来源：Digital holographic microscopy is suitable for lipid accumulation analysis in single cells of Yarrowia lipolytica（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
微生物脂质因在饲料与食品中的营养价值而日益受到关注，但其定量分析长期依赖气相色谱或荧光染色等耗时方法。本研究以产油酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为对象，系统验证了三维数字全息显微镜（3D-DHM）作为一种无标记、准实时单细胞分析技术的可行性。研究将野生型与脂质过表达菌株的DHM光学体积数据与气相色谱、流式细胞术结果进行关联分析，证实DHM可在无需染色的条件下快速定量细胞内总脂质积累，为微生物脂质生产的在线过程监控提供了新工具。
研究背景
产油微生物（酵母、霉菌和藻类）作为油脂来源的商业开发概念可追溯至上世纪初。多不饱和脂肪酸（PUFA）因在营养保健品和生物燃料领域的广泛应用而备受关注。当细胞脂质积累超过干细胞质量20%（w/w）时，该细胞即被视为产油细胞。微生物脂质的主要成分为三酰甘油（TAG），并伴有游离脂肪酸、甾醇及极性脂质组分，其组成主要取决于碳源和氮源的供给情况。
解脂耶氏酵母是产油微生物中应用最广泛的宿主之一，其通过Kennedy途径将酯化脂肪酸（>90%）掺入非极性TAG中。目前，酵母细胞内总长链脂肪酸浓度的定量分析仍较耗时——无论是采用色谱法进行体积分析，还是通过染色结合流式细胞术进行单细胞分析。数字全息显微镜（DHM）作为一种无标记分析技术，可测定细胞体积及胞质折射率。本研究旨在验证3D-DHM能否实现对解脂耶氏酵母总脂质积累的快速定量。
研究方法
2.1 酵母菌株
以解脂耶氏霉菌株S11070作为野生型代表，该菌株在Hackenschmidt等（2019）的研究中编号为菌株63，Bruder等（2020）将其命名为S11070。本研究的后续实验使用一株基因工程改造的解脂耶氏酵母菌株。脂质过表达菌株S15010（基因型为MATA ura3–302::SUC2 Δpox1–6 tgl4::pTEF-DGA1）的构建过程如下：受Blazeck等（2014）工作的启发，在缺失六个POX基因的敲除菌株H222ΔP（Gatter等，2014）中，通过整合含有强组成型TEF启动子控制的酰基-CoA:二酰甘油酰基转移酶同工酶II基因（DGA1）的DNA cassette，敲除了编码脂肪酶的tgl4基因。敲除/敲入构建体的DNA通过酿酒酵母BY4741菌株中的转化辅助重组进行组装。组装的质粒在大肠杆菌DH10B菌株中扩增，经StuI酶切线性化后，按Bruder等（2019）所述方法转化至解脂耶氏酵母中。
2.2 细胞维持
细胞首先在YPD琼脂平板上培养，平板成分为1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖和2%琼脂（均为w/w）。接种时，从平板挑取单菌落，转移至25 mL液体培养基中，于30°C、250 rpm条件下培养。细胞在缓冲YPD液体培养基中生长，培养基组成同上但不含琼脂。培养基补充1.4% KH₂PO₄和0.1% (NH₄)Cl作为缓冲剂（参照Maczek等，2006），滴定至pH 5.5，用于500 mL无挡板玻璃摇瓶中的细胞培养。细胞在30°C、250 rpm培养至晚指数期后收获。将1 mL粗细胞培养液与500 µL 50%（v/v）无菌甘油混合，立即于−80°C保存。
2.3 生物反应器培养
除特别注明外，培养基及分析用所有化学品均购自Carl Roth（德国卡尔斯鲁厄）。生物反应器培养采用两阶段预培养，使细胞适应无机盐培养基。第一阶段预培养在缓冲YPG培养基中进行，配方与缓冲YPD相同，但以甘油替代葡萄糖（终浓度1%（w/w）），接种200 µL冷冻保存液。培养参数与冷冻保存液制备时相同。培养约12 h后收获，此时OD₆₀₀为13。该培养物用于接种第二阶段预培养。将50 mL批式培养基（配方见下）接种至初始OD₆₀₀为2，随后在30°C、250 rpm条件下培养至光密度OD₆₀₀ = 7。
搅拌罐生物反应器KLF 2（Bioengineering，瑞士瓦尔德）接种至2 L批式培养基中起始OD₆₀₀为0.15（Bruder等，2019）。培养用批式培养基成分如下：30 g/L碳源（甘油）、0.5 g/L酵母提取物、1.1 g/L MgSO₄·7H₂O、0.2 g/L CaCl₂·6H₂O、0.5 g/L MgCl₂·6H₂O、0.075 g/L肌醇、1.36 g/L KH₂PO₄、1.74 g/L K₂HPO₄、0.2 mg/L CuSO₄·5H₂O、1 mg/L FeSO₄·7H₂O、0.2 mg/L MnCl₂·4H₂O、0.2 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.2 mg/L ZnSO₄·7H₂O、5 mg/L生物素、100 mg/L D-泛酸半钙盐、20 mg/L烟酸、60.8 mg/L盐酸吡哆醇、20 mg/L盐酸硫胺素及5 g/L NH₄Cl。
发酵用补料培养基成分如下：400 g/L碳源（甘油）、3.3 g/L MgSO₄·7H₂O、0.6 g/L CaCl₂·6H₂O、1.5 g/L MgCl₂·6H₂O、0.45 g/L肌醇、2.72 g/L KH₂PO₄、3.48 g/L K₂HPO₄、0.6 mg/L CuSO₄·5H₂O、3 mg/L FeSO₄·7H₂O、0.6 mg/L MnCl₂·4H₂O、0.6 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.6 mg/L ZnSO₄·7H₂O、15 mg/L生物素、300 mg/L D-泛酸半钙盐、60 mg/L烟酸、182.4 mg/L盐酸吡哆醇、60 mg/L盐酸硫胺素及0.01 g/L FeCl₃·6H₂O。消泡剂204（Sigma，德国）在培养基原位灭菌前按1 mL/L浓度加入每个反应器。
反应器配备两个Rushton涡轮搅拌器并进行原位灭菌。初始工艺参数为pH = 6.3、温度 = 30°C、通气量 = 0.5 vvm、搅拌速度 = 400 rpm。通过添加2 M NaOH将pH控制在pH = 3.0。当溶解氧浓度（DO）低于饱和值的20%时，搅拌速率提高至1,200 rpm以确保好氧条件。当碳源耗尽（以DO急剧升高为指示）时，手动补加补料培养基脉冲（Bruder等，2019），补加量按初始批式培养基体积计25 g/L甘油。每2 h取25 mL样品，用于离线测定OD、pH值、细胞干重（CDW）、通过高效液相色谱（HPLC，酶法分析采用Cedex Bio HT分析仪（Roche Custom Biotech，德国曼海姆））测定代谢物，以及通过气相色谱和染色细胞流式细胞术测定胞内脂质含量。
2.4 分析
#### 2.4.1 细胞生长与代谢物
通过分光光度计（Ultraspec 3000，GE Healthcare，美国芝加哥）在600 nm波长处测定光密度来量化细胞生长。在线监测细胞密度采用Dencytee传感器（Hamilton，瑞士博纳杜兹）。CDW分析时，将2 mL粗培养液在21,500 × g、4°C条件下离心5 min，用0.9%（w/w）NaCl溶液洗涤两次，再在相同条件下离心。沉淀在80°C下干燥至少24 h；培养上清液用0.2 µm PTFE滤膜（VWR International，德国达姆施塔特）过滤，在代谢物分析前于4°C保存。
短链羧酸采用Agilent 1200 HPLC系统（Agilent Technologies，德国拉廷根）定量，该系统配备示差折光检测器和HyperRez XP carbohydrate H+色谱柱（300 × 7.7 mm，8 µm；Fisher Scientific，德国施韦尔特）。以5 mM H₂SO₄溶液为流动相，流速0.6 mL/min，柱温65°C，进样量20 µL。数据分析采用Agilent ChemStation软件4.03版。甘油、氨和磷酸盐含量采用Cedex Bio HT分析仪从与HPLC分析相同的样品中酶法测定，按制造商指定的试剂盒说明操作。
#### 2.4.2 脂质分析
长链脂肪酸分析采用配备火焰离子化检测器的气相色谱仪进行，方法参照Hillig等（2013）发表的方法并稍作修改。样品调整至OD₆₀₀ = 10（总体积20 mL），用冷去离子水洗涤两次，离心（8,000 rpm，10 min，2°C），重悬于500 µL干燥甲醇中。加入内标（100 µL 1 g/L十九烷酸，溶于氯仿）和2 mL干燥甲醇与乙酰氯的10:1混合物，样品在50°C水浴中孵育16 h（所有化学品均购自Sigma）。甲酯用5 mL己烷（VWR，德国达姆施塔特）萃取两次，用转子摇床振摇15 min，真空干燥。沉淀溶于1.5 mL己烷，转移至GC进样瓶，采用配备火焰离子化检测器的GC-2010 Plus气相色谱仪（Shimadzu，日本京都）分析。进样器、色谱柱和检测器的温度设置如下：290°C、150°C和300°C；色谱柱程序升温模式起始于150°C保持2 min，以15 K/min速率升温至250°C，保持37 min，再以5 K/min速率升温至280°C，保持至运行结束。分离在0.25 mm × 25 m聚二甲基硅氧烷（0.12 µm，CP-Sil 5 CB）毛细管柱（Varian，德国达姆施塔特）上进行。超纯正己烷用作溶剂。
【数据】菌株：Y. lipolytica S11070（野生型）及S15010（基因工程菌）；培养基：YPD/YPG/矿物盐培养基；温度：30°C；转速：250 rpm（摇瓶）/400–1,200 rpm（反应器）；pH：5.5（摇瓶）/3.0（反应器控制值）；时间：预培养约12 h，反应器培养约50 h以上；OD₆₀₀：13（一阶预培养）、7（二阶预培养）、0.15（反应器起始）、约100（终值）；CDW：约30 g/L；补料浓度：25 g/L甘油；样品间隔：2 h；离心条件：21,500 × g、5 min、4°C；干燥条件：80°C、≥24 h；GC衍生化：50°C、16 h；内标：100 µL 1 g/L十九烷酸；萃取：5 mL己烷×2、振摇15 min
研究结果
本研究系统考察了3D-DHM在产油酵母解脂耶氏酵母单细胞水平胞内脂质定量中的应用。研究团队了解其他脂质定量方法如相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）共聚焦显微镜、磁共振波谱或基于图像的细胞计数法，但旨在评估一种无标记、对培养基成分稳健且基于图像的替代方法。首先，利用野生型菌株S11070的培养结果进行原理验证，考察3D-DHM能否从低含量开始提供胞内总脂质积累的定量数据。随后，用一株能够达到更高脂质滴度的基因改造菌株验证结果——高脂质滴度通常是微生物脂质生产经济可行性的重要前提。最后，将3D-DHM结果与成熟方法（即气相色谱和基于流式细胞术的脂质定量）进行比较。
3.1 两阶段重复补料分批培养
结果来自两次解脂耶氏酵母2 L台式搅拌罐反应器培养，采用重复补料分批模式，最终光密度约为OD₆₀₀ = 100，对应细胞干重约30 g/L（图2A、B）。由于批式培养基含有5 g/L氯化铵作为氮源而补料培养基不含氮源，因此实现了两个培养阶段（氮过量与氮限制）的区分。氮限制导致的生长减缓在生长曲线中清晰可见（图2C、D）：细胞指数生长至16.5 h，之后在氨耗尽时进入线性生长阶段。初始pH下降的主要原因是氨源的消耗，氨浓度的时间变化过程证实了这一依赖关系。每次DO急剧升高时，补加培养基至培养液中甘油终浓度为25 g/L（Bruder等，2019），以避免长时间碳限制生长条件（图2C、D）。交替的碳源可利用性影响尾气中的O₂和CO₂浓度（图2E、F）。碳源耗竭阶段导致代谢活性降低，从而氧需求减少，这反映在尾气O₂浓度上（图2E、F）。在整个脂质生成过程中，分子氧被消耗用于长链脂肪酸的合成（Papanikolaou和Aggelis，2011）；因此，尾气中氧浓度下降。氨耗尽后（图2A、B）该阶段培养液酸化，可能部分归因于丙酮酸和草酰乙酸的合成——这些是来自甘油等碳水化合物源的从头脂质生成的中间产物（Evans等，1983；Ratledge和Wynn，2002b）。
胞内总长链脂肪酸积累量在铵完全耗尽时恰好开始增加（图2I、J对应图2G、H）。事实上，众所周知，在产油酵母的从头脂质生产中，氮限制至关重要（González-García等，2017；Ratledge和Wynn，2002b）。野生型菌株培养过程中观察到略有不同的脂质浓度，长链脂肪酸形成速率在较长培养时间内相对较低。然而，这并不妨碍DHM的评估。短链羧酸，特别是乳酸、乙酸、柠檬酸和丙酮酸，在培养过程中几乎不积累，前三者保持在约0.1 µM的检测阈值以下（数据未显示）——通过HPLC和上清液样品酶法测定。解脂耶氏酵母显然消耗了线粒体来源、转运至胞质的柠檬酸，用于ATP-柠檬酸裂解酶驱动的乙酰-CoA合成，并最终在胞质中储存长链脂肪酸（Boulton和Ratledge，1981；Dulermo等，2015）。ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）在野生型解脂耶氏酵母脂质生成阶段具有高活性，这解释了尽管持续脉冲补加碳源但仍未检测到柠檬酸的原因（Ochoa-Estopier和Guillouet，2014）。丙酮酸在培养液中积累至0.1 g/L的浓度，但仅在指数生长期间（图2G、H），即在氮源耗尽之前。这并不令人意外，因为已知解脂耶氏酵母缺乏苹果酸酶（ME）的胞质变体（Zhang等，2013）。虽然解脂耶氏酵母具有线粒体ME变体——也能将L-苹果酸转化为丙酮酸——但它可能不参与脂肪酸合成中NADPH的再生（Zhang等，2013）。线粒体ME并非脂质生成所必需（Dulermo等，2015）。因此，丙酮酸并非由推测的ME催化反应产生。
【数据】培养模式：重复补料分批；最终OD₆₀₀：约100；CDW：约30 g/L；氮源：批式培养基含5 g/L NH₄Cl，补料培养基无氮；指数生长期：至16.5 h；补料浓度：25 g/L甘油/次；丙酮酸最高积累：0.1 g/L（仅指数期）；短链羧酸检测阈值：约0.1 µM
3.2 气相色谱分析脂质积累
以下将讨论作为体积脂质分析"金标准"的GC-FID分析结果，用于与其他分析方法的数据进行比较。分析仅限于野生型菌株积累的长链脂肪酸，主要是油酸（Δ9C18:1）、亚油酸（Δ9,12C18:2）、棕榈酸（C16:0）和棕榈油酸（Δ9C16:1）（Kyle等，1992；Papanikolaou和Aggelis，2011, 2009），以及较少量的亚麻酸（Δ9,12,15C18:3），这与解脂耶氏酵母野生型菌株中的观察一致（Carsanba等，2020）。油酸、亚油酸和亚麻酸以一个总值显示（图3D），因为GC-FID峰分离不确定——这些化合物化学结构相似，且分离并非本工作的首要关注点。脂肪酸定量取样在接种后约16.5 h开始，恰逢培养基中氨耗尽之时（图2G、H）。
对于生物反应器培养A和B，长链脂肪酸积累的时间过程呈现相似的发展趋势。关键节点如50 h进入另一培养阶段在两个反应器中一致，表明两次培养之间具有良好的可比性。总值存在差异——生物反应器B培养中，所有长链脂肪酸浓度始终较低。这被视为培养产油酵母野生型菌株生物学重复时的典型变异，如前所述。长链脂肪酸总量及其各自分布的详细信息见表2。为与其他研究比较，表3汇总了不同碳源用于解脂耶氏酵母野生型培养及其相应长链脂肪酸产量的总结性概览。在以葡萄糖或果糖等亲水性碳源生长时，总脂质的比最大产量处于相同范围，即约50–200 mg/gCDW。这一发现证实了本工作中生物反应器培养实验作为后续胞内脂质分析基础的实用性。
【数据】主要脂肪酸：油酸（Δ9C18:1）、亚油酸（Δ9,12C18:2）、棕榈酸（C16:0）、棕榈油酸（Δ9C16:1）、少量亚麻酸（Δ9,12,15C18:3）；比最大脂质产量范围（葡萄糖/果糖）：约50–200 mg/gCDW；取样起始时间点：接种后约16.5 h；培养阶段切换时间点：50 h
3.3 尼罗红染色流式细胞术
为佐证前述GC分析胞内脂质的结果，采用FCM结合尼罗红染色标记胞内脂滴（Delvigne等，2018）。体积分析技术如GC可通过单细胞分析进行补充，以获得更高信息含量。为验证，将GC与FCM的结果进行关联。这作为后续将3D-DHM结果与GC-FID和FCM分析相关联的起点。从氮耗尽前不久开始（图2G、H），即开始取样进行FCM分析。
【数据】染色方法：尼罗红；激发波长：λex = 488 nm；发射波长：λem = 580 nm；取样时间点：氮耗尽前开始
3.4 3D-DHM与GC及FCM数据的关联分析
【数据】关联分析方法：气相色谱（GC）与流式细胞术荧光强度关联、GC与DHM光学体积关联；取样时间范围：16.38 h至46.63 h（图6关联分析）；脂肪酸比产量范围：70–360 mg/gCDW
3.5 脂质过表达菌株S15010的验证实验
【数据】菌株：S15010（脂质过表达）；取样时间范围：22.6 h至52.8 h；比产量范围：70–360 mg/gCDW
3.6 荧光图像显微镜验证
【数据】染色方法：尼罗红（按材料与方法所述方案）；成像模式：明场（无滤光片）与荧光滤光片（带通范围见原文）
讨论与解读
3D-DHM结合自动化图像与数据分析，被证明适用于产油酵母解脂耶氏酵母生物反应器培养样品中胞内总脂质积累的快速、无标记、简便定量。约70 mg/gCDW至360 mg/gCDW范围内的比脂质含量可在单细胞水平上分析，这还允许研究群体异质性。当不需要精确了解长链脂肪酸组成时，该方法可以替代或补充依赖染色技术或色谱分析的方法。由于光学体积这一特征考虑了胞内积累脂质时光学特性的变化，该方法可能适用于其他类似尺寸的微生物，即使脂质积累不发生在单一液滴中。目前已商业化的3D-DHM技术已与流动池结合，可实现旁路测量。该方法原则上可与自动化稀释耦合，以获得测量精度和单细胞可识别性，同时实现实时测量。最近研究表明，将DHM与微流控芯片和计算相结合，可在酿酒酵母中实现细胞区室的分割和定量（Bianco等，2023）。由于解脂耶氏酵母在环境胁迫条件下宏观形态发生变化，该方法在更广泛微生物过程监控中的应用值得期待。
编译者解读
本研究的关键价值在于将3D-DHM从"能看细胞"推进到"能定量脂质"的层面。相比传统GC法需数小时的前处理，DHM的准实时测量为发酵过程控制提供了可能——这对工业化微生物油脂生产意义重大。方法选择上，以光学体积作为脂质积累的代理指标，巧妙绕开了单细胞脂质直接测量的难题，且无需荧光标记，避免了染色对细胞活性的干扰。局限在于DHM无法提供脂肪酸组成信息，在需要精确调控产物构成的场景中仍需依赖色谱法。此外，光学体积与脂质含量的关联是否在更广泛的菌株和培养条件下保持稳健，尚需更多验证。总体而言，该方法有望成为合成生物学研究中脂质高产菌株高通量筛选的实用工具——单细胞分辨率也为研究群体异质性提供了独特视角。
参考来源
Carl-Philipp Briel S. Digital holographic microscopy is suitable for lipid accumulation analysis in single cells of Yarrowia lipolytica[J]. Journal of Biotechnology, 2025.
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2024.11.011
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2024.11.011