来源：The secretory production of cutinase ICCG-A2 in Corynebacterium glutamicum using acetate as the sole carbon source（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
利用粮食生物质作为发酵碳源引发可持续性担忧，乙酸盐因来源广泛、成本低廉而成为备受关注的替代碳源。本研究在谷氨酸棒状杆菌中构建了以高浓度乙酸盐为唯一碳源分泌表达角质酶ICCG-A2的工程平台，通过信号肽与启动子组合优化、渗透压抗性基因共表达及培养基配方调控，系统提升了酶产量。最终在1-L摇瓶水平，胞外酶活较125-mL摇瓶提升2.02倍，较葡萄糖碳源提升4.27倍，为乙酸盐基生物制造提供了可借鉴的工程策略。
研究背景
生物加工中以可食用生物质为碳源，引发对其长期影响全球粮食安全和可持续发展的担忧。为应对这一挑战，越来越多研究探索C1、C2化合物及合成气等可再生碳源作为生物生产的替代底物。乙酸盐是其中重要一员。技术评估表明，在CO₂衍生液体底物中，乙酸盐是通过碳捕集、利用与封存（CCUS）技术生产微生物蛋白时电力需求最低的底物之一。利用CO₂和H₂衍生的乙酸盐生产微生物蛋白，有望在2030年前实现碳负蛋白制造。与葡萄糖等常规碳源相比，乙酸盐具有来源丰富、成本低、可持续性好的优势，可通过低压甲醇羰基化、乙醛氧化或电化学等方法工业合成，也可作为微生物发酵的主要副产物，并能从农业废弃物、食品工业副产物和木质纤维素生物质等可再生资源中获取。
研究方法
菌株与质粒
本研究所用菌株和质粒列于表1。大肠杆菌DH5α作为质粒构建的宿主菌。谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032作为表达和工程改造的原始菌株。
【数据】菌株：E. coli DH5α、C. glutamicum ATCC 13032；原文未详述表1全部内容
质粒构建
编码ICCG-A2的基因（GenBank: USU85609.1）由GENEWIZ（中国苏州）进行基因合成，连接至pEC‑XK99E载体。pEC‑XK99E是一种蛋白质分泌表达质粒，携带H36启动子和来源于枯草芽孢杆菌168的脂肪酶EstA信号肽序列（estA），由此获得表达质粒pEC‑H36‑estA‑ICCGA2。其他表达质粒的构建方法见正文描述。所有质粒均使用来自ABclonal（中国武汉）的ClonExpress II One Step Cloning Kit通过Gibson组装法构建。本研究所用引物列于表S1。
【数据】合成基因：ICCG-A2（GenBank: USU85609.1）；载体：pEC‑XK99E；启动子：H36；信号肽：estA；组装方法：Gibson assembly
培养基与培养条件
大肠杆菌在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中于37°C、200 rpm条件下培养。氯霉素和卡那霉素的终浓度分别为30和50 μg/mL。
谷氨酸棒状杆菌常规在LBB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、10 g/L脑心浸液）或CGXII培养基（42 g/L MOPS、20 g/L (NH4)2SO4、5 g/L尿素、1 g/L KH2PO4、1 g/L KH2PO4、0.25 g/L MgSO4•7H2O、0.01 g/L MnSO4•H2O、0.01 g/L FeSO4•7H2O、0.01 g/L CaCl2、0.03 g/L原儿茶酸、1 mg/L ZnSO4•7H2O、0.2 g/L生物素、0.2 mg/L CuSO4、0.02 mg/L NiCl2•6H2O，pH 7.0）中于30°C、200 rpm条件下培养。某些实验中，CGXII培养基的组成按正文中的具体描述进行修改。氯霉素和卡那霉素的终浓度分别为10和25 μg/mL。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的终浓度为1 mM。
125-mL摇瓶发酵ICCG-A2时，转化子涂布于LBB平板，种子在2 mL LBB培养基中于30°C培养18 h。随后将种子培养物转入装有20 mL发酵培养基的摇瓶中，起始OD600为0.5。
1-L摇瓶发酵时，转化子涂布于LBB平板，种子在10 mL LBB培养基中于30°C培养18 h。随后将种子培养物转入装有200 mL发酵培养基的摇瓶中，起始OD600为0.5。
【数据】LB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl；E. coli培养温度：37°C；转速：200 rpm；氯霉素/卡那霉素（E. coli）：30/50 μg/mL；LBB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、10 g/L脑心浸液；CGXII培养基：42 g/L MOPS、20 g/L (NH4)2SO4、5 g/L尿素、1 g/L KH2PO4、0.25 g/L MgSO4•7H2O、0.01 g/L MnSO4•H2O、0.01 g/L FeSO4•7H2O、0.01 g/L CaCl2、0.03 g/L原儿茶酸、1 mg/L ZnSO4•7H2O、0.2 g/L生物素、0.2 mg/L CuSO4、0.02 mg/L NiCl2•6H2O、pH 7.0；C. glutamicum培养温度：30°C；转速：200 rpm；氯霉素/卡那霉素（C. glutamicum）：10/25 μg/mL；IPTG：1 mM；种子培养：30°C、18 h；接种起始OD600：0.5
摇瓶水平培养基优化
对于C/N比优化，在含60 g/L乙酸钠的CGXII培养基（CGXII+60 g/L NaAc）中，(NH4)2SO4浓度分别设置为2.50、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00和50.00 g/L，对应C/N摩尔比分别为23.20、11.60、5.80、2.90、1.90、1.50和0.90。以20 g/L为中心建立梯度，在较低浓度范围（2.50–10.00 g/L）和较高浓度范围（30–50 g/L）设置相同数量的增量。鉴于谷氨酸棒状杆菌以乙酸盐为唯一碳源生长时的最适C/N比处于相对较低的范围，较低浓度区域的增量设计得更密集，以便精确识别拐点。
对于离子浓度优化，建立了跨越100倍浓度范围的梯度。每种离子设置一个极度缺乏的浓度（0.10倍）和一个过高的浓度（10.00倍），在缺乏与过量水平之间再设置两个均匀间隔的浓度。最终，每种离子的浓度分别独立变化为其初始水平的0.10、0.33、0.67、1.00、3.30、6.70和10.00倍。
【数据】C/N比优化：(NH4)2SO4浓度2.50–50.00 g/L；C/N摩尔比0.90–23.20；离子优化范围：0.10–10.00倍初始浓度
SDS-PAGE与胞外酶活测定
对于胞外蛋白分析，细胞培养物以12,000 rpm离心2 min，收集上清液。预处理样品与5×SDS-PAGE上样缓冲液混合，100°C煮沸10 min，上样至12.5% SDS-PAGE凝胶。电泳后，凝胶用考马斯亮蓝G−250染色以显示蛋白条带。
ICCG-A2酶活测定方法如下：将4-硝基苯基棕榈酸酯溶于异丙醇，浓度为3.0 g/L。反应混合物含450 μL 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、25 μL培养上清液和25 μL底物溶液，于37°C孵育20 min，在405 nm处测定吸光度。ICCG-A2酶活的一个单位（U）定义为每分钟释放1 μmol对硝基苯酚所需的酶量。
【数据】离心：12,000 rpm、2 min；煮沸：100°C、10 min；SDS-PAGE凝胶浓度：12.5%；底物：4-硝基苯基棕榈酸酯（3.0 g/L溶于异丙醇）；反应体系：450 μL 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）+ 25 μL上清 + 25 μL底物；反应条件：37°C、20 min；检测波长：405 nm；酶活单位定义：1 U = 每分钟释放1 μmol对硝基苯酚
分析方法
细胞密度（OD₆₀₀）使用759S紫外-可见分光光度计（棱光，中国上海）在600 nm处测定吸光度获得。乙酸盐浓度使用配备Aminex HPX-87H离子交换柱（Bio-Rad，美国）的LC‑20AT高效液相色谱系统（岛津，日本）定量。流动相为5 mM H₂SO₄，流速0.5 mL/min，柱温40°C。使用RID-20A检测器（岛津，日本）在210 nm处检测。所有数据代表三次生物学重复的平均值±标准差。多组间比较采用单因素方差分析后进行Bonferroni事后检验。统计显著性标注为：n.s.表示无显著差异，表示P < 0.05，表示P < 0.01，表示P < 0.001。
【数据】OD600检测波长：600 nm；HPLC系统：LC-20AT（岛津）；色谱柱：Aminex HPX-87H；流动相：5 mM H₂SO₄；流速：0.5 mL/min；柱温：40°C；检测波长：210 nm；生物学重复：3次；显著性阈值：P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001
研究结果
以乙酸盐为唯一碳源的ICCG-A2分泌表达
为实现ICCG-A2的表达，通过电穿孔将表达质粒pEC‑H36‑estA‑ICCGA2和pEC-XK99E分别导入谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032，获得工程菌株Cg‑ICCG-A2及相应的对照菌株。工程菌株在摇瓶中用补充33 g/L葡萄糖或不同浓度乙酸钠作为唯一碳源的CGXII培养基进行培养。
如图1A所示，工程菌株在33 g/L葡萄糖或30 g/L乙酸钠条件下培养时，均在24 h内达到稳定期。谷氨酸棒状杆菌对低浓度乙酸盐表现出较高的耐受性，发酵时间未延长。然而，在含45 g/L、60 g/L或75 g/L乙酸钠的培养基中培养时，延滞期分别延长至12 h、24 h和60 h。当乙酸钠浓度为75 g/L至90 g/L时，细胞生长和底物消耗均受到严重限制（图1A和B）。高浓度乙酸盐延长了菌株的延滞期，部分原因是高浓度有机酸造成的环境胁迫。此外，碳源的突然转换常因细胞代谢网络重组而延长延滞期。在低于60 g/L的浓度下，培养基中的乙酸钠在细胞达到稳定期时已被完全消耗（图1B）。然而，当浓度超过45 g/L时，进一步增加乙酸钠浓度并未提高最大细胞密度。
发酵上清液的酶活测定（图1C-H）和SDS-PAGE分析（图S2）证实了ICCG-A2的成功表达。如图1D、E、G和H所示，不同实验组（33 g/L Glu、30 g/L NaAc、45 g/L NaAc、60 g/L NaAc）的最大细胞密度（OD600分别为72.63 ± 3.48、28.56 ± 0.41、48.29 ± 1.21和54.22 ± 1.44）和最大胞外酶活（分别为0.65 ± 0.01 U/mL、0.57 ± 0.01 U/mL、0.76 ± 0.03 U/mL和0.82 ± 0.05 U/mL）分别于24 h、24 h、60 h和72 h时观察到。这些结果表明ICCG-A2的表达与生长相关，缩短细胞进入稳定期所需的时间可能提高ICCG-A2的生产效率。
值得注意的是，45 g/L乙酸钠与33 g/L葡萄糖含有等摩尔量的碳。以45 g/L乙酸钠培养时，最大细胞密度和最大胞外酶活分别达到以33 g/L葡萄糖培养时的0.67倍和1.17倍（图1D和G）。尽管乙酸钠支撑的最终细胞密度低于葡萄糖，但胞外酶活略高。这可能归因于乙酸盐通过乙酰-CoA更高效地进入中心代谢，表明更有效的底物转化是使用乙酸盐作为碳源的优势之一。因此，在谷氨酸棒状杆菌中高产分泌生产ICCG-A2方面，乙酸盐比葡萄糖更具优势。
【数据】最大细胞密度（OD600）：72.63 ± 3.48（33 g/L Glu）、28.56 ± 0.41（30 g/L NaAc）、48.29 ± 1.21（45 g/L NaAc）、54.22 ± 1.44（60 g/L NaAc）；最大胞外酶活：0.65 ± 0.01 U/mL（33 g/L Glu）、0.57 ± 0.01 U/mL（30 g/L NaAc）、0.76 ± 0.03 U/mL（45 g/L NaAc）、0.82 ± 0.05 U/mL（60 g/L NaAc）；45 g/L NaAc vs 33 g/L Glu：细胞密度0.67倍、酶活1.17倍；延滞期：45 g/L NaAc为12 h、60 g/L NaAc为24 h、75 g/L NaAc为60 h
ICCG-A2分泌表达优化
为进一步提高以乙酸为碳源的培养条件下ICCG-A2的产量，我们优化了表达元件，包括信号肽和启动子筛选。
#### 信号肽筛选
除谷氨酸棒状杆菌常用的内源信号肽（如CspA、CspB）外，枯草芽孢杆菌的信号肽文库也被证明是增强该宿主蛋白分泌的合适选择。为提高ICCG-A2的分泌表达，选取了11个来源于枯草芽孢杆菌的信号肽（表S2）替换原有的EstA信号肽，构建了一系列工程菌株（Cg-XH1至Cg-XH11）。随后在三种发酵培养基中评估这些菌株的生长和胞外酶活，包括CGXII + NaAc（30 g/L）培养基、CGXII + Glu（22 g/L）培养基和LBB培养基。
由于24 h时的细胞密度因培养基不同而异，暂采用单位OD600的比酶活作为比较菌株性能的指标。如图2A所示，在含30 g/L乙酸钠的CGXII中培养24 h后，Cg-XH6（携带PhoD信号肽）、Cg-XH8（携带WapA信号肽）和Cg-XH9（携带YbdN信号肽）的单位OD600比酶活分别达到0.083 ± 0.008、0.061 ± 0.005和0.061 ± 0.005 U/mL，分别是对照（0.049 ± 0.003 U/mL）的1.69、1.25和1.23倍。与以乙酸钠为碳源的结果不同，信号肽介导的分泌效率似乎随培养基组成而变化（图2B和C）。在原核表达系统中，信号肽介导的异源蛋白分泌效率受培养基组成变化调控，这种调控通过影响微生物生理的多个方面实现，包括细胞代谢状态、能量代谢、膜流动性和蛋白折叠能力。基于PhoD、WapA和YbdN信号肽在乙酸盐培养条件下的优越表现，选择它们进行后续优化。
【数据】比酶活（24 h，CGXII + 30 g/L NaAc）：Cg-XH6（PhoD）为0.083 ± 0.008 U/mL（1.69倍）、Cg-XH8（WapA）为0.061 ± 0.005 U/mL（1.25倍）、Cg-XH9（YbdN）为0.061 ± 0.005 U/mL（1.23倍）；对照：0.049 ± 0.003 U/mL
#### 启动子与信号肽组合优化
为进一步增强ICCG-A2的表达，选取了6种不同类型的启动子进行筛选。这些启动子此前已被报道为强组成型启动子，或与谷氨酸棒状杆菌中乙酸盐代谢基因相关（表S3）。其中，与乙酸盐代谢基因相关的启动子在高乙酸盐浓度下能驱动相应基因的强表达。在此，利用这一特性来增强目标蛋白的表达。将这些启动子的序列与筛选得到的信号肽以交叉方式逐一组合（图2D），构建工程菌株Cg-EX1至Cg-EX18。使用补充不同浓度乙酸钠的CGXII培养基，在24 h时评估这些菌株的生长和胞外酶活。
如图2E所示，在CGXII + NaAc（30 g/L）培养基中，不同菌株的生长速率存在差异。工程菌株Cg-EX9至Cg-EX18表现出优异的ICCG-A2生产能力，证实了这些启动子在谷氨酸棒状杆菌中利用乙酸盐合成蛋白质方面的优越性。其中，菌株Cg-EX17在细胞密度和单位OD600比酶活方面均表现出显著优势。相比之下，携带Ptac启动子的菌株Cg-EX3虽然细胞密度较低，但获得了最大比酶活（0.109 ± 0.009 U/mL）。
在CGXII + NaAc（45 g/L）培养基中培养时，所有菌株积累了相似的细胞密度（图2F）。然而，菌株Cg-EX10至Cg-EX18保持了强劲的生产性能。Cg-EX16、Cg-EX17和Cg-EX18的单位OD600比酶活（分别为0.125 ± 0.005、0.127 ± 0.012和0.130 ± 0.006 U/mL）分别达到Cg-EX3（0.065 ± 0.0001 U/mL）的1.93、1.95和2.01倍。菌株Cg-EX16至Cg-EX18的ICCG-A2产量随乙酸盐浓度升高而增加，表明较高的乙酸盐水平增强了与乙酸盐代谢相关启动子的调控强度（图S3）。在CGXII + NaAc（60 g/L）培养基中也进行了发酵实验，但细胞生长不良导致发酵失败。在菌株Cg‑EX16（携带PhoD-PA256组合）、Cg‑EX17（携带WapA-PA256组合）和Cg‑EX18中……
【数据】CGXII + 30 g/L NaAc中Cg-EX3最大比酶活：0.109 ± 0.009 U/mL；CGXII + 45 g/L NaAc中比酶活：Cg-EX16为0.125 ± 0.005 U/mL（1.93倍）、Cg-EX17为0.127 ± 0.012 U/mL（1.95倍）、Cg-EX18为0.130 ± 0.006 U/mL（2.01倍）；对照Cg-EX3：0.065 ± 0.0001 U/mL；60 g/L NaAc发酵：失败（细胞生长不良）
讨论与解读
本研究建立了以高浓度乙酸盐为唯一碳源、在工程化谷氨酸棒状杆菌中分泌表达叶枝堆肥角质酶变体ICCG-A2的低成本生产平台。在以乙酸盐为碳源的微生物异源蛋白生产中，不同信号肽的性能可能存在差异，因此筛选适合目标蛋白分泌表达的信号肽至关重要。谷氨酸棒状杆菌中与乙酸盐代谢基因相关的内源启动子在目标基因表达方面展现出明显优势。增强菌株对高渗透压的耐受性并改善乙酸盐利用，有助于细胞在高浓度乙酸盐环境中的生长。与ACK-PTA途径相比，ACS通过更少的酶促步骤实现底物同化，但ACS介导的乙酸盐同化需要更多ATP，限制了生物量积累。通过培养基优化或其他策略缓解这种生长抑制，有利于细胞生长和产物生产。总而言之，通过整合宿主代谢工程、蛋白表达盒设计和培养基配方优化，成功开发了能够从乙酸盐高效生产ICCG-A2的工程谷氨酸棒状杆菌菌株及相应发酵工艺，为工程化谷氨酸棒状杆菌生产重组蛋白提供了典型案例。
编译者解读
该研究系统呈现了"碳源替代—表达元件适配—宿主耐受性改造—培养基响应优化"的完整工程链条，尤其值得关注的是将乙酸盐代谢相关启动子用于驱动目标蛋白表达的策略，巧妙利用了底物诱导的转录优势。以ACS替代ACK-PTA途径虽增加了ATP成本，但结合培养基离子优化弥补了生长缺陷，体现了代谢权衡思维。局限在于60 g/L乙酸盐条件下发酵失败，高浓度底物抑制仍未完全解决，未来可结合适应性实验室进化进一步挖掘菌株耐受潜力。
参考来源
Fan Z. The secretory production of cutinase ICCG-A2 in Corynebacterium glutamicum using acetate as the sole carbon source. Journal of Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.05.017
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.05.017