、4°C离心10 min收获，重悬于冰冷蔗糖溶液（20%，w/v）。冰上孵育10 min后，相同条件再次离心。沉淀用冰冷ddH2O洗涤3次，按1 g细胞加1 mL S30缓冲液的比例重悬于冰冷S30缓冲液（含2 mM二硫苏糖醇）。随后，悬浮液进行超声破碎，参数为2 s脉冲加3 s间隔，持续40 min。裂解液在29800g、4°C离心30 min澄清，上清分装后液氮速冻，−80°C保存。
【数据】培养基：2×YT+P（16 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl、40 mM K2HPO4、22 mM KH2PO4）；温度：37°C；转速：250 rpm；培养时间：14–16h；IPTG浓度：0.5 mM；诱导时间：2h；OD600：0.7–0.8（诱导前）/3–3.5（诱导后）；离心：5500g/10min/4°C、29800g/30min/4°C；蔗糖浓度：20%（w/v）；超声：2s脉冲/3s间隔/40min
2.3 CFS平台合成与筛选PETase的反应体系与流程
FlAsH-EDT2（4,5-双(1,3,2-二硫砷环戊烷-2-基)荧光素，阿拉丁，Cat# F332805）溶于DMSO至500 μM，−20°C保存。FlAsH-EDT2与β-巯基乙醇的混合液在PBS缓冲液中配制，使用前室温孵育15 min。CFS反应液组成：4 μL澄清细胞裂解液、6.75 μL补充液（1.5 mM ATP/GTP、0.9 mM UTP/CTP、0.06 mM亚叶酸、0.2 mg/mL tRNA、0.33 mM NAD、0.27 mM辅酶A、1 mM亚精胺、20 mM谷氨酸镁、10 mM谷氨酸铵、175 mM谷氨酸钾、2 mM氨基酸混合物（19种标准氨基酸，不含谷氨酸）、66.6 mM磷酸烯醇丙酮酸（PEP）、1.874 μL 20%（w/v）PEG8000）、300 ng线性DNA模板。剩余体积用无核酸酶ddH2O补至15 μL，并加入1 μL上述FlAsH-EDT2染料溶液。CFS反应在黑色壁384孔微孔板中进行，用光学透明粘合膜密封以减少蒸发，30°C、250 rpm连续水平振荡孵育。当PETase充分表达后（约12 h），微孔板转移至Feyond-F100荧光微孔板读数仪（奥盛，中国）进行蛋白定量。在485 nm激发下检测530 nm处的荧光强度（F）。酶活测定时，将4-硝基苯乙酸酯（pNP-A）溶于乙腈至100 mM。随后，向透明96孔板中加入89 μL PBS（100 mM，pH 7.0）、1 μL CFS反应液和10 μL p-NPA溶液。平板在30°C孵育13 min，在FlexA−200HT微孔板读数仪（奥盛，中国）上检测405 nm处吸光度（A）。
【数据】FlAsH-EDT2浓度：500 μM（DMSO储存）；孵育条件：室温/15min；CFS体系：4μL裂解液+6.75μL补充液+300ng线性DNA+1μL染料，总体积15μL；ATP/GTP：1.5mM；UTP/CTP：0.9mM；亚叶酸：0.06mM；tRNA：0.2mg/mL；NAD：0.33mM；辅酶A：0.27mM；亚精胺：1mM；谷氨酸镁：20mM；谷氨酸铵：10mM；谷氨酸钾：175mM；氨基酸混合物：2mM；PEP：66.6mM；PEG8000：20%（w/v）1.874μL；反应温度/时间：30°C/约12h；转速：250rpm；荧光检测：Ex 485nm/Em 530nm；pNP-A浓度：100mM（乙腈溶解）；酶活体系：89μL PBS（100mM，pH7.0）+1μL CFS反应液+10μL p-NPA；酶活反应：30°C/13min；吸光度检测：405nm
研究结果
3.1 CFS合成与筛选PETase平台的建立
为实现PETase变体的高效合成与筛选，我们开发了一个基于微孔板的CFS平台，将无细胞蛋白合成与无需蛋白纯化的直接定量相结合，随后进行简单的酶活测定。如图1所示，将H1标签融合至目标基因后，PETase的C端形成一个小螺旋结构，该结构对FlAsH染料（FlAsH-EDT2）具有特异性结合亲和力，可在485 nm激发下通过监测530 nm处的荧光发射（F）实时检测蛋白产量。CFS反应和原位蛋白定量在黑色壁384孔微孔板中进行。随后，含PETase的CFS混合液直接转移至透明微孔板中，利用p-NPA底物评估PETase的水解活性——产生的p-NP在405 nm处有易于检测的吸光度（A）。为消除不同变体间蛋白产量的差异，比活力（催化活性与酶浓度的比值）通常被用作酶筛选的指标。因此，该平台可行性的关键在于证明F/A比值与酶的比活力呈正相关。
【数据】荧光检测：Ex 485nm/Em 530nm；吸光度检测：405nm；底物：p-NPA
3.2 PETase的合成与定量
在无细胞系统中，DNA模板的选择对蛋白表达有显著影响。CFS系统的一个显著优势是其天然支持线性DNA模板的转录翻译。为评估模板依赖性表达效率，我们构建了胞内蛋白表达常用的质粒载体（pET28a和pET22b）及其线性化对应物（图2A、B）。虽然该工作流程中不需要蛋白纯化，标签序列（6×His、凝血酶位点和T7标签）可以省略，但我们仍保留标签序列，以便筛选后将线性模板整合回常规质粒。为减轻线性DNA的降解，我们采取了保护策略——在T7启动子上游和T7终止子下游保留一段非翻译序列。通过含有不同长度保护区的线性模板表达mCherry和eGFP（图S1A、B），结果表明保护区长度的增加与目标蛋白产量呈正相关。当保护序列长度超过50 bp时，最终蛋白产量显著提高。这归因于非转录区的存在，在一定程度上抵消了核酸酶对核心转录区的降解。本研究采用含250 bp保护区的线性DNA模板进行CFS反应，并与相应质粒载体进行了比较（图S1C、D）。结果显示，质粒模板的蛋白产量显著低于线性模板。这是因为在相同核酸质量下，线性模板提供的目标基因拷贝数高于质粒。此外，pET28a/pET22b载体的骨架含有冗余基因（如LacI和抗性基因），消耗了CFS中部分可用资源。相比之下，线性模板可将有限资源分配至目标蛋白的生产。因此，最终选用含250 bp保护区的线性28模板用于CFS中PETase的合成。
虽然许多蛋白定量方法可与无细胞系统兼容，包括放射性氨基酸掺入、FluoroTect™标记、荧光蛋白融合或split-GFP融合等，但考虑到CFS中酶筛选的实际实施，这些方法存在成本高或可能抑制酶活性等问题。利用FlAsH-EDT2染料与富含半胱氨酸蛋白结合产生绿色荧光的特性，我们将H1标签——一个含4个半胱氨酸的12残基小螺旋——融合至三种PETase（LCC、IsPETase、TfCut2）的C端。体内表达和HPLC分析验证了H1标签的融合不影响这些PETase的催化功能（图2C）。随后，编码IsPETase-H1、LCC-H1和TfCut2-H1的线性DNA在含FlAsH-EDT2的CFS中分别表达。如图2D所示，SDS-PAGE图像确认了CFS中目标蛋白的产生。值得注意的是，这些目标蛋白在蓝光透射仪（470 nm）下无需任何染色处理即可清晰可见，支持了目标蛋白的荧光分析。CFS溶液的实时荧光分析（激发：485 nm，发射：530 nm）显示，IsPETase-H1表达系统在孵育过程中表现出明显的信号增强，而IsPETase表达系统与空白对照（不添加任何DNA模板）的信号强度相同（图2E）。初始3小时内，荧光强度快速增加，表明目标蛋白的快速合成。然而，3小时后上升趋势逐渐减缓，这与CFS反应液早期转录翻译资源丰富、后期资源受限的事实相符。这些结果表明H1标签/FlAsH-EDT2策略可用于CFS中原位蛋白定量。值得注意的是，空白对照中的高背景荧光归因于FlAsH-EDT2与内源性H1样基序的非特异性结合，提示需要进一步优化以提高信噪比。
β-巯基乙醇（β-ME）可通过竞争性结合和还原稳定机制抑制FlAsH-EDT2与内源蛋白之间的非特异性相互作用。为提高信噪比，对FlAsH-EDT2和β-ME浓度进行了协同优化（图3A、B）。结果表明，随着FlAsH-EDT2添加量的增加，背景荧光（F空白）升高，而信号荧光（F）随β-ME的添加而改善（图3A）。可以推测，过量的β-ME阻碍了H1标签与FlAsH-EDT2的结合，导致信号减弱，而β-ME不足则无法抑制背景荧光。当FlAsH-EDT2为15 μM、β-ME为4 mM时，信噪比（F/F空白）达到最大（图3B）。为验证蛋白定量的可行性，分别通过荧光法和BCA法测定了不同产量的CFS反应，两者呈现高度线性相关（图3C）。此外，对于不同目标蛋白（LCC、IsPETase和TfCut2），荧光信号（F-F空白）/F空白与蛋白浓度之间的系数表现出显著的一致性。这表明荧光信号可以方便地用于代表CFS中PETase的浓度。
【数据】保护区长度的最优值：>50bp后产量显著增加；实际使用：250bp；H1标签：12残基小螺旋/4个半胱氨酸；蓝光透射：470nm；荧光检测：Ex 485nm/Em 530nm；信号快速上升期：初始3h；FlAsH-EDT2最优浓度：15μM；β-ME最优浓度：4mM；定量验证：荧光法 vs BCA法呈高度线性相关
3.3 PETase的活性测定
在建立了CFS中PETase定量方法后，我们旨在开发一种活性测定方法，通过直接利用CFS反应液实现快速酶筛选。由于CFS体系含有复杂的内源基质，且用于酶表达的反应液体积小（15 μL CFS混合物可产生0.5–1.5 μg酶），直接利用CFS溶液降解PET薄膜或粉末几乎无法检测，使活性评估不便。因此，我们使用了BHE（原文此处截断，后续内容未提供）。
【数据】CFS产酶量：0.5–1.5 μg/15μL体系（原文未详述后续BHE方法细节）
讨论与解读
本研究构建了一个微孔板兼容的CFS平台，通过整合线性模板介导的无细胞蛋白表达、H1标签/FlAsH-EDT2荧光策略的原位蛋白定量以及p-NPA底物的比色活性测定，实现了PETase的高效合成与筛选。在条件优化后，该平台可便捷地估算PETase的比活力。对天然PETase和嵌合变体的测试验证了平台的有效性：CFS平台获得的比活力与常规体内表达和HPLC分析的结果高度一致。更重要的是，该平台将筛选周期从5天缩短至不到24小时，成本降低了60%。这一快速、经济的平台有助于加速PETase的工程改造，且可推广至其他工业酶的筛选——只需更换酶活测定所用的显色底物即可。
编译者解读：该研究的核心价值在于将"表达-定量-测活"三个环节压缩至一个无细胞反应中完成，绕开了传统酶工程筛选中耗时费力的克隆与纯化步骤。线性DNA模板直接作为表达元件、荧光原位定量免去蛋白纯化、比色法直接读取活性——三步串联形成了真正的"样本进、数据出"式筛选流水线。60%的成本削减和5天到24小时的周期压缩，意味着在相同资源下可筛选的变体数量大幅提升，这恰好对接了AI辅助酶设计对高通量实验验证的迫切需求。值得关注的是，平台对多种PETase（IsPETase、LCC、TfCut2）的普适性验证，为其扩展至其他水解酶家族奠定了基础。局限在于，p-NPA是模型底物而非PET本身，初筛阳性变体仍需通过真实PET降解实验复核。
参考来源
Fu C. A cell-free platform for the high-efficiency synthesis and screening of PET hydrolase. Journal of Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.05.012
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.05.012