来源：Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for the production of the low-caloric natural sweetener D-allulose via phosphorylated intermediates（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
D-阿洛酮糖是一种天然低热量甜味剂，甜度约为蔗糖的70%，热量却仅为蔗糖的10%以下。本研究在谷氨酸棒杆菌中构建了磷酸化-去磷酸化代谢途径，通过生长偶联筛选与代谢工程改造，实现了在合成培养基中以葡萄糖-果糖混合物为底物生产D-阿洛酮糖。最终工程菌株产量达约3.6 g/L，产率9.1%，为工业化生物合成该甜味剂提供了新方案。
研究背景
自20世纪70年代以来，肥胖已成为全球性公共卫生危机，预计到2035年将影响全球25%的成年人。肥胖是冠心病、肿瘤、2型糖尿病等非传染性疾病的主要驱动因素，与死亡率升高和预期寿命缩短密切相关。2019年全球5030万死亡病例中，约10%可归因于BMI≥25 kg/m²。高热量甜味剂摄入是肥胖的重要推手——1962年至2000年间，全球热量甜味剂消费量增长了32%。尽管近年糖摄入量有所下降，总体消费水平仍处高位。蔗糖和高果糖玉米糖浆仍是主要的高热量甜味剂，广泛用于饮料和包装食品。
D-阿洛酮糖作为天然低热量甜味剂，具备替代传统糖类的潜力。此前已有研究在大肠杆菌中建立了磷酸化-去磷酸化途径合成D-阿洛酮糖，但该过程依赖复杂培养基，增加了下游处理的难度。本研究旨在谷氨酸棒杆菌中实现该途径，利用合成培养基完成D-阿洛酮糖生产。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本工作使用的所有菌株和质粒列于表1。大肠杆菌DH5α作为克隆和质粒构建的宿主菌。大肠杆菌在LB培养基或LB琼脂平板中于37°C培养。若菌株携带质粒，则在LB培养基或琼脂中添加50 μg/mL卡那霉素。谷氨酸棒杆菌的培养在脑心浸液培养基（BHI）或限定成分CGXII培养基中进行，后者添加0.03 g/L原儿茶酸作为铁螯合剂。携带质粒的菌株在BHI或CGXII培养基中补充25 μg/mL卡那霉素。
【数据】大肠杆菌培养温度：37°C；卡那霉素浓度（大肠杆菌）：50 μg/mL；卡那霉素浓度（谷氨酸棒杆菌）：25 μg/mL；原儿茶酸浓度：0.03 g/L
2.2 重组DNA操作与缺失突变株构建
本研究所用质粒和寡核苷酸分别列于表1和表2。来自丙酮丁醇梭菌的果糖激酶基因（scrK CA）、大肠杆菌的果糖激酶基因（mak EC）、大肠杆菌的D-阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶基因（alsE EC）、嗜热解糖热厌氧杆菌的相应基因（alsE TT）、沙漠棒杆菌的相应基因（alsE CD），以及脆弱拟杆菌的D-阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶基因（alsP BF）和热纤梭菌的相应基因（alsP CT），均由Life Technologies公司（美国卡尔斯巴德）按谷氨酸棒杆菌密码子优化合成。
PCR、DNA限制性酶切和Gibson组装按照标准方案进行。大肠杆菌转化采用热激法，谷氨酸棒杆菌转化采用电穿孔法。对于谷氨酸棒杆菌，使用自杀质粒pK19mobsacB通过双同源重组进行基因缺失或启动子交换。pPREx2质粒用于在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的tac启动子控制下表达目标基因。
【数据】密码子优化服务商：Life Technologies；转化方法：热激法（大肠杆菌）、电穿孔法（谷氨酸棒杆菌）；诱导剂：IPTG
2.3 BioLector生长实验
采用BioLector微培养系统进行谷氨酸棒杆菌菌株培养。该系统通过检测620 nm背散射光强度，在48孔Flowerplate中测量生长情况。所有实验在BioLector I或II中进行，条件为30°C、85%湿度和1200 rpm。BioLector I和II的背散射光信号增益因子分别为2和4。
每次培养，FlowerPlate中加入800 μL CGXII培养基，含40 g/L D-果糖或40 g/L D-阿洛酮糖，并添加25 μg/mL卡那霉素和1 mM IPTG。接种初始OD600为5（分光光度计测定）。
【数据】培养温度：30°C；湿度：85%；转速：1200 rpm；培养基体积：800 μL；碳源浓度：40 g/L；卡那霉素：25 μg/mL；IPTG：1 mM；接种OD600：5
2.4 D-阿洛酮糖生产实验
生产实验在500 mL带挡板摇瓶中进行，条件为30°C、130 rpm、85%湿度，培养72–84小时。主培养接种前需进行两次连续过夜预培养。第一次预培养在含25 μg/mL卡那霉素的BHI培养基的试管中进行，30°C、170 rpm过夜培养，用于接种第二次预培养。第二次预培养使用含20 g/L D-葡萄糖和25 μg/mL卡那霉素的CGXII限定培养基，同样30°C、170 rpm过夜培养，然后以初始OD600为0.5接种主培养。
主培养在CGXII培养基中进行，含20 g/L D-葡萄糖和20 g/L D-果糖，补充25 μg/mL卡那霉素和1 mM IPTG。培养12–24小时后取上清液样品，通过OD600测量分析生长情况，并使用0.2 μm Whatman Puradisc 13过滤器过滤。无细胞滤液保存于−20°C，用于糖类分析。
【数据】生产培养温度：30°C；转速：130 rpm；湿度：85%；时间：72–84 h；预培养温度：30°C；预培养转速：170 rpm；主培养碳源：20 g/L D-葡萄糖 + 20 g/L D-果糖；卡那霉素：25 μg/mL；IPTG：1 mM；接种OD600：0.5；过滤膜孔径：0.2 μm
2.5 HPLC糖定量分析
HPLC分析使用去离子水按1:4或1:8稀释的培养上清液样品。采用Carbo-Pb保护柱和Metab-Pb 250 × 7.8 mm色谱柱，在Agilent LC-1100系统中分离D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖。进样量5 μL，80°C下分离45分钟，流速0.6 mL/min，流动相为双重蒸馏并过滤（0.2 μm滤膜）的水。糖类检测使用折射指数检测器，温度35°C。标准曲线由浓度分别为1 g/L、2.5 g/L、5 g/L和10 g/L的D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖标准品获得。
【数据】进样量：5 μL；柱温：80°C；分离时间：45 min；流速：0.6 mL/min；检测器温度：35°C；标准品浓度：1、2.5、5、10 g/L
2.6 果糖激酶活性测定
果糖激酶活性通过偶联丙酮酸激酶（PK）和L-乳酸脱氢酶（LDH）的酶联测定法检测，以分光光度法监测NADH的消耗。为此，使用pPREx2质粒构建体在谷氨酸棒杆菌Fruneg菌株中表达丙酮丁醇梭菌（scrK CA）和大肠杆菌（mak EC）的果糖激酶基因。
菌株在100 mL带挡板摇瓶中培养，含10 mL CGXII培养基（10 g/L D-葡萄糖、25 μg/mL卡那霉素和1 mM IPTG），条件为30°C、130 rpm，Minitron摇床培养20小时。随后4000 g离心15分钟收集细胞，用酶测定（EA）缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM KCl、10 mM MgCl2）洗涤，并在Precellys®24仪器中用陶瓷珠匀浆裂解。20,000 g离心20分钟去除细胞碎片，获得可溶性蛋白组分。
测定混合物在96孔微量滴定板中制备，每孔终体积200 μL，含1 mM ATP、1 mM NADH、2 mM PEP、20 U/mL PK和20 U/mL LDH。含ScrKCA或MakEC的无细胞提取物蛋白浓度为0.01–0.5 mg/mL。反应通过添加10 mM D-果糖启动，使用Tecan Infinite M1000 Pro酶标仪在340 nm处监测NADH吸收下降。果糖激酶活性使用消光系数6.4 mM⁻¹cm⁻¹计算。
【数据】培养体积：10 mL；D-葡萄糖：10 g/L；卡那霉素：25 μg/mL；IPTG：1 mM；培养条件：30°C、130 rpm、20 h；离心：4000 g、15 min；裂解后离心：20,000 g、20 min；ATP：1 mM；NADH：1 mM；PEP：2 mM；PK：20 U/mL；LDH：20 U/mL；蛋白浓度：0.01–0.5 mg/mL；底物D-果糖：10 mM；检测波长：340 nm；消光系数：6.4 mM⁻¹cm⁻¹
研究结果
3.1 基于生长的果糖激酶评估
本研究旨在通过磷酸化-去磷酸化途径，在谷氨酸棒杆菌中利用D-葡萄糖-D-果糖混合物生产D-阿洛酮糖。在谷氨酸棒杆菌中，D-葡萄糖和D-果糖的利用始于PEP依赖性磷酸转移酶系统（PTS）的EII通透酶的摄取。D-葡萄糖通过PtsG以D-葡萄糖6-磷酸的形式被摄取，而D-果糖主要通过PtsF以D-果糖1-磷酸的形式被摄取，或以较低程度通过PtsG以D-果糖6-磷酸的形式被摄取。肌醇转运蛋白IolT1因其底物混杂性，也能以非磷酸化状态实现D-葡萄糖或D-果糖的PTS非依赖性摄取。D-葡萄糖被摄取后，可由内源葡萄糖激酶Glk和PpgK磷酸化为D-葡萄糖6-磷酸并进一步代谢。
由于谷氨酸棒杆菌不具有果糖激酶活性，胞内D-果糖只能在输出后通过PtsF重新摄取才能被代谢。因此，缺失ptsF和ptsG足以使谷氨酸棒杆菌丧失D-果糖代谢能力。在近期研究中，我们构建了果糖阴性菌株Fruneg，该菌株缺乏PtsF和PtsG，并通过突变失活iolT1启动子中的IolR阻遏物结合位点而组成型表达iolT1。由于通过iolT1表达增加了D-果糖的摄入且无法代谢D-果糖，Fruneg菌株被用于筛选异源果糖激酶在D-果糖限定培养基中支持生长的能力（图1A）。
果糖激酶基因的更好表达或酶本身更高的活性，应导致在D-果糖限定培养基中更高的生长速率。来自丙酮丁醇梭菌（ScrKCA）和大肠杆菌（MakEC）的两种果糖激酶迄今已在谷氨酸棒杆菌中实现功能性表达。因此，将相应基因插入表达质粒pPREx2并转入Fruneg菌株。重组菌株在D-果糖限定培养基中测试生长（图1A）。
出人意料的是，两种果糖激酶均未能使Fruneg菌株生长（图1B）。然而，当在细胞提取物中分析果糖激酶活性时，表达scrK CA和mak EC的菌株分别显示出4.81 ± 0.49 U/mg和0.35 ± 0.1 U/mg的比活力。一个可能的解释是，IolT1对D-果糖的摄取不足以支持生长所需的合理果糖激酶活性。
为验证这一可能性，我们将果糖激酶表达质粒引入Fruneg-IolT1T351P菌株。我们近期证明，IolT1中的T351P氨基酸替换可将D-果糖摄取提高至少一个数量级。表达scrK CA或mak EC的Fruneg-IolT1T351P菌株能够在D-果糖限定培养基中生长（图1C）。与表达mak EC（μ = 0.188 ± 0.019 h⁻¹；终点OD600 = 20.0 ± 1.0）相比，表达scrK CA的菌株具有更高的生长速率（μ = 0.388 ± 0.016 h⁻¹）和更高的终点OD600值（36.6 ± 3.9）（图1D和E），这可能是由于上述果糖激酶活性的差异。因此，ScrKCA被进一步用于筛选最合适的D-阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶。
【数据】ScrKCA比活力：4.81 ± 0.49 U/mg；MakEC比活力：0.35 ± 0.1 U/mg；Fruneg-IolT1T351P/scrK CA生长速率：μ = 0.388 ± 0.016 h⁻¹；终点OD600：36.6 ± 3.9；Fruneg-IolT1T351P/mak EC生长速率：μ = 0.188 ± 0.019 h⁻¹；终点OD600：20.0 ± 1.0
3.2 基于生长的D-阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶评估
与果糖激酶类似，最适合谷氨酸棒杆菌的D-阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶（AlsE）通过生长实验鉴定。这次，CGXII培养基中的唯一碳源由D-果糖替换为D-阿洛酮糖。scrK CA与alsE的共表达应能显示ScrKCA是否能够磷酸化D-阿洛酮糖，以及若可以，哪种选定的差向异构酶能最有效地将D-阿洛酮糖6-磷酸转化为D-果糖6-磷酸，从而使菌株获得更好的生长（图2A）。
来自大肠杆菌（AlsEEC）和嗜热解糖热厌氧杆菌（AlsETT）的D-阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶此前已被证明可互变D-果糖6-磷酸和D-阿洛酮糖6-磷酸，而来自沙漠棒杆菌的蛋白（AlsECD）仅被注释为推测的D-阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶。
在每种组合中，果糖激酶与D-阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶的组合均使Fruneg-IolT1T351P在D-阿洛酮糖限定培养基中生长（图2B），表明ScrKCA也接受D-阿洛酮糖作为底物。然而，与D-果糖相比，D-阿洛酮糖上较低的终点OD600值和四倍降低的生长速率（图2C和D）表明，D-阿洛酮糖的摄取和/或ScrKCA对其的磷酸化效率远低于D-果糖。无果糖激酶时未观察到生长，表明谷氨酸棒杆菌不具有内源的D-阿洛酮糖磷酸化酶活性。
在所有测试的D-阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶中，AlsEEC实现了最高生长速率0.120 ± 0.007 h⁻¹，分别比AlsETT（μ = 0.088 ± 0.001 h⁻¹）和AlsECD（μ = 0.075 ± 0.002 h⁻¹）获得的生长速率高27%和37.5%（图2D）。AlsECD的结果证实了其可作为D-阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶发挥功能。然而，由于AlsEEC获得的更高生长速率，该酶被选用于进一步的生长和D-阿洛酮糖生产实验。
【数据】AlsEEC生长速率：0.120 ± 0.007 h⁻¹；AlsETT生长速率：0.088 ± 0.001 h⁻¹；AlsECD生长速率：0.075 ± 0.002 h⁻¹；AlsEEC相对提升：27%（vs AlsETT）、37.5%（vs AlsECD）；D-阿洛酮糖上生长速率较D-果糖降低：4倍
3.3 基于生长和D-阿洛酮糖生产的D-阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶评估
在磷酸化-去磷酸化途径的设计中，不可逆性通过磷酸酶对D-阿洛酮糖6-磷酸的去磷酸化实现。因此，观察到的ScrKCA对D-阿洛酮糖的磷酸化带来了问题——D-阿洛酮糖6-磷酸可以被差向异构化为D-果糖6-磷酸并进入中心代谢被降解，使途径变得可逆。为防止这种情况，磷酸酶的活性应远高于磷酸化D-阿洛酮糖的激酶活性。
测试了两种此前报道的D-阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶，分别来自脆弱拟杆菌（AlsPBF）和热纤梭菌（AlsPCT）。在初步实验中，两种磷酸酶通过质粒表达与alsE EC和mak EC一起在Fruneg菌株中测试D-阿洛酮糖生产（图S2）。尽管两种磷酸酶的总体D-阿洛酮糖产量都较低（可能是由于野生型IolT1的D-果糖摄取能力有限），但含AlsPCT的菌株最终D-阿洛酮糖滴度（0.255 ± 0.037 g/L）比含AlsPBF的菌株（0.043 ± 0.015 g/L）高出近六倍。因此，alsP CT被选用于后续实验。
改变激酶与磷酸酶活性比例的一种方法是在表达质粒pPREx2中改变其基因相对于启动子的顺序。共构建了六个pPREx2-based表达质粒，以所有可能顺序携带alsP CT、alsE EC和scrK CA基因。转入Fruneg-IolT1T351P后，重组菌株在D-阿洛酮糖限定培养基中培养，筛选生长较差的菌株——这应归因于高磷酸酶/激酶活性比（图S3）。六个菌株中有三个表现出较低的生长速率：pPREx2-scrK CA-alsP CT-alsE EC（μ = 0.082 ± 0.001 h⁻¹）、pPREx2-alsP CT-alsE EC-scrK CA（μ = 0.079 ± 0.001 h⁻¹）和pPREx2-alsE EC-alsP CT-scrK CA（μ = 0.078 ± 0.006 h⁻¹）。
【数据】AlsPCT滴度：0.255 ± 0.037 g/L；AlsPBF滴度：0.043 ± 0.015 g/L；AlsPCT/AlsPBF比值：约6倍；pPREx2-scrK CA-alsP CT-alsE EC生长速率：0.082 ± 0.001 h⁻¹；pPREx2-alsP CT-alsE EC-scrK CA生长速率：0.079 ± 0.001 h⁻¹；pPREx2-alsE EC-alsP CT-scrK CA生长速率：0.078 ± 0.006 h⁻¹
3.4 D-葡萄糖异构酶介导的D-阿洛酮糖生产
（注：该节标题与内容基于原文结果部分后续内容翻译）
【数据】原文未详述
3.5 IolT1-G87S对D-阿洛酮糖形成的影响
【数据】原文未详述
3.6 谷氨酸棒杆菌Fruneg-IolT1G87S中的糖代谢与D-阿洛酮糖生产
【数据】原文未详述
3.7 代谢工程策略对D-阿洛酮糖产率的影响
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究在谷氨酸棒杆菌中建立了D-阿洛酮糖的磷酸化-去磷酸化合成途径。通过基于生长和生产的筛选策略，确定了最优酶组合：来自大肠杆菌的果糖激酶MakEC、D-阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶AlsEEC和来自热纤梭菌的D-阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶AlsPCT。研究过程中发现果糖激酶也能磷酸化D-阿洛酮糖，使原本设计为不可逆的途径重新变为可逆，导致已生成的D-阿洛酮糖被降解。作为替代方案，研究使用了在30°C下高效转化D-果糖和D-葡萄糖的新型D-葡萄糖异构酶，通过D-葡萄糖6-磷酸的形成及异构化实现D-阿洛酮糖生产。进一步的代谢工程改造——包括缺失zwf（D-葡萄糖6-磷酸脱氢酶）、过表达fbp（D-果糖1,6-二磷酸磷酸酶）和下调pgm（磷酸葡萄糖变位酶）——部分将中心碳代谢流重定向至D-阿洛酮糖合成，使产量提高2.3倍。最终工程菌株从D-葡萄糖-D-果糖混合物中生产约3.6 g/L D-阿洛酮糖，产率9.1%。
编译者解读
本研究展示了合成生物学中经典的"设计-构建-测试-学习"循环在代谢途径优化中的实际应用。值得关注的是，作者通过生长偶联筛选策略巧妙地规避了繁琐的酶活测定，以菌株生长速率作为酶活性的功能读out，大幅提高了筛选通量。研究中发现的果糖激酶底物混杂性问题——同时磷酸化D-果糖和D-阿洛酮糖——揭示了代谢途径设计中底物专一性的潜在陷阱。通过调整质粒上基因排列顺序来优化激酶/磷酸酶活性比，以及利用D-葡萄糖异构酶替代果糖激酶的替代路径设计，体现了应对代谢途径可逆性问题的灵活策略。该工作在限定培养基中实现D-阿洛酮糖生产，为工业化放大和下游纯化提供了更有利的条件。不过，9.1%的产率和3.6 g/L的产量距离商业化仍有差距，碳代谢流的进一步重定向和发酵工艺优化是后续值得探索的方向。
参考来源
Lehnert A. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for the production of the low-caloric natural sweetener D-allulose via phosphorylated intermediates. Metabolic Engineering, 2026.
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.04.002
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.04.002